CN108752470A

CN108752470A - 一种抗鲤疱疹病毒ii型orf72的卵黄抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN108752470A
Application number: CN201810607751.8A
Authority: CN
Inventors: 宋学宏; 贡成良; 郭培红; 李坤; 孙丙耀
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Nantong Jiuying Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-13
Also published as: CN108752470B

Abstract

本发明公开了一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体及其制备方法，属于动保行业渔用生物制品技术领域。本发明以异育银鲫鳃出血病病原CyHV‑2的衣壳蛋白ORF72制作免疫抗原，接种蛋鸡后收获高免蛋，然后清洗、微包膜处理、巴氏消毒和真空冷冻干燥，制得抗CyHV‑2‑ORF72的卵黄抗体。本发明方法制备的卵黄抗体具有安全性好、抗体活性高、特异性强，易于保存，可直接口服的特点。该卵黄抗体，可靶向性的应用于预防和治疗CyHV‑2引起的异育银鲫鳃出血病，具有良好的应用前景。

Description

一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体及其制备方法，属于动保行业渔用生物制品技术领域。

背景技术

鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2)是鲤疱疹病毒属中一种具有强致病力的DNA病毒，与CyHV-2同一种属的病毒还有鲤疱疹病毒I型和III型。目前已有很多报道表明，CyHV-2是一种传播范围广、传染性强、发病快、致死率高的病毒，其主要感染鲤科鱼类，如金鱼、锦鲤、鲫鱼等其他相近鱼类的变种，该病毒可垂直传播，对鱼的各个发育阶段均有极大危害。近年来，由CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病在我国异育银鲫主要养殖区大规模爆发，死亡率达80％以上，且其感染区域在逐年扩大，已给我国异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。因此生产上亟待研究开发出一种低碳、安全、高效的新型免疫制剂，应用于异育银鲫鳃出血病的防治。

在异育银鲫鳃出血病的防治中，现阶段主要是采用灭活苗、减毒疫苗进行防治。但由于病毒的不确定性变异，注射灭活或减毒疫苗进行免疫存在很多问题，不仅存在免疫力持久性差、免疫效果不理想的问题，而且其安全性也没有保障。卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobμlin，IgY)，是鸡血清IgG转移到卵黄中形成的特异性抗体，可应用于疾病的预防与治疗，由于制备简单、成本低、化学性质稳定、特异性强、绿色安全等优点，在许多疾病的防治方面，卵黄抗体都有着广泛的应用，且临床防治效果比较明显。

CyHV-2的核衣壳呈球形或六边形，直径为100-110nm。病毒粒子为椭圆形，其直径为175-200nm，表面具有囊膜结构。CyHV-2为线性双链DNA病毒，其基因组(GenBank：kT387800)全长为290455bp，含有156个开放阅读框(ORF)。ORF72为其主要衣壳蛋白，是病毒粒子上拷贝数最多的蛋白质之一，衣壳蛋白通常是诱导宿主产生特异性中和抗体的主要抗原蛋白。但是现有的ORF72蛋白的抗体多为单克隆抗体，尽管单克隆抗体的特异性强、靶向性好，但往往因靶位点的突变而影响通过被动免疫进行预防或治疗的效果；此外，单克隆抗体不具有卵黄抗体抗酸、耐消化、抗不良环境的优势，且生产成本和价格远高于卵黄抗体，因此，单克隆抗体不适用于大规模用于水产养殖业的流行性疾病的被动免疫防治，鉴于此，本发明主要研究利用ORF72作为免疫抗原制备抗CyHV-2的特异性卵黄抗体及其制备方法。

发明内容

本发明针对由CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病，提供了一种抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体及其制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体的制备方法，用CyHV-2-ORF72重组蛋白免疫产蛋鸡，从鸡蛋中获得卵黄抗体，其中，所述CyHV-2-ORF72重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，用所述的CyHV-2-ORF72重组蛋白免疫110～120日龄的产蛋鸡；免疫量0.3～1mg/羽；初次免疫7～10天，以相同免疫量加强免疫一次；第二次免疫10～15天抽检鸡蛋中抗体滴度，当效价低于1:8000，以相同免疫量加强免疫；加强免疫2～3次后，收集效价达到1:8000以上的鸡蛋。

在本发明的一种实施方式中，所述CyHV-2-ORF72重组蛋白在免疫前，制备成CyHV-2-ORF72蛋白含量为0.5～1.5mg/mL的油包水乳剂疫苗。

在本发明的一种实施方式中，所述的油包水乳剂疫苗按照如下方法制备而成：在CyHV-2-ORF72重组蛋白中加入2～4％体积的吐温80进行预处理，按照体积份数为1:1～3的比例，将预处理后的CyHV-2-ORF72的重组蛋白加入到含有体积百分比4～8％的司班80和质量百分比1～4％硬脂酸铝的白油中，充分乳化10～30min，制成蛋白含量为0.5～1.5mg/ml的CyHV-2-ORF72重组蛋白的油包水乳剂疫苗。

在本发明的一种实施方式中，利用其蛋黄、全蛋或包括蛋壳在内的蛋液进行制备卵黄抗体。

在本发明的一种实施方式中，从鸡蛋中获得卵黄抗体还包括在鸡蛋中加入微包膜壁材，经过均质乳化和冷冻干燥对鸡蛋活性物质进行微包膜。

在本发明的一种实施方式中，所述微包膜壁材为海藻酸钠、β-环状糊精、变性淀粉、羧丙基甲基纤维素、明胶、乳清蛋白和壳聚糖中的一种或多种组合。

在本发明的一种实施方式中，所述微包膜壁材的添加量为已产生特异抗体的鸡蛋重量的2～8％。

本发明的第二个目的是提供一种所述的制备方法制备得到的抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体。

本发明的第三个目的是提供所述的卵黄抗体在鲤科鱼类养殖中的应用。

在本发明的一种实施方式中，用于制备抗鲤疱疹病毒II型药物或饲料添加剂。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所提供的一种抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体，可靶向性地应用于预防和治疗CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病，降低死亡率。本发明所提供的卵黄抗体，可部分替代化学抗病毒药物，绿色、环保、高效，有利于异育银鲫养殖业的可持续发展。

(2)本发明所提供的一种抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体及其制备方法，所制备的抗体效价高，产量大，且在常温条件下可长时间保持其抗体活性，实现了现有技术难以实现的效果。同时，本发明所述制备方法简单，成本低，可规模化生产；且充分利用了全蛋包括蛋壳中的营养成分和活性物质，所得卵黄抗体营养全面；生产全过程无废弃物产生，清洁环保。

(3)本发明所用的微包膜技术，即添加壁材、均质乳化、真空冷冻干燥所得的卵黄抗体，不仅保持了鸡蛋原有的风味，具有一定的诱食作用，还克服了传统的口服抗体存在风味不佳的缺陷；经微包膜的卵黄抗体从口腔通过胃再进入小肠，起到缓释作用，保护了抗体及鸡蛋中其他成分的活性，克服了现有技术中其他抗体必须通过特殊方式给药的局限性，口服抗体的效率显著提高。

(4)本发明所采用的微包膜壁材是食品级壁材，它们本身具有营养和促进动物免疫功能的作用。

(5)本发明采用微包膜并通过真空冷冻干燥制得的抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体，抗体蛋白包裹在膜内，水分含量只有0.5～3％。这可有效避免与空气及其它组分直接接触而引起的各种反应，从而解决了抗体及鸡蛋中自身营养及活性物质易氧化、变质和失活的缺陷，延长了保质期。

附图说明

图1为Western blot鉴定抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的特异性；

其中，A.用抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体作为一抗孵育；B.用重组CyHV-2-ORF72蛋白与抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体预结合后作为一抗孵育；C.用普通鸡蛋粉作为一抗孵育；D.用重组CyHV-2-ORF72蛋白与普通鸡蛋粉预结合后作为一抗孵育；泳道1-3分别为大肠杆菌BL21培养物、pET28a(+)转化大肠杆菌BL21培养物、pET28a(+)-ORF72转化大肠杆菌BL21-培养物；泳道M为标准分子量蛋白；KDa为千道尔顿；矩形标注为ORF 72重组蛋白。

具体实施方式

对于本发明的抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：CyHV-2-ORF72重组蛋白的制备及纯化

ORF72重组蛋白，所用CyHV-2-ORF72开放阅读框序列如SEQ ID NO.2所示。CyHV-2-ORF72重组蛋白的制备及纯化方法如下：

根据NCBI公布的CyHV-2基因组(GenBank：kT387800)所公开的ORF72的编码序列设计出特异性引物(上游(SEQ ID NO.3):5-GCTGGATCCATGTACGGCTTAAACAACGCG-3；下游(SEQID NO.4):5-ACAGAATTCAGAGGCCGTTGAATGAATGTATG-3)，扩增ORF72基因，以纯化好的DNA为模板进行PCR扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测正确后回收目的片段，经BamHI/EcoRI双酶切后组装进pET28a(+)载体中，获重组表达载体pET28a(+)-ORF72，经测序验证正确后，将重组质粒pET28a(+)-ORF72转化进大肠杆菌BL21表达菌中，37℃生化培养箱培养过夜，挑取单菌落接种到3ml LB液体培养基中，加入3μl的卡那霉素溶液(浓度为50mg/ml，Solarbio)，37℃摇床震荡培养过夜，取2.5ml菌液加入到2.5L LB液体培养基中，待其OD 600达到0.4～0.6时，加入到50L发酵罐中诱导培养(含25L LB液体培养基)，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Solarbio)至终浓度1.0mol/L，27℃搅拌诱导培养8h，收菌液，12000r/min离心10min，收菌体沉淀，并用PBS(pH 7.4)洗涤2次，去掉细菌表面培养基。然后SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。用PBS将已诱导表达CyHV-2-ORF72重组蛋白的BL21菌体重悬，用高压细胞破碎仪将细胞破碎两遍(北京迪索仪器有限公司，破碎压力800bar，温度4℃)，收集高压破碎后的液体，4℃条件下18000r/min离心20min，得沉淀。将沉淀重悬于含10mmol/LNaH₂PO4(国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR)、10mmol/L Tris-HCl(Tris，Solarbio，HCl，分析纯AR)和8mol/L尿素(生工，分析纯AR)的变性裂解液中，室温放置60min，充分溶解变性。在4℃条件下18000r/min离心15min，收集上清液。使用蛋白质高压制备色谱仪(SPOT，法国)进行纯化。最后用超滤系统(Millipore Labscale，美国)将蛋白进行脱盐处理，得到纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白。

实施例2：制备CyHV-2-ORF72免疫疫苗

(1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时)，加入10ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)和20g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清透明。

(2)CyHV-2-ORF72重组蛋白预处理：实施例1纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白中加入4％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)，混合均匀。

(3)CyHV-2-ORF72疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的CyHV-2-ORF72重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:1，疫苗蛋白浓度为1.5mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，7000r/min，15min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

实施例3：制备CyHV-2-ORF72免疫疫苗

(1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时)，加入20ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)和10g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清透明。

(2)CyHV-2-ORF72重组蛋白预处理：实施例1纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白中加入3％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)，混合均匀。

(3)CyHV-2-ORF72疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的CyHV-2-ORF72重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:2，疫苗蛋白浓度为1.0mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，7000r/min，10min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

实施例4：制备CyHV-2-ORF72免疫疫苗

(1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时)，加入30ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)和10g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清透明。

(2)CyHV-2-ORF72重组蛋白预处理：实施例1纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白中加入2％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，混合均匀。

(3)CyHV-2-ORF72疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的CyHV-2-ORF72重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:3，疫苗蛋白浓度为0.5mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，7000r/min，20min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

实施例5：免疫产蛋鸡

选择生物安全隔离条件好、饲养管理科学规范、鸡群健康的鸡场200羽具有高免疫应答能力的刚刚产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋鸡(海兰蛋鸡，120日龄)作为试验鸡群，饲养管理按照海兰蛋鸡产蛋期饲养管理要求进行。用实施例2、实施例3和实施例4记载的方法配置的CyHV-2-ORF72疫苗免疫蛋鸡，剂量为0.6ml/羽，分两胸肌部位两针进行免疫。一周以后以同样剂量和方法免疫第二次。第二次接种后从第10天开始抽检鸡蛋中抗体滴度。此后，当抗体滴度低于1:8000时按同样剂量及方法加强免疫。

实施例6：制备抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体

(1)收集抗体滴度达到1:8000以上的鸡蛋，将新鲜的高免鸡蛋放在洗蛋机上，用常温自来水清洗2min。

(2)用50mg/L浓度的二氧化氯水溶液浸泡洗净的鸡蛋2min；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除残留的消毒液。

(3)将消毒洗净后的鸡蛋打碎，存于洁净的不锈钢容器内初步搅拌，称重待用。

(4)称取蛋液重量1％的海藻酸钠、2％β-环状糊精及3％的羧丙基甲基纤维素，加入蛋液重量6％的温度40℃的自来水中，加热搅拌至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅拌。

(5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化10min。

(6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，60℃消毒30min。

(7)将消毒后的物料倒入冷冻托盘中，物料厚度0.5cm，放入0℃冷库预冷2h。

(8)将预冷后的物料放入真空冷冻干燥机，设置真空度20Pa，干燥48h，即得到所述抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体。

实施例7：制备抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体

(1)收集抗体滴度达到1:8000以上的鸡蛋，将新鲜的高免鸡蛋放在洗蛋机上，用常温自来水清洗1min。

(2)用100mg/L浓度的二氧化氯水溶液浸泡洗净的鸡蛋1min；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除残留的消毒液。

(4)称取蛋液重量2％变性淀粉、4％明胶及2％的羧丙基甲基纤维素，加入蛋液重量8％的温度50℃的自来水中，加热搅拌至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅拌。

(5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化15min。

(6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，65℃消毒20min。

(7)将消毒后的物料倒入冷冻托盘中，物料厚度1.0cm，放入0℃冷库预冷3h。

(8)将预冷后的物料放入真空冷冻干燥机，设置真空度40Pa，干燥36h，即得到所述抗鲤疱疹病毒II型ORF72卵黄抗体。

实施例8：制备抗CyHV-2-ORF72的卵黄抗体

(1)收集抗体滴度达到1:8000以上的鸡蛋，剔除已变质的坏蛋，将新鲜的高免鸡蛋放在洗蛋机上，用常温自来水清洗2min。

(2)用150mg/L浓度的二氧化氯水溶液浸泡洗净的鸡蛋1min；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除残留的消毒液。

(4)称取蛋液重量1％壳聚糖、5％β-环状糊精及2％的羧丙基甲基纤维素，加入蛋液重量10％的温度60℃的自来水中，加热搅拌至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅拌。

(5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化20min。

(6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，60℃消毒25min。

(7)将消毒后的物料倒入冷冻托盘中，物料厚度1.5cm，放入0℃冷库预冷4h。

(8)将预冷后的物料放入真空冷冻干燥机，设置真空度60Pa，干燥24h，即得到所述抗鲤疱疹病毒II型ORF72卵黄抗体。

实施例9：CyHV-2-ORF72卵黄抗体效价检测(间接ELISA法)

以纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白(实施例2～4中步骤(2)所述预处理得到的包含吐温80的纯化重组蛋白)为抗原，以无特异性IgY的普通蛋粉(同一养鸡场同期所产普通鸡蛋，制备方法同实施例6～8所得)为阴性对照，用间接ELISA法测定所制备的CyHV-2-ORF72卵黄抗体的效价。具体方法：将纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白用包被液稀释至3μg/ml，按100μl/孔加到酶标反应板内(空白对照只添加包被液)，4℃包被过夜。将包被好的酶标板甩去孔内液体，加TBS洗涤液300μl/孔，重复洗涤2次，并在吸水纸上拍干。加入含体积百分比5％小牛血清的TBS，300μl/孔，37℃温育1.5h。TBS重复洗涤2次，拍干，加入实施例3得到的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体(用PBS将卵黄抗体按1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000比例稀释)，100μl/孔，37℃温育2h。用T-TBS洗板5次，拍干后用TBS洗涤2次，拍干。加入羊抗鸡辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体100μl/孔(购自Sigma公司)，37℃温育1.5h。用T-TBS洗板5次，拍干后用TBS洗涤2次，拍干。每孔加入邻苯二胺显色底物(OPD，购自北京百灵威科技有限公司)100μl，避光反应3～5min(根据阳性对照进行判定)，加入2M H₂SO₄终止液100μl。用酶标仪(美国，Bio-Tek)测定490nm处样品OD值。挑取三个批次的样品(编号：样品1～3)，每个样品2个平行，取三个样品的平均值。判定标准：p/N＞2.1，即OD值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为其效价。结果见表1，阴性对照稀释倍数在1:40以下时的OD值为空白对照的2.1倍以上，抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的稀释倍数为1:8000以下时的OD值是阴性对照的2.1倍以上。说明抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体可以与纯化的CyHV-2-ORF72重组蛋白特异性结合，其抗体效价为1:8000，而普通蛋粉抗体效价极低，进一步显示了抗CyHV-2-ORF72抗体的特异性和高效性。因此，通过本方法制备的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体有很高的抗体活性。

表1抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的效价测定结果

实施例10：抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体特异性评估

采用Western blotting方法，使用本发明所提供的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体为一抗，进行CyHV-2-ORF72重组蛋白的识别检测，评估抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的特异性。具体方法：首先分别将大肠杆菌BL21培养物、pET28a(+)BL21-培养物、pET28a(+)-ORF72转化大肠杆菌BL21-培养物分别加入等体积2×SDS上样缓冲液，沸水煮15min，每孔上样30μl，进行SDS-PAGE凝胶电泳，待溴酚蓝迁移至凝胶下端1cm左右时停止电泳，剥离凝胶。然后按以下步骤操作：(1)根据凝胶大小，裁剪NC膜及滤纸，置于转膜缓冲液中浸泡5min。(2)将凝胶用ddH₂O冲洗数秒后，放入转膜缓冲液中。(3)在电极板上放上海绵垫，从阴极到阳极依次叠放滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，同时用玻璃棒赶尽各层之间的气泡。(4)安装转移装置，接通电源，110mA，冰水浴中转移约4h。(5)取下NC膜，观察转膜效率，PBST洗涤3次。(6)封闭：将膜放入2％Casein封闭液(干酪素，BBI，CAS：9000-71-9)中，4℃封闭2h。(7)洗涤：取出NC膜，用PBST洗涤2次，每次3min。(8)孵一抗过夜(4℃轻摇)：称取10mg抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体溶于5mlpBS中，作为原液，原液稀释500倍作为一抗孵育NC膜，另用过量的CyHV-2-ORF72重组蛋白预结合后的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体液孵育NC膜；(9)洗涤：取出NC膜，分别用PBST漂洗2次，每次3min。(10)孵二抗：用PBS稀释兔抗鸡辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(1:500，购自Sigma公司)，放入NC膜，室温平缓摇动孵育1h。(11)洗涤：PBST洗膜2次，每次3min。(12)显色：将洗涤后的NC膜在滤纸上吸干表面多余液体，放入DAB显色液(购自上海碧云天生物技术有限公司)中。待出现褐色条带，且条带颜色不再加深时立即取出膜，用清水漂洗。用滤纸吸干膜上残留水分，扫描记录，分析抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的特异性。结果见图1，图1显示，以CyHV-2-ORF72重组蛋白为抗原而制备的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体蛋白液作为一抗时，在～43kDa处出现特异性的条带(图A矩形标注)，即为CyHV-2-ORF72重组蛋白，这与预测的CyHV-2-ORF72的大小一致；而用过量的CyHV-2-ORF72重组蛋白预结合卵黄抗体后再孵育抗原，特异性条带消失(图B，抗体被过量的CyHV-2-ORF72重组蛋白中和)，证明了卵黄抗体的特异性很强。用未免疫的鸡蛋制作的普通蛋粉作为一抗(图C)以及用重组CyHV-2-ORF72蛋白与普通鸡蛋粉预结合后作为一抗孵育(图D)时均未在～43kDa处出现特异性条带，进一步证明了本发明所制备的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体的特异性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Tyr Gly Leu Asn Asn Ala Gln Gly Phe Ile Asp Thr Glu Trp Ile

1 5 10 15

Asp Arg Gln Ser Ile Ala Met Thr Ala Gln Glu Thr Ser Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Pro Tyr Leu Ala Thr Lys Gly Gln Arg Val Asp Pro Ser Asn Leu

35 40 45

Tyr Ile Pro Asp Gly Ile Phe Val Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Pro Asp

50 55 60

Pro Gly Val Ala His Gly Gly Gly Tyr Tyr Tyr Arg Pro Ser Leu Gln

65 70 75 80

Gly Phe Gly Ser Met Met Asp Glu Ala Asp Thr Leu Asp Asp Leu Gln

85 90 95

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Asn Gln Gly Gln Trp Thr Arg Leu Ala Leu

100 105 110

Cys Gly Leu Ala Asn Thr Ala Asn Tyr Pro Ile Asp Leu Tyr Asp Gln

115 120 125

Lys Asp Thr Lys Tyr Arg Ile Ile Asn Thr Gly Ala Glu Pro Leu His

130 135 140

Ser Gly Asp Ala Phe Val Val Glu Pro Pro Ser Val Glu Ala Ser Lys

145 150 155 160

Ala Gln Val Asp Ser Met Lys Asn Asn Thr Ile Arg Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Phe Arg Pro Asp Asn Met Ala Leu Gly Gly Tyr Pro Ala Thr Asn Arg

180 185 190

Val Pro Ser Glu Leu Thr His Arg Met Lys His Val Met Ala Arg Asp

195 200 205

Ile Gly Met Cys Val Asp Leu Val Gln Ser Gly Ser Ser Gly Met Ser

210 215 220

Gln Gly Ile Ser Arg Leu Tyr Asn Thr Gln Thr Glu Leu Gly Gln Ser

225 230 235 240

Val Lys Asn Thr Val Met Ala Thr Thr Leu Asp Ala Leu Asp Ser Ile

245 250 255

Ser Val Leu Leu Val Met Met Lys Arg Val Ala Ser Leu Pro Thr Pro

260 265 270

Val Leu Arg Ile Phe Gly Asp Tyr Tyr Asn Phe Lys His Asn Lys Gly

275 280 285

Gln Leu Asp Pro Ser Val Leu Ile Glu Ile Trp Lys Asn Pro Ala Val

290 295 300

Ala Asp Leu Phe Met Asp Ser Met Asp Phe Gly Met Lys Ser Ile His

305 310 315 320

Arg Leu Lys Asn Gly Thr Tyr Gly Ser Ala Ile Lys Ser Thr Glu Ala

325 330 335

Asn Pro Thr Ser Met Arg Gly Glu Val Met Tyr Asn Ala Tyr Gly Gly

340 345 350

Gln Tyr Leu Thr Gly Asp Thr Phe Glu Gly Ile Ile His Ser Phe Asn

355 360 365

Gly Leu

370

<210> 2

<211> 1123

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ggatccatgt acggcttaaa caacgcgcaa ggattcatcg ataccgaatg gatcgacagg 60

cagagtatcg ccatgaccgc ccaggagacc agcagactgt tgaacccgta ccttgccacc 120

aagggacagc gggtcgatcc gtctaacttg tacattcccg acggtatctt tgtgacttac 180

acgcctactg gaccagaccc cggagtggcg cacggtggcg gttactatta cagaccttcg 240

ctgcagggtt tcggctctat gatggacgag gcggatacgt tggacgatct gcaggccaac 300

gttctgtata gcaatcaggg tcagtggacg agactggcgt tgtgcggtct ggccaacacg 360

gccaactacc ccatcgatct gtacgaccag aaggacacca agtacagaat catcaacacc 420

ggggccgagc ctctgcactc tggcgacgcg tttgtggttg aaccgccatc ggtggaggct 480

tcaaaggcgc aggtggacag catgaaaaac aacaccatca gagccgaggg ttccttcaga 540

ccggataaca tggctctggg aggctacccg gccaccaaca gagtaccctc tgaactgacg 600

caccgcatga aacacgttat ggcccgagac attggcatgt gcgtcgacct agtacagtct 660

ggtagcagcg gcatgtctca gggtatctcg cggctgtaca atacacagac cgagctcgga 720

cagagcgtca agaacactgt gatggcaacc accctcgacg ctttggacag catcagcgtc 780

ctcttggtca tgatgaaaag ggtagcctct ctacccaccc cggtcctccg tatctttggg 840

gactattaca atttcaaaca caacaagggc caattggacc catccgtcct gatcgagatc 900

tggaaaaacc cagccgtcgc cgatctcttt atggactcta tggactttgg catgaaatcc 960

atccaccgac tcaaaaacgg tacctacggc tctgccatca aatccacaga agccaacccc 1020

acatcgatga gaggagaagt catgtacaac gcttacggcg gtcaatacct cacaggggac 1080

accttcgagg gcatcataca ttcattcaac ggcctctgaa ttc 1123

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gctggatcca tgtacggctt aaacaacgcg 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

acagaattca gaggccgttg aatgaatgta tg 32

Claims

1.一种抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，用CyHV-2-ORF72重组蛋白免疫产蛋鸡，从鸡蛋中获得卵黄抗体，其中，所述CyHV-2-ORF72重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，用所述的CyHV-2-ORF72重组蛋白免疫110～120日龄的产蛋鸡；免疫量0.3～1mg/羽；初次免疫7～10天，以相同免疫量加强免疫一次；第二次免疫10～15天抽检鸡蛋中抗体滴度，当效价低于1:8000，以相同免疫量加强免疫；加强免疫2～3次后，收集效价达到1:8000以上的鸡蛋。

3.根据权利要求1或2任一所述的制备方法，其特征在于，所述CyHV-2-ORF72重组蛋白在免疫前，制备成CyHV-2-ORF72蛋白含量为0.5～1.5mg/mL的油包水乳剂疫苗。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的油包水乳剂疫苗按照如下方法制备而成：在CyHV-2-ORF72重组蛋白中加入2～4％体积的吐温80进行预处理，按照体积份数为1:1～3的比例，将预处理后的CyHV-2-ORF72的重组蛋白加入到含有体积百分比4～8％的司班80和质量百分比1～4％硬脂酸铝的白油中，充分乳化10～30min，制成蛋白含量为0.5～1.5mg/ml的CyHV-2-ORF72重组蛋白的油包水乳剂疫苗。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，从鸡蛋中获得卵黄抗体还包括在鸡蛋中加入微包膜壁材，经过均质乳化和冷冻干燥对鸡蛋活性物质进行微包膜。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微包膜壁材为海藻酸钠、β-环状糊精、变性淀粉、羧丙基甲基纤维素、明胶、乳清蛋白和壳聚糖中的一种或多种组合。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微包膜壁材的添加量为鸡蛋重量的2～8％。

8.一种如权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到的抗鲤疱疹病毒II型ORF72的卵黄抗体。

9.权利要求8所述的卵黄抗体在鲤科鱼类养殖中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于制备抗鲤疱疹病毒II型药物或饲料添加剂。