CN101845083B - 猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗及其制备方法，具体涉及用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及它们的制备方法。所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。由该多肽制成的疫苗可以有效应对猪繁殖与呼吸综合症病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及其制备方法，具体涉及一种用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)引起的急性高度接触性传染病。
PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，根据病毒的抗原性、基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(ATCC2VR2332株为代表株)，两种毒株间氨基酸的同源性为78％～81％。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径约45-65nm，含有20-35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕一脂质双层膜，表面有纤突。已经证实，PRRSV有6种结构蛋白，它们是核衣壳蛋白(N)、非糖基化膜蛋白(M)和4种糖基化膜蛋白(GP2、GP3、GP4和GP5)。
目前对PRRSV的各结构蛋白免疫原性的研究已经比较清楚。该病毒感染猪体后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是针对GP3、GP4、GP5和M蛋白，这些蛋白由于可产生中和抗体而成为亚单位疫苗及其它新型疫苗研究的主要候选抗原。此外，血清中针对N蛋白产生的抗体水平虽然很高，但是N蛋白却因不具有中和活性而不能提供免疫保护。
GP4具有诱导中和抗体的活性，其中和表位区位于暴露于胞外亲水区的aa40-79，其中aa59-67组成的基元构成了此中和表位区的核心。Oleksiewicz等应用噬菌体展示技术进行该蛋白的抗原表位定位，筛选到一个强抗原性的表位aa48-76，随后试验证明该表位在各分离株间保守存在。这是个矛盾的结论。因此，GP4上的这个表位是否保守还有待进一步确证。美洲型PRRSV的GP5上有个线性表位，位于aa27-30，为非中和性表位；aa37-45是糖基化的中和表位；aa170-201是非中和性表位，但是有研究表明其C端(aa180-197)存在优势表位，缺失C端50个氨基酸的表达蛋白与感染猪血清的反应性消失相关，说明C端有很强的抗原性及在维持GP5结构上有很强的作用。也有人认为GP5上存在2个中和表位，一个为线性表位，一个为构象表位。付利芝的博士论文《PPRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应》以PPRSV BJ-4的GP5(aa29-60)和GP4(aa33-70)抗原表位为基础，构建成多表位串联基因，得到纯化的融合蛋白，免疫小鼠得到比较高的抗体效价。这两个肽段是靠柔性氨基酸PCG和GGGGG来连接的。江云波等在GP5的覆盖表位和中和表位之间插入一个通用的辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)，免疫小鼠，取得比较高的抗体水平。以上研究资料表明，GP4和GP5蛋白是PRRSV病毒的重要中和抗原，可以刺激机体产生中和抗体和细胞免疫。因此，本发明选定GP4和GP5蛋白为主要研究蛋白。
疫苗接种是预防猪繁殖与呼吸综合症最有效的方法，国内外已有商品化的猪繁殖与呼吸综合症疫苗，既有灭活疫苗，也有用弱毒株制备的弱毒活疫苗。PRRS灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险，便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点，因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。国内分离的PRRSV CH-1a灭活疫苗是经Marc-145细胞系传代、多次克隆纯化，筛选出嗜Marc-145细胞生长的毒株。该毒株的细胞培养液经化学试剂灭活后，配以医用油佐剂，制成了繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(郭宝清等，2000)，已成为国内首批商品化的PRRS疫苗，并对3月龄仔猪间隔20天进行了2次免疫，结果在首次免疫后5天就可检测到病毒特异性抗体，28天达到高峰，在首免后的56天还可检测到抗体。当猪场受到威胁或刚刚发生PRRS时，可采用该疫苗紧急预防接种，实践证明采取这种措施可有效阻止PRRSV的侵袭和缩短PRRS的病程，从而有效降低因PRRS造成的损失。经繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫的母猪可通过初乳给新生仔猪提供被动免疫，保护仔猪在哺乳期间免受PRRS的侵袭。虽然灭活疫苗使用后不存在安全性的问题，但是该灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生期较长的缺点，不太适合仔猪免疫。而仔猪和架子猪带毒是猪场PRRSV持续存在的最重要原因，因此通过灭活疫苗难以控制和根除PRRSV在猪场的存在和流行，因此仅依靠灭活苗免疫给猪体建立牢固的免疫力是不够的。
PRRS弱毒疫苗具有免疫力强、免疫期长等优点。美国BoehringerIngelheim公司的NOBL实验室于1995年首次推出商品化弱毒疫苗RespPRRSVTM，已获准用于3～18周龄仔猪的预防接种。但禁用于PRRS阴性猪群、妊娠母猪和育龄公猪。弱毒疫苗使用后可产生一定的保护作用(Sipos等，2003)。PRRS阳性猪场在接种弱毒疫苗后能够减少仔猪的呼吸道症状，有效降低仔猪的死亡率、提高母猪的繁殖力。建议PRRS阴性猪场一般不要使用弱毒疫苗。若猪群确实已受到PRRS强毒威胁的猪场，后备母猪最好进行2次免疫，以确保母猪在配种前抗体转阳。何信群等(2003)制备了PRRSV弱毒疫苗并进行了猪体试验，结果发现，免疫后20～35天左右出现抗体高峰，并可持续3个月以上，有较长的免疫保护期，免疫后第14天即可检测出PRRSV中和抗体。Mavromatis等(1999)证实弱毒疫苗可保护育肥猪抵抗PRRSV引起的呼吸道症状。但是弱毒疫苗的不安全性，尤其毒力返强的可能性成为人们关心的一个主要问题。弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒，使得病毒在猪场中循环存在，有时甚至引发PRRS的暴发。实验证明，PRRSV感染诱导B细胞的增生的同时，也导致这些猪免疫损伤。
近年来，随着分子生物学的发展，人们对PPRSV本身以及病毒与动物的免疫应答机制的研究越来越深入，各种新型疫苗如基因工程疫苗、亚单位疫苗等也相继问世。
由于高致病性PPRS的广泛快速流行，所以必须加大对其疫苗研制的力度，从根本上控制疾病的流行和发生。传统的CH-1a株灭活疫苗对变异株的高致病性毒株没有起到保护效果，针对高致病性PPRS的弱毒和灭活疫苗都正在研发中，常规疫苗如灭活疫苗和弱毒疫苗的有效性在控制疾病流行时的作用是公认的，并且在控制急性疾病的传播上有一定的作用。从长远的控制和根除疾病，两者都存在一定的缺点和不足，如毒力返强、散毒、动物免疫的应激反应、多次免疫、免疫保护期短等。
因此，提供一种能够克服高致病性PRRS灭活疫苗和弱毒疫苗的缺陷，并可同时启动机体的细胞免疫和体液免疫的疫苗，已成为目前PRRS疫苗的研究热点。
化学合成多肽疫苗(synthetic peptide vaccine)就是采用化学合成抗原表位氨基酸序列的方法来制备保护性作用的类似于天然抗原决定簇的多肽疫苗。这种疫苗不含核酸，是最为理想的安全性疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病疫苗的主要方向之一。研制猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的关键之处是在病毒粒子蛋白上找到可同时启动机体的细胞免疫和体液免疫的抗原决定簇。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种上述多肽以及上述疫苗的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
一种猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗，其中包括一种或多种上述的多肽。上述疫苗还可以包含佐剂。
本发明还提供了上述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)去保护反应：在15％-30％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用1.5％-4％(重量/体积)的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
上述多肽的制备方法中，所述裂解试剂的组分体积比具体为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。
本发明还提供了上述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将多肽稀释至200μg/ml制得抗原水相；
(2)在20-28℃条件下，按照抗原水相∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入抗原水相，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。
在上述疫苗的制备方法中，高速搅拌优选为8000-10000转/分钟。
本发明进一步提供了上述多肽或疫苗在制备治疗和/或预防猪繁殖与呼吸综合症的药物中的用途。
综上所述，本发明通过对国内猪繁殖与呼吸综合症流行毒株的序列测定，研究猪繁殖与呼吸综合症主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行猪繁殖与呼吸综合症抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受猪繁殖与呼吸综合症流行毒株的攻击的多肽抗原，并基于此研制出一种效力好、安全性高、生产工艺稳定且成本低的抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的合成肽疫苗。对这些多肽进行的疫苗安全性和效力试验结果表明，本发明提供的疫苗可以有效应对猪繁殖与呼吸综合症病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：合成肽疫苗多肽抗原的固相合成
本发明的多肽抗原可以通过ABI 433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
(1)合成原料的准备
合成用于多肽疫苗的多肽抗原，它们的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
依据上述多肽抗原序列以及1mmol的合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的Cartridge(装氨基酸的小瓶)中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成的肽的名称，批号，反应腔的皮重以及所称取树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到对应的试剂瓶中。
(2)合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu-Module Test-按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)-按Start-按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。
(3)合成肽疫苗多肽抗原的制备
1)去保护反应：在20％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中在22℃条件下反应30分钟，脱除树脂氨基上的Fmoc保护基团，氮气吹干，NMP洗涤树脂；
2)氨基酸的活化：将合成用的带有Fmoc的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑(HOBT)反应合成氨基酸-HOBT酯；
3)缩合反应：启动多肽合成仪自动合成程序，使用合成仪自动将上述氨基酸、树脂和二异丙基碳二亚胺加至反应器中，在22℃条件下反应2小时，氮气吹干，NMP洗涤树脂；
4)乙酰化反应：使用2.5％(重量/体积)的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在22℃条件下反应30分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复上述1)～4)，反应完成后，用NMP清洗，除去残余的氨基酸，得到干燥的多肽树脂；
6)多肽与树脂的分离：将干燥的多肽-树脂放入玻璃容器内，将配制好的裂解试剂(体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1)加入容器内，匀速搅拌3小时，将玻璃容器置于0℃下反应10分钟，取出恢复至室温，挥去三氟乙酸(TFA)，将叔丁基甲醚及二乙醚加到多肽溶液中，搅拌洗涤，过滤分离出多肽溶液；
7)超滤纯化多肽抗原后进行无菌处理：使用膜包在22℃条件下超滤多肽抗原，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
实施例2：合成肽疫苗的制备
用注射用水将实施例1所制备出的多肽溶液分别稀释到200μg/ml，作为水相；将SEPPIC MONTANIDE ISA 50V油佐剂经121℃，30分钟灭菌，备用作为油相。在22℃条件下，按照抗原水相与灭菌的50V油佐剂为1∶1的体积比，先将油相加入乳化罐内，100转/分钟慢速搅拌2分钟，缓慢加入水相，加完后搅拌30分钟，再高速9000转/分钟搅拌20分钟，然后静置5分钟，分装后即得抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的合成肽疫苗，即SEQID NO.1多肽疫苗、SEQ ID NO.2多肽疫苗、SEQ ID NO.3多肽疫苗、SEQID 4多肽疫苗。
实施例3：合成肽疫苗的效力试验
(1)疫苗与试验动物
四批PRRS合成肽疫苗加上灭活疫苗(购自中牧股份成都生物药厂)和佐剂(50V油)一共设为六组，其中灭活疫苗作为阳性对照，佐剂作为阴性对照，试验动物为40日龄经检测PRRSV抗原、抗体为阴性的健康猪60头，具体分组情况见表1。
表1 疫苗分组情况
| 分组 | 注射疫苗 | 试验动物数(头) | 免疫剂量(ml/头) |
| A组 | 灭活疫苗 | 10 | 2 |
| B组 | SEQ ID NO.1多肽疫苗 | 10 | 2 |
| C组 | SEQ ID NO.2多肽疫苗 | 10 | 2 |
| D组 | SEQ ID NO.3多肽疫苗 | 10 | 2 |
| E组 | SEQ ID NO.4多肽疫苗 | 10 | 2 |
| F组 | 佐剂 | 10 | 2 |
(2)血清抗体检测
上述六组免疫试验动物后28天采集猪血清，用细胞中和试验检测PRRSV抗体效价。
(3)血清抗体检测结果
A、B、C、D及E组免疫后28天，即攻毒之前，各免疫组对PRRSV超强变异株(PRRSV NVDC-JXA1，中牧股份成都生物药厂)的中和抗体效价均达到16以上；F组血清抗体为阴性。
(4)攻毒试验
免疫后28天，用PRRSV NVDC-JXA1强毒攻击。将病毒含量为1×105.9TCID50/ml的病毒培养液按1∶10稀释，以3ml/头的剂量经颈部肌肉接种至试验动物。继续饲养观察21天，记录各组动物的反应，包括体温、临床症状、定期血清检测和剖检大体病理变化。
(5)攻毒试验结果
对照组(F组)攻毒后10头猪全部发病，死亡5头。病猪表现为：临床出现体温升高，皮肤出血点、斑、发绀，眼结膜炎，俯跪卧姿，后躯晃动，瘫痪等神经症状；大体解剖见肺从心叶近心端开始的灶性出血、淤血、实变，脾梗死，淋巴结，肾出血点灶，脑膜充血等；组织病理学见肺间质性肺炎，非化脓性脑炎，淋巴系统退行性变。
A、B、C、D及E组，所有猪均未出现不良反应或发病，试验结果见表2，表明抗PRRSV的合成肽疫苗对于感染猪具有良好的保护效果，具有潜在的应用价值。
表2 疫苗免疫试验结果
| 分组 | 注射疫苗 | 动物数(头) | 发病数 | 死亡数 | 保护率(％) |
| A组 | 灭活疫苗 | 10 | 0 | 0 | 100 |
| B组 | SEQ ID NO.1多肽疫苗 | 10 | 2 | 0 | 80 |
| C组 | SEQ ID NO.2多肽疫苗 | 10 | 3 | 0 | 70 |
| D组 | SEQ ID NO.3多肽疫苗 | 10 | 2 | 0 | 80 |
| E组 | SEQ ID NO.4多肽疫苗 | 10 | 0 | 0 | 100 |
| F组 | 佐剂 | 10 | 10 | 5 | 0 |
实施例4：合成肽疫苗的安全试验
(1)疫苗与试验动物
四批PRRS合成肽疫苗加上灭活疫苗一共设为五组，其中灭活疫苗作为阳性对照，试验动物为3-4周龄经检测PRRSV抗原、抗体为阴性的健康猪75头，具体分组情况见表3。
表3 疫苗分组情况
| 分组 | 注射疫苗 | 试验动物数(头) |
| A组 | 灭活疫苗 | 15 |
| B组 | SEQ ID NO.1多肽疫苗 | 15 |
| C组 | SEQ ID NO.2多肽疫苗 | 15 |
| D组 | SEQ ID NO.3多肽疫苗 | 15 |
| E组 | SEQ ID NO.4多肽疫苗 | 15 |
(2)疫苗对最小日龄使用动物一次单剂量接种
上述五组疫苗分别免疫3周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml；注射后继续饲养观察21天，观察免疫后动物的反应，并对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(3)疫苗对试验动物单剂量重复接种
上述五组疫苗分别免疫3-4周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗2ml，在第一次免疫后3周，进行二免，每头再次颈部肌肉注射疫苗2ml，注射后继续饲养观察3周，观察注射后动物的反应，并对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(4)疫苗对试验动物一次超剂量接种
上述五组疫苗分别免疫3-4周龄健康猪各5头，每头颈部肌肉注射疫苗4ml；注射后继续饲养观察21天，观察免疫后动物的反应，并对部分猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。
(5)试验结果
A、B、C、D、E组的猪均未出现局部和全身不良反应，注苗后动物的精神状态及食欲良好。对部分猪进行解剖表明，疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状、疫苗完全吸收，结果如表4所示。从表4中可以看出，四批合成肽疫苗与市场上的灭活疫苗一样，在单剂量、超剂量、多次接种情况下对猪安全。
表4 安全性试验结果
| 分组 | 注射疫苗 | 不良反应 | 剖检变化 |
| A组 | 灭活疫苗 | 无 | 未见病变，疫苗吸收完全 |
| B组 | SEQ ID NO.1多肽疫苗 | 无 | 未见病变，疫苗吸收完全 |
| C组 | SEQ ID NO.2多肽疫苗 | 无 | 未见病变，疫苗吸收完全 |
| D组 | SEQ ID NO.3多肽疫苗 | 无 | 未见病变，疫苗吸收完全 |
| E组 | SEQ ID NO.4多肽疫苗 | 无 | 未见病变，疫苗吸收完全 |
序列表
<110>中牧实业股份有限公司
<120>猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗及其制备方法
<130>DIC09110043
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>58
<212>PRT
<213>PRRSV抗原
<400>1
Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly
1 5 10 15
Ile Leu Phe Lys Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ser Asp Phe
20 25 30
Val Val Leu Gln Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Gly Asp Ser Ser Ser
35 40 45
Pro Thr Ile Arg Lys Ile Ser Gln Cys Arg
50 55
<210>2
<211>47
<212>PRT
<213>PRRSV抗原
<400>2
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Ile Leu Phe Lys Ala Ser Asn Asn Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile
20 25 30
Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala
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<210>3
<211>58
<212>PRT
<213>PRRSV抗原
<400>3
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1 5 10 15
Ile Leu Phe Lys Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ser Asp Phe
20 25 30
Val Val Leu Gln Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Gly Asp Ser Ser Ser
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Pro Thr Ile Arg Lys Ile Ser Gln Cys Arg
50 55
<210>4
<211>47
<212>PRT
<213>PRRSV抗原
<400>4
Ile Ser Ile Ser Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys His Ile Glu Gly
1 5 10 15
Ile Leu Phe Lys Ala Ser Asn Asn Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile
20 25 30
Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala
35 40 45
Claims (8)
1.一种用于猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.一种猪繁殖与呼吸综合症合成肽疫苗，其中包括权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
4.一种权利要求1所述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)去保护反应：在体积比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将步骤(2)获得的各种氨基酸和步骤(1)中获得的树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用重量体积比为1.5％-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1；匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
5.一种权利要求2或3所述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将多肽稀释至200μg/ml制得抗原水相；
(2)在20-28℃条件下，按照抗原水相∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入抗原水相，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。
6.根据权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。
7.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗和/或预防猪繁殖与呼吸综合症的药物中的用途。
8.根据权利要求2或3所述的疫苗在制备治疗和/或预防猪繁殖与呼吸综合症的药物中的用途。
Priority Applications (1)
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