CN110894214B

CN110894214B - 口蹄疫o型抗原表位多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110894214B
Application number: CN201911153282.8A
Authority: CN
Inventors: 肖进; 吴冬荀; 毕建敏; 郭丽清; 张蕾; 蔡薇; 向王震
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN110894214A

Abstract

本发明提供一种用于制备口蹄疫O型抗原表位多肽及其制备方法和应用。口蹄疫O型合成肽疫苗包括抗原多肽，为序列2所示的多肽。本发明提供的口蹄疫合成肽疫苗具有良好的免疫效力，且疫苗的抗原为化学合成多肽，不含口蹄疫病毒核酸粒子，安全性高。因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫流行毒株、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。

Description

口蹄疫O型抗原表位多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种口蹄疫合成肽疫苗，以及其制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot and mouth disease，简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高，传播迅速，感染猪、猪、羊等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前，口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒：A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和Asia I(亚洲I型)。这些主型中的每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和Asia I型的口蹄疫病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。

口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。

当前在我国猪群中流行的口蹄疫主要是O型和A型口蹄疫。我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见，在口蹄疫防治方面，非常有必要开发新型口蹄疫疫苗。

在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、经济性方面存在着问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备口蹄疫O型合成肽疫苗的抗原多肽及疫苗。

为实现上述目的，本发明提供用于制备口蹄疫O型合成肽疫苗的抗原多肽,为序列表中序列2所示的多肽。

本发明还提供口蹄疫O型合成肽疫苗，其活性成分为权利要求1序列2所示的抗原多肽。

所述口蹄疫O型合成肽疫苗还包括药学上可接受的佐剂。

用于制备口蹄疫O型合成肽疫苗的抗原多肽在制备口蹄疫O型合成肽疫苗或制备用于预防O型口蹄疫的生物制品中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述口蹄疫为猪O型口蹄疫。

上述多肽采用固相法合成，与ISA50V佐剂混合制成油乳剂疫苗。通过效力试验证明，口蹄疫O型合成肽疫苗针对MYA/98强毒攻击的PD₅₀值均超过6，达到国家标准的要求，具有保护试验动物猪免受病毒攻击的能力。安全性试验证明口蹄疫合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及猪无副反应出现，安全性高，无散毒危险，所以具有良好的推广前景和市场价值。

合成肽疫苗极大的提高了口蹄疫疫苗的安全性和产品稳定性，并且其制备工艺更简单、生产成本更低廉、疫苗质量更加可靠，利于规模化生产。作为一种新型口蹄疫疫苗，其优点可以为企业和市场带来新的竞争力和经济增长点，市场空间巨大。

本发明提供了所述的口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)用注射用水将所述多肽稀释为10-100μg/ml(优选50μg/ml)的浓度，从而得到多肽抗原水相；

(2)将佐剂灭菌(在121℃条件下灭菌30分钟)；

(3)在25～27℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在120～140rpm下搅拌2～3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20～30分钟，再在8000～10000rpm下搅拌15～30分钟，静置3～10分钟，分装。

优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII(MONTANIDE ISA 50V、50VII佐剂(法国SEPPIC公司))中的一种或多种。

还一方面，本发明提供了上述多肽或多肽疫苗在制备用于预防猪O型口蹄疫的生物制品中的用途。

具体而言，本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株序列，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株攻击的多肽抗原。此外，本发明人根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化，进行了大量的筛选获得了免疫效果优异的多肽，增强了多肽抗原的免疫效果。

合成肽疫苗效力实验、安全性实验结果表明，本发明提供的口蹄疫合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且对豚鼠、小鼠、本动物猪均安全，因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1、口蹄疫合成肽疫苗的多肽抗原固相合成

本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株序列，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株攻击的多肽抗原。此外，本发明人根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，增强了多肽抗原的免疫效果。

通过筛选并鉴定的本发明的合成肽抗原可以使用433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了由9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。

合成肽抗原的固相合成

1.1.1合成原料准备

合成多肽抗原的序列如下：

序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。

依据抗原的序列以及1mmol的合成规模，准备合适的Fmoc修饰的氨基酸[购自上海吉尔生化]，加入相应的氨基酸小瓶中。同样按要求称量RinkAmide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。

1.1.2合成仪状态检测

检查多肽合成仪是否正常运行。开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N₂是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送FlowRate1-18到合成仪，选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。

1.1.3合成肽抗原的合成开始

在合成仪的程序中将合成需要的方法Std Fmoc 1.0Sol DIC90发送到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

1.1.4合成肽抗原的合成

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：

(1)脱保护反应：将上述氨基树脂置于体积百分比为15％～30％的六氢吡啶的NMP溶液中，在20～28℃条件下反应25～40分钟脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；

(2)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(3)缩合反应：加入HOBT、DIC与Fmoc保护的氨基酸在20～28℃条件下反应0.5-2.5小时；

(4)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(5)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的NMP溶液，在20～28℃条件下反应20～40分钟。

1.1.5合成肽抗原合成结束

抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤多肽树脂3次，然后在通风橱内吹干，将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

1.2合成肽抗原的裂解及鉴定

1.2.1合成肽抗原的裂解

按照体积比例(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/苯酚/水＝85/8/6/1)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120分钟除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。

1.2.2合成肽抗原的鉴定

抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。

1.3合成肽抗原的构象形成

用15％DMSO将多肽抗原配制成浓度为2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1NNaOH或0.1NHCl调整初步分离多肽溶液的pH值为5.5～7.5，在25℃的环境下在转速为110rpm的摇床上放置48小时，使形成二硫键，形成环状结构。或者，进行如下首尾环化：

首尾氨基酸的“-COOH”与“-NH₂”环化方法参见Mengfen等PeptideProteinReserch 1996.48:229-239；使首尾氨基酸的“-COOH”与“-OH”进行反应而形成环状结构的方法参见Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92:3771-3777。由此得到能够模拟病毒粒子天然构象的多肽环化结构。

1.4合成肽抗原的纯化除菌

合成肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20～28℃条件下进行超滤(TangentialFlow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

为了便于运输和长期保存的需要，将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出，在Labconco冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。同时贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2、口蹄疫O型合成肽疫苗的配制

1.1抗原水相的配制

分别称取依照实施例1制备的多肽1或多肽2所示的合成肽抗原，按照摩尔比例为1:1混合，然后用灭菌注射用水将合成肽抗原总浓度稀释至50μg/ml。将所得抗原溶液经孔径为0.2μm的过滤器过滤，除菌。

1.2油相佐剂制备

将油相佐剂50V经121℃灭菌30min，备用。

1.3合成肽疫苗的乳化

用灭菌的蒸馏水2000ml清洗IKA乳化设备3次，在25～27℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在120～140rpm下搅拌2～3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20～30分钟，再在8000～10000rpm下搅拌15～30分钟，静置3～10分钟，分装。

按照相同的方法配制只含有单一组分多肽的疫苗，抗原浓度为50μg/ml。

实施例3、口蹄疫O型合成肽疫苗的效力试验

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1合成肽疫苗和对照疫苗

按照实施例1制备实施例3中选择的如多肽1(序列1)和多肽2(序列2)的多肽抗原，然后按照实施例2配制三批次含有多肽1及多肽2混合组分的口蹄疫O型合成肽疫苗，对应批号为：O1801、O1802、O1803，以及多肽1(序列1)制成的疫苗对应批号O1804、多肽2(序列2)制成的疫苗对应批号O1805。

对照疫苗：猪口蹄疫O型灭活疫苗，批号：201907002

1.1.2试验动物

挑选品种相同，4月龄、体重40Kg左右，口蹄疫中和抗体呈阴性的健康架子猪(兰州永靖猪场)。

1.1.3口蹄疫病毒毒种MYA/98株[中牧实业股份有限公司]

用3～4日龄乳鼠[自繁]测定并调整毒价，置于-70℃冷冻保存备用。

1.2试验方法

将健康易感猪92头，随机分成6组，每组15头，第1组免疫O1801、第2组免疫O1802、第3组免疫O1803，第4组免疫O1804，第5组免疫O1805，第6组免疫对照苗猪口蹄疫O型灭活疫苗。每组分3个剂量组，具体免疫剂量为：1头份(5头)，1/3头份(5头)，1/9头份(5头)，其中，O1801、O1802、O1803、O1804、O1805每头份为1ml，对照苗每头份为2ml。免疫时采用颈部肌肉注射，注射剂量及具体分组情况详见表1。接种后28日后，连同条件相同的对照猪2头进行攻毒，每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀/2ml O/Mya98/乳鼠毒。连续观察10日。对照猪均应至少1蹄出现水泡病变。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。按Read-Muench法计算被检疫苗的PD₅₀。

2.试验结果与讨论

2.1试验结果

上述5批实验室疫苗、1批对照疫苗按照1.2方法免疫动物，28日后攻MYA/98强毒，10天后判定结果，结果见表1。

表1.口蹄疫O型合成肽疫苗效力试验结果

2.2结果讨论

由上述结果可以看出：三批次的口蹄疫O型合成肽疫苗O1801、O1802、O1803分别免疫动物，28日后使用MYA/98强毒攻击后的PD₅₀值分别是：9.00、9.00、11.84，猪口蹄疫灭活对照疫苗使用MYA/98攻毒后的PD₅₀值为10.81。而单独多肽免疫第4组免疫OO1804，第5组免疫OO1805强毒攻击后的PD₅₀值也达到7.49。

上述结果表明：口蹄疫O型合成肽疫苗针对MYA/98强毒强毒攻击的PD₅₀值均超过6，达到保护要求。说明多肽疫苗具有保护试验动物猪免受病毒攻击的能力。且口蹄疫O型合成肽疫苗针对MYA/98强毒攻击的PD₅₀值高于猪口蹄疫灭活苗的PD₅₀值，说明多肽疫苗比常规灭活苗相比，具有更好的保护效果。本试验证明合成肽苗既符合疾病预防的要求，又符合食品安全的要求，市场空间很广阔。

实施例5、口蹄疫O型合成肽疫苗的安全性试验

1.材料与方法

1.1合成肽疫苗

同实施例3。

1.2试验动物[自繁]

350～450g的豚鼠；18～22g的小鼠；30～40日龄的仔猪(细胞中和抗体效价不高于1:8或ELISA抗体效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4)。

1.3试验方法

1.3.1用豚鼠和小鼠检验用体重350～450g的豚鼠10只，各皮下注射疫苗2.0ml；用体重18～22g的小鼠25只，各皮下注射疫苗0.5ml，连续观察7日。均应不出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部或全身不良反应。

1.3.2用猪检验用30～40日龄的仔猪(细胞中和抗体效价不高于1:8或ELISA抗体效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4)10头，各两侧耳根后肌肉注射疫苗2.0ml(每侧1.0ml)，逐日观察7日。均应不出现口蹄疫症状或由接种疫苗引起的不良反应。

2.试验结果

2.1疫苗对豚鼠和小鼠的安全性

豚鼠10只，每只皮下注射疫苗2ml；小鼠25只，每只皮下注射0.5ml。连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应，具体结果如下表3。

表3.豚鼠和小鼠的疫苗安全性试验结果

2.2.疫苗对健康易感猪的安全性

将合成肽疫苗取出平衡到室温后，各两侧耳根后肌肉注射疫苗2.0ml(每侧1.0ml)，逐日观察7日。具体结果见表4。

表4.健康易感猪的疫苗安全性试验结果

上述结果说明口蹄疫O型合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及仔猪猪安全性高，无散毒危险，所以具有良好的推广前景和市场价值。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 口蹄疫O型抗原表位多肽及其制备方法和应用

<130> WHOI190105

<160> 2

<170> Patent-In 3.5

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Lys Lys Ser Tyr Gly His Thr Ala Phe Glu Thr Leu Asn Thr His Arg

1 5 10 15

Ala Glu Lys Lys Val Tyr Asn Gly Asn Ser Lys Cys Ala Gly Gly Ser

20 25 30

Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala

35 40 45

Arg Pro Leu Pro Cys Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys

50 55 60

<210> 2

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Ala Ala Gly Glu Asp His Glu Asp Thr Asn Arg Tyr Ala Ser Glu Lys

1 5 10 15

Leu Thr Cys Lys Lys Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Lys Lys Asn Cys Lys Tyr Thr Gly Gly Pro Leu Pro

35 40 45

Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Cys

50 55 60

Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr

65 70

Claims

1.用于制备口蹄疫O型合成肽疫苗的抗原多肽,为序列表中序列2所示的多肽。

2.口蹄疫O型合成肽疫苗，其活性成分为权利要求1所示的抗原多肽。

3.根据权利要求2所述的口蹄疫O型合成肽疫苗，其特征在于，还包括药学上可接受的佐剂。

4.权利要求1所述的抗原多肽在制备口蹄疫O型合成肽疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫为猪O型口蹄疫。

6.权利要求1所述的抗原多肽在制备用于预防O型口蹄疫的生物制品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫为猪O型口蹄疫。

8.口蹄疫O型合成肽疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）用注射用水将权利要求1所述抗原多肽稀释为10-100μg/ml的浓度，从而得到多肽抗原水相；

（2）将佐剂灭菌；

（3）在25~27℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在120~140rpm下搅拌2~3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20~30分钟，再在8000~10000rpm下搅拌15~30分钟，静置3~10分钟，分装。