CN104672312B - 牛口蹄疫a型多肽疫苗 - Google Patents
牛口蹄疫a型多肽疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104672312B CN104672312B CN201510124702.5A CN201510124702A CN104672312B CN 104672312 B CN104672312 B CN 104672312B CN 201510124702 A CN201510124702 A CN 201510124702A CN 104672312 B CN104672312 B CN 104672312B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- sequence
- polypeptide fragment
- fragment shown
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
- A61K39/135—Foot- and mouth-disease virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本发明提供一种用于制备牛口蹄疫A型多肽疫苗的抗原多肽、多肽组合物及疫苗。多肽组合物包括将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽。本发明的疫苗包括多肽组合物。本发明提供的牛口蹄疫A型合成肽疫苗具有良好的免疫效力,并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题,因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性,易于大规模合成,具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。
Description
技术领域
本发明涉及本发明属于医药技术领域,具体而言,本发明涉及一种牛A型口蹄疫多肽疫苗,以及其制备方法。
背景技术
口蹄疫(foot and mouth disease,简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病,在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高,传播迅速,感染猪、牛、羊等牲畜后将导致幼畜死亡,成年动物生产能力急剧下降,因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前,口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制,给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒,具有多型性、易变性等特点。目前,已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒:A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和Asia I(亚洲I型)。这些主型中的每一种又分若干亚型,目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和Asia I型的口蹄疫病毒最为常见,其中血清型A病毒的变种最多,具有超过30种亚型。研究结果表明,口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的,每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位,位于衣壳蛋白的外侧,而VP4位于病毒颗粒的内部。
口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同,彼此之间不能交互免疫。而且,在同一种血清型中抗原差异的程度也很大,以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外,口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化,随着时间的推移,原有疫苗的效力减弱甚至消失,因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。
当前在我国牛群中流行的口蹄疫主要是O型、Asia I型和A型口蹄疫。我国对口蹄疫实行强制性免疫,疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是,我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗,其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下,目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗,也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见,在口蹄疫防治方面,我国已落后于世界发展形势。
在口蹄疫新型疫苗的研究方面,先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道,但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题,影响了这些新型疫苗的使用。此外,这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差,不能有效地保护动物。因此,本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备牛口蹄疫A型多肽疫苗的抗原多肽,多肽组合物,以及含有该多肽组合物的疫苗。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
一方面,本发明提供一种用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽,含有序列5所述的多肽片段。
具体的,本发明提供的用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽,为a-d中任意一项所述的多肽:
a.将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽(多肽1);
b.将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽2);
c.将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽3);
d.将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽4)。
本发明提供的用于制备牛口蹄疫A型疫苗的多肽组合物,包括将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽(多肽1)。
所述多肽组合物中还包括:下述1)-3)中所述多肽之一:
1)将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽2);
2)将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽3);
3)将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽(多肽4)。
本发明中所述的多肽及多肽片段可以是通过固相有机合成得到的肽物质。
所述序列5所述的多肽片段通过连接臂与序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段连接,所述连接臂为甘氨酸或者赖氨酸;当所述连接臂为赖氨酸时,赖氨酸的ε位氨基替代α位氨基形成肽键连接。
优选的,序列5所述的多肽片段与序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段通过赖氨酸连接,所述序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段的羧基端与赖氨酸的ε位氨基连接成肽键,赖氨酸的羧基与序列5所示多肽片段的氨基端连接成肽键。
具体的上述各个多肽的序列如下所示:
多肽1:
RMEAAKTGIEIAYDERRGL-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGSL
AARVAACLPASFNFGAIR(序列1-εK-序列5)
多肽2:
RMEAKKTGIEIAGDERRGL-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGSL
AARVAACLPASFNFGAIR(序列2-εK-序列5)
多肽3:
KKGAGLAGVMVTESVGFRK-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
LAARVAACLPASFNFGAIR(序列3-εK-序列5)
多肽4:
KKGAGLTGVMYTESVRFRK-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
LAARVAACLPASFNFGAIR(序列4-εK-序列5)
其中,εK为多肽片段之间的连接臂,即赖氨酸的ε位氨基形成肽键,具体原理如下所示:
每个氨基酸至少包含一个“—COOH”(羧基)和一个“—NH3”(氨基),连接在α碳原子上的羧基和氨基称为“α羧基”和“α氨基”。一般的肽合成反应为上一个氨基酸的“α氨基”和下一个氨基酸的“α羧基”反应形成酰胺键(肽键)而成。
Lys(赖氨酸)是一种碱性氨基酸,除了正常的“α氨基”和“α羧基”外,在ε位置上还有一个氨基,如下式。
εK特指参与成肽反应的氨基是“ε氨基”而不是“α氨基”,因其较长的手臂结构,因此,被用于连接需要共同使用但又不互相影响的表位。
上述抗原多肽可以单链首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接形成环状多肽或者所述多肽的单链中的两个半胱氨酸的巯基可以经氧化反应生成二硫键而形成环状多肽;即天然的病毒结构;优选地,所述多肽的单链首尾氨基酸残基共价连接是羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接形成环状。
优选的,所述多肽组合物由将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽、将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽和将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽组成;优选的,它们的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5);最优选的,它们的摩尔比为1:1:1:1。
所述的多肽组合物在制备牛口蹄疫A型多肽疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的一种牛口蹄疫A型多肽疫苗,包含上述的多肽组合物。
所述肽疫苗还包含佐剂。
本发明提供了所述的牛A型口蹄疫多肽疫苗的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)用注射用水将所述多肽组合物稀释为10-100μg/ml(优选50μg/ml)的浓度,从而得到多肽抗原水相;
(2)将佐剂灭菌(在121℃条件下灭菌30分钟);
(3)在20~28℃条件下,按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比,先将佐剂加入乳化罐内,在90~150rpm下搅拌1.5~3分钟,然后缓慢加入多肽抗原水相,然后搅拌20~30分钟,再在8000~10000rpm下搅拌15-30分钟,静置3-10分钟(优选5分钟),分装。
优选地,所述佐剂为选自白油、50V、50VII(MONTANIDE ISA 50V、50VII佐剂(法国SEPPIC公司))中的一种或多种。
本发明还提供了上述多肽聚合物中的多肽的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)以氨基树脂为起始原料,以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体,按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽,每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端;
(2)合成完毕后加入裂解试剂,从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来;
(3)使用乙醚沉淀所述多肽;
(4)对所述多肽进行超滤纯化,然后进行无菌处理。
在上述制备方法中,所述步骤(1)具体包括以下步骤:
(1-a)脱保护反应:将氨基树脂置于体积百分比为15%~30%的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中,在20~28℃条件下反应25~40min,从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团;
(1-b)洗涤:氮气吹干,然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂;
(1-c)缩合反应:加入1-羟基苯丙三唑(HOBT)、二环己基碳二亚胺(DCC)与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸,然后在20~28℃条件下反应0.5~2.5h;
(1-d)洗涤:氮气吹干,然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂;
(1-e)封闭反应:加入重量体积百分比为1.5%~4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液,在20~28℃条件下反应20~40min。
在上述制备方法中,所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85:8:6:1的三氟乙酸:三异丙基硅烷:苯酚:H2O;并且,所述步骤(2)的裂解时间为1-4h。
在上述制备方法中,所述步骤(3)具体包括:
(3-a)使用乙醚沉淀所述多肽,然后用二甲基甲酰胺洗涤;
(3-b)在加入10%的DMSO情况下,使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键;或者,使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接;优选地,在加入1%的DIC和0.5%的HOBT情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在0.1M H2SO4情况下羧基与羟基之间反应形成共价连接。
在上述制备方法中,所述步骤(4)具体包括以下步骤:
(4-a)使用切向过滤膜包在20~28℃条件下超滤所述多肽,从而除去小分子杂质;
(4-b)使用0.2μm滤器除菌保存。
还一方面,本发明提供了上述多肽或多肽疫苗在制备用于预防牛A型口蹄疫的生物制品中的用途。
具体而言,本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株序列,研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况,针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率,同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测,对可能的抗原位点肽段进行化学合成,即针对易变异位点根据统计的变异频率,在这些位点使用不同的氨基酸,得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而,通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选,得到能够引起动物的免疫反应,而且免疫反应水平高,能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株攻击的多肽抗原。此外,本发明人根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化,并有效组合了T细胞表位和B细胞表位,增强了多肽抗原的免疫效果。
肽疫苗效力实验、安全性实验结果表明,本发明提供的牛口蹄疫A型合成肽疫苗具有良好的免疫效力,并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题,因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性,易于大规模合成,具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
实施例1、牛口蹄疫A型多肽疫苗多肽的固相合成
本发明通过对国内口蹄疫新近流行毒株的序列测定并结合口蹄疫疫苗毒株序列,研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况,针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率,同时结合计算机辅助进行口蹄疫抗原位点的分析预测,对可能的抗原位点肽段进行化学合成,即针对易变异位点根据统计的变异频率,在这些位点使用不同的氨基酸,得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而,通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选,得到能够引起动物的免疫反应,而且免疫反应水平高,能够很好的保护动物免受口蹄疫流行毒株攻击的多肽抗原。此外,本发明人根据筛选实验结果对口蹄疫病毒抗原位点进行了优化,并有效组合了T细胞表位和B细胞表位,增强了多肽抗原的免疫效果。
通过筛选并鉴定的本发明的合成肽抗原可以使用美国433A全自动多肽合成仪,利用Merrifield固相合成法制备,其中采用了由9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸,固相载体为美国sigma的Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
1.1合成肽抗原的固相合成
1.1.1合成原料准备
合成多肽抗原的序列如下:
多肽1:
RMEAAKTGIEIAYDERRGL-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGSL
AARVAACLPASFNFGAIR(序列1-εK-序列5)
多肽2:
RMEAKKTGIEIAGDERRGL-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGSL
AARVAACLPASFNFGAIR(序列2-εK-序列5)
多肽3:
KKGAGLAGVMVTESVGFRK-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
LAARVAACLPASFNFGAIR(序列3-εK-序列5)
多肽4:
KKGAGLTGVMYTESVRFRK-εK-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
LAARVAACLPASFNFGAIR(序列4-εK-序列5)
其中,εK为多肽片段之间的连接臂,即赖氨酸的ε位氨基形成肽键。(在下述合成过程中,反应溶液是碱性,购买的成品赖氨酸其ε位氨基是由碱敏感基团保护,而其α位氨基由酸敏感基团保护。反应过程中,只能将ε位氨基的保护基团脱除,暴露其氨基,与下一个氨基酸的羧基进行反应。)
依据抗原的序列以及1mmol的合成规模,准备合适的Fmoc修饰的氨基酸[购自上海吉尔生化],加入相应的氨基酸小瓶中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂,放入反应腔中,将上下盖子拧紧,贴标签,记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂,包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。
1.1.2合成仪状态检测
检查多肽合成仪是否正常运行。开机后,运行Run Self Test程序,仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足,系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解,所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送Flow Rate1-18到合成仪,选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA—按Start—按more进行测量或观察,若流量不合适,则调节下阀门压力,直至达到要求。
1.1.3合成肽抗原的合成开始
在合成仪的程序中将合成需要的方法Std Fmoc 1.0Sol DIC90发送到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列,保存。File-New-Run,检查Chemistry;Sequence是否为所存名字;设定Cycles;保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin,开始运行。
1.1.4合成肽抗原的合成
如上述的多肽序列,合成的时候是从C端开始至N端,依照给定的顺序,依次不断地重复如下合成步骤:
(1)脱保护反应:将上述氨基树脂置于体积百分比为15%~30%的六氢吡啶的NMP溶液中,在20~28℃条件下反应25~40min脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团;
(2)洗涤:氮气吹干,NMP洗涤氨基树脂;
(3)缩合反应:加入HOBT、DCC与Fmoc保护的氨基酸在20~28℃条件下反应0.5-2.5h;
(4)洗涤:氮气吹干,NMP洗涤氨基树脂;
(5)封闭反应:加入重量体积百分比为1.5%~4%的乙酰咪唑的NMP溶液,在20~28℃条件下反应20~40min。
1.1.5合成肽抗原合成结束
抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器,再用100%甲醇洗涤多肽树脂3次,然后在通风橱内吹干,将多肽树脂转移至棕色瓶内,放入-20℃冰箱内,封口膜密封备用。
1.2合成肽抗原的裂解及鉴定
1.2.1合成肽抗原的裂解
按照体积比例(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/苯酚/H2O=85/8/6/1)配制裂解液,然后从冰箱内取出合成的多肽树脂,放入圆底烧瓶内,在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子,然后稳定地放置在磁力搅拌器上,室温下持续搅拌1h直至反应完全。反应结束后,使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30~120min除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽,然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品,最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来,即得到多肽抗原。
1.2.2合成肽抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。
1.3合成肽抗原的构象形成
用15%DMSO将多肽抗原配制成浓度为2mg/ml的多肽溶液,然后用0.1N NaOH或0.1N HCl调整初步分离多肽溶液的pH值=8.5,在25℃的环境下在转速为110rpm的摇床上放置48h,使形成二硫键,形成环状结构。或者,进行如下首尾环化:
首尾氨基酸的“-COOH”与“-NH2”环化方法参见Mengfen等Peptide ProteinReserch 1996.48:229-239;使首尾氨基酸的“-COOH”与“-OH”进行反应而形成环状结构的方法参见Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92:3771-3777。由此得到能够模拟病毒粒子天然构象的多肽环化结构。
1.4合成肽抗原的纯化除菌
合成肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20~28℃条件下进行超滤(TangentialFlow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵),多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜,而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌,将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内,贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件,分装后,储存于-20℃或-40℃备用。
为了便于运输和长期保存的需要,将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出,在Labconco冷冻干燥机上进行干燥,得到固体状态的多肽抗原。同时贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、牛口蹄疫A型多肽疫苗的配制
1.1抗原水相的配制
分别称取依照实施例1制备的多肽1、多肽2、多肽3或多肽4所示的合成肽抗原,按照抗原比例摩尔为1:1:1:1混合,然后用灭菌注射用水将合成肽抗原总浓度稀释至50μg/ml。将所得抗原溶液经孔径为0.2μm的过滤器过滤,除菌。
1.2油相佐剂制备
将油相佐剂50V经121℃灭菌30min,备用。
1.3合成肽疫苗的乳化
用灭菌的蒸馏水2000ml清洗IKA乳化设备3次,然后在20~28℃条件下按油相佐剂和抗原水相为1:1的体积比,先将油相加入乳化罐内,开动电机以90~150rpm慢速转动搅拌2min后,同时缓慢加入水相抗原,加完后搅拌30min,再以10000rpm高速搅拌20min,静置5min,使疫苗乳化成油包水的单相疫苗,得到含摩尔比为1:1:1:1的多肽1、多肽2、多肽3和多肽4混合疫苗。
按照上述相同的方法,分别制备以多肽1、多肽2、多肽3或多肽4替换四种多肽混合物为抗原的疫苗。
实施例3、牛口蹄疫A型多肽疫苗的效力试验
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1合成肽疫苗
按照实施例1制备序列如多肽1、多肽2、多肽3或多肽4的多肽抗原,然后按照实施例2分别配制含有多肽1、多肽2、多肽3和多肽4混合组分的A型口蹄疫合成肽疫苗,对应批号为:ZM6266201、ZM6266202、ZM6266203。同时,按照实施例2的方法配制多肽1、多肽2、多肽3或多肽4分别为抗原的单组份口蹄疫A型多肽疫苗,对应批号为:ZMDKY001、ZMDKY002、ZMDKY003、ZMDKY004。
1.1.2试验动物
挑选口蹄疫抗体阴性(乳鼠中和抗体滴度≤1∶4)的6月龄健康黄牛122头[购自兰州地区牛场]。
1.1.3毒种AF/72株[中牧实业股份有限公司]
用3~4日龄乳鼠[自繁]测定并调整毒价,置于-25℃冷冻保存备用。
1.2试验方法
将健康易感黄牛120头,随机分成八组,每组15头,第1-3组分别免疫ZM6266201、ZM6266202、ZM6266203,第4组免疫同类制品对照苗1101002(商品化牛口蹄疫A型灭活疫苗),第5-8组分别免疫ZMDKY001、ZMDKY002、ZMDKY003、ZMDKY004单组分A型口蹄疫合成肽疫苗。每组具体免疫剂量为:1头份(5头),1/3头份(5头),1/9头份(5头),其中,ZM6266201、ZM6266202、ZM6266203、ZMDKY001、ZMDKY002、ZMDKY003、ZMDKY004每头份为1ml。同类制品对照苗1101002(商品化牛口蹄疫A型灭活疫苗)每头份为2ml。免疫时采用颈部肌肉注射,注射剂量及具体分组情况详见表1。接种后21日后,将各组3个剂量组中的牛攻击AF/72强毒,连同对照牛2头,每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射AF/72强毒,每点均为0.1ml(共0.2ml,含104ID50),连续观察10日。
1.3结果判定
对照牛应3个蹄以上出现病变(水泡或溃疡),免疫牛仅舌面出现水泡或溃疡,而其他部位无病变时判为保护,除舌面以外任何一部位出现典型口蹄疫病变(水泡或溃疡)时判为不保护。根据免疫牛的保护数,按Read-Muench法计算被检疫苗的PD50。八组待检疫苗均按照上述方法进行效力实验。
2.试验结果与讨论
2.1试验结果
上述3批实验室疫苗、对照疫苗和单组分疫苗按照1.4方法免疫动物,21天后攻AF/72强毒,10天后判定结果,结果如下表。
表1.牛口蹄疫A型多肽疫苗效力试验结果
2.2结果讨论
由上述结果可以看出:三批次的牛口蹄疫A型多肽疫苗ZM6266201、ZM6266202、ZM6266203分别免疫动物,21天后使用AF/72强毒攻击后的PD50值分别是:11.84、10.81、10.81。同类制品对照疫苗1101002攻毒后的PD50值为10.81。
上述结果表明:单一组分的合成肽疫苗针对AF/72强毒攻击的PD50值分别为:9.00、7.05、7.49、7.05,超过6个PD50,均达到保护要求。说明单一的序列均具有保护试验动物牛免受病毒攻击的能力。牛A口蹄疫合成肽混合多肽疫苗ZM6266201、ZM6266202、ZM6266203针对AF/72强毒攻击的PD50值与牛口蹄疫灭活苗结果相近,具有良好的保护效果,本试验证明合成肽苗既符合疾病预防的要求的又符合食品安全的要求,市场空间很广阔。
实施例4、牛口蹄疫A型多肽疫苗的安全性试验
1.材料与方法
1.1合成肽疫苗
同实施例3。
1.2试验动物[自繁]
350~450g的豚鼠;18~22g的小鼠;至少6月龄的健康易感牛。
1.3试验方法
1.3.1用体重350~450g的豚鼠15只,每只皮下注射疫苗2ml;用体重18~22g的小鼠15只,每只皮下注射疫苗0.5ml,另外取豚鼠5只、小鼠5只,不注射疫苗,作为对照组。连续观察7日,均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。
1.3.2用至少6月龄的健康易感牛(口蹄疫细胞中和抗体效价不高于1:8)9头,于每头牛舌皮内分20个点注射疫苗2ml,每点0.1ml,逐日观察至少4日。之后,每头牛肌肉注射疫苗9ml,继续逐日观察6日。均不得出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。
2.试验结果
2.1疫苗对豚鼠和小鼠的安全性
豚鼠15只,每只皮下注射疫苗2ml;小鼠15只,每只皮下注射0.5ml。连续观察7日,均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应,具体结果如下表2。
表2.豚鼠和小鼠的疫苗安全性试验结果
2.2.疫苗对健康易感牛的安全性
将合成肽疫苗取出平衡到室温后,于每头牛舌皮内分20个点注射疫苗2ml,每点0.1ml,逐日观察至少4日。之后,每头牛肌肉注射疫苗9ml,继续逐日观察6日。具体结果见表2。
表3.健康易感牛的疫苗安全性试验结果
上述结果说明这些牛口蹄疫A型多肽疫苗对豚鼠、小鼠及牛是安全的,不像传统疫苗那样存在发热、红肿等副反应问题,安全性高,无散毒危险,所以具有良好的推广前景和市场价值。
实施例5、牛口蹄疫A型多肽疫苗的免疫持续期试验
1材料与方法
1.1合成肽疫苗
同实施例3。
1.2试验动物
健康易感90日龄黄牛(经乳鼠中和试验检测口蹄疫抗体不高于1:4)[购自兰州地区牛场]。
1.3攻毒用毒种
AF/72株[中牧实业股份有限公司]
用3~4日龄乳鼠[自繁]测定并调整毒价,置于-25℃冷冻保存备用。
2方法
2.1将已选符合要求的试验犊牛分成4组,每组15头,第一组免疫试验苗ZM6266201,1ml/头,第二组免疫ZM6266202,1ml/头,第三组免疫ZM6266203,1ml/头,第四组免疫同类制品对照苗批号1101002,2ml/头。分别在免疫后第3、6、8月,每组各拉回5头牛到兰州生物厂,进行AF/72株强毒株攻毒,攻毒剂量均为10000个ID50/头,同时设2头阴性对照组。
2.2判定标准对照牛应3个以上蹄出现病变(水泡或溃疡),免疫牛仅舌面出现水泡或溃疡,而其他部位无病变时判为保护,除舌面以外任何一部位出现典型口蹄疫病变(水泡或溃疡)时判为不保护。
3免疫持续期攻毒保护结果
四组疫苗在免疫3个月后,每组各拉回兰州生物药厂5头牛(共20头),攻击AF/72强毒,10天后观察结果如下表:
表4.免疫后3个月攻毒试验结果
四组疫苗在免疫6个月后,每组各拉回兰州生物药厂5头牛(共20头),攻击AF/72强毒,10天后观察结果如下表:
表5.免疫后6个月攻毒试验结果
四组疫苗在免疫8个月后,每组各拉回兰州生物药厂5头牛(共20头),攻击AF/72强毒,10天后观察结果如下表:
表6.免疫后8个月攻毒试验结果
由上述结果可以看出:免疫牛口蹄疫A型多肽疫苗3个月和6个月后,攻击AF/72强毒,攻毒试验结果与灭活苗一致均能达到100%的保护;到第8个月,第一组4/5保护,第二组4/5保护,第三组3/5保护,第四组(同类制品对照组)4/5保护。这说明牛口蹄疫A型合成肽疫苗的保护能力在第8个月时已开始逐渐下降,出现了60%的保护情况,免疫持续期的情况基本与同类制品对照苗趋势一致。
为保证本疫苗在临床使用过程中能抵抗强毒力的流行毒攻击,使牛群处于最佳免疫状态,将免疫持续期定为6个月。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (14)
1.一种用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的多肽组合物,包括将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽组合物,其特征在于:还包括:下述1)-3)中所述多肽之一:
1)将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;
2)将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;
3)将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽。
3.根据权利要求1所述的多肽组合物,其特征在于:包括将所述序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段通过连接臂连接后获得的多肽;
所述连接臂为甘氨酸或者赖氨酸;当所述连接臂为赖氨酸时,赖氨酸的ε位氨基替代α位氨基形成肽键连接。
4.根据权利要求3所述的多肽组合物,其特征在于:包括将所述序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段通过赖氨酸连接后获得的多肽;
所述序列1所述的多肽片段的羧基端与赖氨酸的ε位氨基连接成肽键,赖氨酸的羧基与序列5所示多肽片段的氨基端连接成肽键。
5.根据权利要求2所述的多肽组合物,其特征在于:还包括:下
述1)-3)中所述多肽之一:
所述序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过连接臂连接后获得的多肽;
所述序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过连接臂连接后获得的多肽;
所述序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过连接臂连接后获得的多肽;
所述连接臂为甘氨酸或者赖氨酸;当所述连接臂为赖氨酸时,赖氨酸的ε位氨基替代α位氨基形成肽键连接。
6.根据权利要求5所述的多肽组合物,其特征在于:还包括:下述1)-3)中所述多肽之一:
所述序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过赖氨酸连接后获得的多肽;
所述序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过赖氨酸连接后获得的多肽;
所述序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段通过赖氨酸连接后获得的多肽;
所述序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段的羧基端与赖氨酸的ε位氨基连接成肽键,赖氨酸的羧基与序列5所示多肽片段的氨基端连接成肽键。
7.根据权利要求1或2所述的多肽组合物,其特征在于:组成多肽组合物的多肽单链首尾氨基酸残基之间反应共价连接形成环状多肽或者所述多肽的单链中的两个半胱氨酸的巯基可以经氧化连接在一起形成二硫键。
8.根据权利要求7所述的多肽组合物,其特征在于:所述多肽的单链首尾氨基酸残基共价连接为羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接形成环状多肽。
9.根据权利要求1或2所述的多肽组合物,其特征在于:由将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽、将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽和将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽组成。
10.根据权利要求9所述的多肽组合物,其特征在于:将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽、将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽和将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5)。
11.根据权利要求10所述的多肽组合物,其特征在于:将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽、将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽;将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽和将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽摩尔比为1:1:1:1。
12.权利要求1-11中任意一项所述的多肽组合物在制备牛口蹄疫A型多肽疫苗或制备用于预防牛A型口蹄疫的生物制品中的应用。
13.一种牛A型口蹄疫多肽疫苗,包含权利要求1至11中任一项所述的多肽组合物。
14.牛口蹄疫A型多肽疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)用注射用水将权利要求1-11中任意一项所述多肽组合物稀释为10-100μg/ml的浓度,从而得到多肽抗原水相;
(2)将佐剂灭菌;
(3)在20~28℃条件下,按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比,先将佐剂加入乳化罐内,在90~150rpm下搅拌1.5~3分钟,然后缓慢加入多肽抗原水相,然后搅拌20~30分钟,再在8000~10000rpm下搅拌15~30分钟,静置3-10分钟,分装。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510124702.5A CN104672312B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 牛口蹄疫a型多肽疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510124702.5A CN104672312B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 牛口蹄疫a型多肽疫苗 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104672312A CN104672312A (zh) | 2015-06-03 |
CN104672312B true CN104672312B (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=53307942
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510124702.5A Active CN104672312B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 牛口蹄疫a型多肽疫苗 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104672312B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106986925B (zh) * | 2017-05-08 | 2020-08-25 | 中牧实业股份有限公司 | 牛口蹄疫o型、a型二价合成肽疫苗及其制备方法和应用 |
CN112076314B (zh) * | 2020-09-24 | 2021-11-23 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种a型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103224548A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-07-31 | 中国牧工商(集团)总公司 | 用于制备牛口蹄疫asia i型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途 |
CN103554234A (zh) * | 2013-09-05 | 2014-02-05 | 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 | 基于口蹄疫a型vp1蛋白及其单抗的竞争elisa方法 |
CN104244973A (zh) * | 2012-11-16 | 2014-12-24 | 美国联合生物医学公司 | 针对口蹄疫(fmd)的基于合成肽的紧急疫苗 |
-
2015
- 2015-03-20 CN CN201510124702.5A patent/CN104672312B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104244973A (zh) * | 2012-11-16 | 2014-12-24 | 美国联合生物医学公司 | 针对口蹄疫(fmd)的基于合成肽的紧急疫苗 |
CN103224548A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-07-31 | 中国牧工商(集团)总公司 | 用于制备牛口蹄疫asia i型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途 |
CN103554234A (zh) * | 2013-09-05 | 2014-02-05 | 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 | 基于口蹄疫a型vp1蛋白及其单抗的竞争elisa方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104672312A (zh) | 2015-06-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101659695B (zh) | O型口蹄疫合成肽疫苗 | |
CN104961807B (zh) | 用于制备牛口蹄疫o型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途 | |
CN104672312B (zh) | 牛口蹄疫a型多肽疫苗 | |
CN103848902B (zh) | 一种合成肽疫苗及其制备方法 | |
CN105175516B (zh) | 一种动物用肽疫苗及其制备 | |
CN105820217B (zh) | 合成肽疫苗及其制备方法 | |
CN106380509B (zh) | 一种猪圆环合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN101565457B (zh) | 一种合成肽疫苗及其制备方法 | |
CN103224548B (zh) | 用于制备牛口蹄疫asia i型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途 | |
CN103087156A (zh) | 口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗 | |
CN110885362B (zh) | 口蹄疫o型合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN110734478B (zh) | 口蹄疫a型合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN110894214B (zh) | 口蹄疫o型抗原表位多肽及其制备方法和应用 | |
CN106986925B (zh) | 牛口蹄疫o型、a型二价合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN101579522B (zh) | 一种新型畜用肽苗及其制备方法 | |
CN104162152A (zh) | 猪口蹄疫o型合成肽疫苗及其制备方法 | |
CN107827958A (zh) | 犬细小病毒合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN103214560B (zh) | 用于制备牛口蹄疫o型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途 | |
CN107056897B (zh) | 猪圆环合成肽疫苗及其制备方法和应用 | |
CN101659696B (zh) | 亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗 | |
CN111803626A (zh) | 猪口蹄疫o型和a型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用 | |
CN101653601A (zh) | 一种畜用肽苗及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |