CN104244973A - 针对口蹄疫(fmd)的基于合成肽的紧急疫苗 - Google Patents

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Abstract

公开了一种合成的FMD肽免疫原和包含所述免疫原的组合物。还公开了使用所述合成的FMD肽免疫原在动物中检测、治疗与预防FMD感染的方法。在一个具体实施方案中,描述了一种针对口蹄疫(Foot and Mouth Disease)的基于肽的紧急疫苗及其制剂。不同的疫苗制剂含有源自FMDV VP1蛋白的肽的混合物;各个肽包含连接于人工Th表位的B细胞FMDV中和/受体结合表位序列,以增强各个肽的免疫原性。所公开的含有病毒免疫原的疫苗制剂,可以任选地补充以表示源自FMDV蛋白的FMDV内源性Th表位、同源物及其功能类似物的肽混合物。在可接受的递送系统中将此种病毒肽组合物制成疫苗制剂,并且可以仅单次施用即可保护猪和牛在FMDV攻击时免受感染。

Description

针对口蹄疫(FMD)的基于合成肽的紧急疫苗
技术领域
本公开的内容涉及用于控制口蹄疫(FMD)的针对口蹄疫病毒(FMDV)的基于肽的紧急疫苗及其制剂。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是最具感染性的动物疾病。引发剂口蹄疫病毒(FMDV)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫属(aphthovirus),其具有编码4个衣壳蛋白(VP1-VP4)与非结构多肽(2A-2C和3A-3D)的正义RNA基因组(由Carrillo,C.等人,2005综述)。
FMDV快速复制,且可以在被感染与接触的易感动物(包括偶蹄类动物,例如,牛,猪,山羊,绵羊)的间经由空气(气溶胶传播)传播。FMD在世界动物卫生组织(OIE)的动物传染性疾病的A表上,且被认定为对动物与动物产品的国际贸易最重要的限制。目前,以隔离检疫及扑杀被感染和暴露的动物;并且在大多数国家通过用化学灭活的病毒组合物接种来控制FMD。由于其存在造成不利的经济后果,因此无该疾病的各国引入很多措施以在不接种疫苗的情况下保持此状态。
目前已描述了7种不同的FMDV血清型,每种血清型进一步分为多种亚型。这些血清型包括:A,O,C,亚洲与南非型SAT-1,2与3,其中A,O与亚洲型最为常见。加上病毒的遗传复杂性与多变性,FMDV可以在随机基础上以高的比率突变。
对于FMDV配制疫苗的显著困难在于显著的病毒抗原多样性和在血清型间无交叉保护。也就是说,针对一种血清型的病毒接种或从一种血清型的病毒恢复的的动物,易于感染来自剩下的6种血清型的病毒。此外,血清型内的抗原变异的程度为这样,以致针对一种亚型的疫苗可能对具有那种相同血清型的另一种亚型无保护性。
目前的FMD疫苗包含各个相关血清型或亚型的灭活病毒(包括参考毒株)的混合物,其利用监测存在于当地的流行中的病毒株确定。为了阻止新出现的FMD变体的爆发,必须定期监测田间分离株并与目前生产的疫苗进行比较。因此,为确保疫苗为目前流行的且有效,灭活的FMD病毒的生产需要:(1)培养并灭活将包含在疫苗中的一些病毒株,(2)监测各个灭活病毒株的效力和功效,和(3)定期重新配制疫苗产品以包含流行株,以避免因出现的新变体导致的保护效力的丧失。
鉴于FMDV血清型的间或的中显著的抗原变异,生产与维持有效的灭活的病毒疫苗费力且复杂。一些已知的与FMDV灭活疫苗相关的问题和缺点包括:生物危害和生物安全风险,产品的不稳定性和多变性,以及治疗的动物中意外,有害的副作用。
例如,由于病毒必须在高度封闭设施内生产以避免污染临近环境,因此制备灭活病毒疫苗产生生物危害/生物安全风险。此外,不能完全保证灭活的病毒产品的无害性。事实上,追溯在欧洲发生的FMDV一些近期的案例即为病毒的不完全灭活。这些潜在的生物危害/生物安全风险限制合格疫苗供应商的数量至仅几个。此种限制也阻碍了地区对疫情爆发的有效且立即的响应的能力。
目前的FMD疫苗也面临产品不稳定以及每批间差异。如上所讨论的,必须定期监测和重新配制疫苗以包含当前流行的和新出现的FMDV病毒株。此外,世界上各个地区在任何给定时间都将需要保护抵抗目前的/新出现的,不同的FMDV毒株。因此,在全世界生产复杂和未限定的灭活病毒疫苗的组合物。必须持续地定期检查这些灭活病毒疫苗的复杂混合物以确保免疫效力。
除以上问题的外,目前的FMDV疫苗已显示在治疗的动物中引起意外,有害的副作用。例如,已有报道了在用目前的疫苗治疗后的动物中产生变态反应,变应性休克,和自发死亡的报道。
现有的基于灭活病毒溶解产物的商品化疫苗的缺点,促使研究以开发更安全且更好限定的亚单位疫苗(Brown,F.1992)。然而,作为灭活疫苗的可接受的取代物,此种亚单位疫苗必须具有与灭活的病毒疫苗相当的免疫原性并提供广谱的针对抗原变体的保护。更重要的是,所述亚单位疫苗需要满足对于仅单次施用疫苗后的攻毒研究的OIE指导原则以符合FMD紧急疫苗的要求。
为了克服与现存商品化的基于溶解产物的FMD病毒疫苗相关的一些问题,发明人及其团队研究在过去的15年在开发基于合成肽的FMDV疫苗以保护猪抵抗FMDV攻毒方面取得了显著的进展。特别是,发明人成功地开发了有效的FMDV疫苗,所述疫苗能够使用含有优化的VP1环状B细胞表位肽的制剂,引发针对FMDV的广泛的中和抗体。通过共价连接肽与人工T辅助细胞表位,可以进一步增强该VP1环状B细胞表位肽的免疫原性(Wang,CY and Shen,M,2000;Wang,CY等人,2001;Wang,CY,等人,2002)。此疫苗已显示在多次施用制剂后有效保护猪抵抗FMDV的攻毒(Wang,CY,等人.2002)。已证实VP1环状B细胞表位肽制剂在保护动物抵抗传统FMDV病毒株方面是重要的疫苗。
为符合OIE指导原则下的“紧急”FMD疫苗,制剂必须在仅单次接种后,即诱导宽范围覆盖FMD血清型的快速保护性免疫。虽然多次施用VP1环状B细胞表位肽制剂提供针对传统的FMDV病毒株的有效保护,但在紧急情况下,单次施用制剂仍不能保护猪抵抗FMDV。另外,VP1环状B细胞表位肽并未显示在施用一或两次后,保护牛抵抗FMDV的攻毒(Rodriguez,LL.等人.2003)。
因此急需大量探讨公有领域中的文献,鉴定及证实FMD紧急疫苗方面所需的保护性免疫应答的相互关联,以允许开发出用于针对FMDV的紧急和一般保护性用途的安全且有效的基于肽的FMD疫苗及其制剂。
鉴于现有FMD疫苗的缺点与限制,仍急需能够仅单次施用即可保护猪和牛抵抗FMDV的紧急疫苗制剂。
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发明内容
本公开的内容针对用于检测,治疗和/或预防动物口蹄疫(FMD)的合成肽。本公开内容的合成肽包括其可用于灵敏且特异地检测动物中FMD感染的肽抗原。此合成肽还包括具有B细胞(B)与T辅助细胞(Th)表位的肽免疫原,所述B细胞(B)与T辅助细胞(Th)表位一起作用以刺激产生针对FMD感染的保护性免疫应答。在某些实施方案中,所述合成肽为肽抗原以及肽免疫原。在一些实施方案中,所述合成肽用于检测动物中FMD病毒(FMDV)抗体的存在。在其它实施方案中,所述合成肽用于治疗FMDV的存在测试为阳性的动物和/或暴露于测试为FMDV阳性的动物的动物。在其它实施方案中,合成肽用于预防动物中的FMD感染。
本公开内容还针对含有合成肽的组合物。此组合物可用于检测,治疗和/或预防动物中的FMD。在某些实施方案中,含有合成肽的组合物用于检测样品中FMDV抗体的存在。在其它实施方案中,含有合成肽的组合物是用于治疗和/或预防动物中FMD感染的药物组合物。在一个特定的实施方案中,所述药物组合物用于引发动物中针对FMDV的免疫应答。在一个特定的实施方案中,所述药物组合物为疫苗组合物,其可预防暴露于病毒的动物中FMD感染的疫苗组合物。
本公开的内容还包括检测,治疗和/或预防动物中FMD感染的方法。所述方法利用本文中也公开的合成肽与含有此合成肽的组合物。
在某些实施方案中,本公开的内容针对基于肽的药物组合物,其符合根据OIE指导原则的紧急疫苗,因为在单次施用后,所述组合物向动物提供充足且足够针对FMD感染的保护。在这些实施方案中,可用作紧急疫苗的药物组合物含有类似于天然FMD蛋白上的抗原位点的肽免疫原以及源自于内源性T细胞表位的病原体蛋白。所述描述的制剂有效地引发针对靶FMD蛋白的功能性抗体以提供给动物对FMD攻毒的保护。
在各种实施方案中,合成肽免疫原可以含有具有B细胞抗原位点的VP1环状肽,所述抗原位点能够引发针对FMDV(SEQ ID NOs:1与2),其同源序列(如SEQ ID NOs:3-23,96-99)及其组合的中和抗体。
公开的VP1环状肽还可以含有T辅助细胞表位(SEQ ID NO:24),其共价连接至肽抗原的氨基或羧基端以促进B细胞抗原肽(如SEQ ID NOs:25-33,100-102)的免疫原性。在特定变化中,肽免疫原辅以表示T辅助细胞表位的肽混合物以提供宿主细胞介导的免疫。此种肽包括源自于FMDV VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,2C,3A,3B与3D蛋白的T辅助细胞表位(如SEQ ID NOs:34-63),其同源物及功能类似物,以及组合序列衍生的文库肽(如SEQ ID NOs:64-87)和以增强盒形式(enhanced cassette form)设计的FMDV Th表位肽(如SEQ IDNOs:88-95)。
本公开的内容还提供在动物中引发针对FMDV的抗体和细胞介导的免疫应答的方法。此方法向无FMDV抗体的动物提供在用FMDV病毒攻毒时的FMD交叉保护。在特定实施方案中,公开的方法包括向动物施用含有组合的FMDV B与T辅助细胞表位簇肽的药物组合物的步骤。
本发明还提供一种FMDV免疫原性肽,含有此肽的紧急疫苗制剂的低成本制造和品质控制的方法,以及能够在紧急情况下仅单次施用疫苗制剂即保护动物抵抗FMDV攻毒的递送系统。
附图简述
图1是说明根据本文中公开的特定实施方案,B与Th表位在FMDV蛋白上的分布与定位的示意图。图中对于蛋白鉴定的氨基酸位置基于FMDV O中国台湾99基因组序列的序列。基于各个编码的蛋白的大小依据不同长度的空白条带鉴定各基因产物的名称(VP4,VP2,VP3,VP1+2A,2B+2C,3A+3B1+B2,B3,3C和3D)。也基于其各自的大小(氨基酸的数目)与表位的定位(蛋白质中的表位源自的氨基酸)鉴定B与T细胞表位,各个表位以其第一和最后氨基酸及那个蛋白中的其编号表示(例如,VP4:S221-M235,表示T细胞表位的长度为15个氨基酸,在VP4蛋白中,从第221氨基酸位置的丝氨酸开始并在第235氨基酸位置的蛋氨酸结束)。
图2为确定根据本文中公开的一个特定实施方案的疫苗制剂的从开发至商业化的研发过程的流程图。
图3A是显示牛接受2次VP1疫苗(SEQ ID NO:25)施用的中和抗体(NA)效价的图表。将十五头6-12个月龄的无FMDV的牛,在第0和第3周进行免疫。于免疫后在第0至6周每周采集血清并在每次免疫后测定NA效价。
图3B是显示猪接受2次VP1疫苗(SEQ ID NO:25)施用的中和抗体(NA)效价的图表。将十五头3-5周龄的无FMDV的猪,在第0和第3周进行免疫。于免疫后在第0至6周每周采集血清并在每次免疫后测定NA效价。
图4A是说明猪在以每剂量27.5μg/mL单次施用在ISA50V2油包水(w/o 50/50)乳化物中的含有10∶1重量比的源自VP1的B表位(O共有SEQID NO:25)和增强的内源性FMDV Th盒簇肽(SEQ ID NO:90)的FMD疫苗制剂后,猪中由PBMCs诱导的细胞免疫应答(IFN-γ的产生)的图表。每周采集动物血液,并如实施例3所述确定其PBMCs体外响应以回忆与具有IFN-γ应答的疫苗肽抗原的能力。
图4B显示与未接种的负对照动物(空白环O)相比,猪在以每剂量27.5μg/mL(填满方块■)单次施用在ISA50V2油包水(w/o 50/50)乳化物中的含有10∶1重量比的源自VP1的B表位(O共有SEQ ID NO:25)与增强的内源性FMDV Th盒簇肽(SEQ ID NO:90)的FMD疫苗制剂后,猪中PBMCs诱导的细胞性免疫应答(IFN-γ的产生)的图表。在攻毒前第28天采血,且通过减去第0天的基准值将最终值进行校正。
发明详述
本公开的内容针对用于检测,治疗和/或预防动物中口蹄疫(FMD)的合成肽。本发明的合成肽包括可用于灵敏及特异检测动物中FMD病毒抗体的肽抗原。此合成肽还包括具有B细胞(B)及T辅助细胞(Th)表位的肽免疫原,所述B细胞(B)及T辅助细胞(Th)表位可共同作用以刺激产生针对FMD感染的保护性免疫应答。在某些实施方案中,合成肽既是肽抗原也是肽免疫原。在一些实施方案中,合成肽用于检测动物中针对FMD病毒(FMDV)的抗体的存在。在其他实施方案中,合成肽用于治疗经检测FMDV的存在为阳性的动物和/或暴露于测试为FMDV阳性动物的动物。在其他实施方案中,合成肽用于预防动物中的FMD感染。
本公开的内容还针对含有合成肽的组合物。此种组合物可用于检测,治疗和/或预防动物中的FMD。在某些实施方案中,含有合成肽的组合物用于检测样品中FMDV的存在。在其他实施方案中,含有合成肽的组合物是用于治疗和/或预防动物中FMD感染的药物组合物。在一个特定的实施方案中,所述药物组合物用于引发动物中的对FMDV的免疫应答。在一个特定的实施方案中,所述药物组合物为疫苗组合物,其可预防暴露于所述病毒的动物中的FMD感染。
本公开的内容还包括检测,治疗和/或预防动物中FMD感染的方法。所公开的方法使用本文中公开的合成肽及含有合成肽的组合物。
a.B细胞表位-FMDV合成肽免疫原
通过比对与评估来自多种,同源FMDV O血清型株的VP1结构蛋白中的B细胞抗原位点获得合成肽免疫原的氨基酸序列。基于表2中所示比对结果,获得25个氨基酸的抗原共有序列,对应于全长FMDV VP1结构蛋白的第134至158位的氨基酸残基(SEQ ID NO:1)。(可以在Genbank登录号NP_740460中找到对于全长VP1序列的氨基酸编号的实例)。对应于第134和158位的氨基酸可以用半胱氨酸残基置换,以允许肽形成内二硫环结构(intra-disulfide loop structure)。还由此比对结果获得含41个氨基酸的较长FMDV抗原共有肽(SEQ ID NO:2)。该第二共有序列包括SEQID NO:1并且在N端及C端包括额外的侧翼序列。所述第二个共有序列对应于全长FMDV VP1结构蛋白的第129至168位氨基酸残基,且对应于第134与158位的氨基酸由半胱氨酸残基置换。将所述两种共有序列鉴定如表1所示。
通过类似的同源比对,也获得源自血清型O,亚洲1,和A的VP1B细胞表位的共有序列,并且在表2中显示为SEQ ID NOs:2,12和16。基于各血清型株在这些位置上最常出现的氨基酸分配各共有序列中可变位置的氨基酸。
合成肽免疫原SEQ ID NO:1和2的有效且可接受的变异包括具有相应序列的免疫性功能同源物,和源自FMDV突变与变体株的构象元件。同源FMDV抗原肽具有与原变异FMDV O中国台湾株第129至168位的VP1结构蛋白及源自多个FMDV O血清型株(Mason,PW等人,2003)的共有序列密切相关的氨基酸残基。可以容易地通过序列比对软件,如ClustalW(Julie D.Thompson,Toby Gibson of European Molecular BiologyLaboratory,Germany and Desmond Higgins of European BioinformaticsInstitute,Cambridge,UK.Algorithmic)鉴定此种同源物。表2显示FMDV O共有序列(2570a,SEQ ID NO:2)以及取自多个血清型及不同株(包括:O坎波斯,O中国台湾,O缅甸,OOzk,O兰州,亚洲1云南,亚洲1江苏,A24,A甘肃,A新疆,C因达亚尔,C3比利时,C3阿根廷等)的FMDV VP1结构蛋白中的二十二个抗原序列(SEQ IDNOs:3至23)的ClustalW比对。
包括在本发明中的额外的VP1同源物,包括含有总是存在于所有FMDV株的VP1序列的环状结构中的特征“RGD”(Arg-Gly-Asp)细胞受体结合序列的肽与蛋白。该RGD序列对应于VP1蛋白的第145至147位氨基酸。
如表2中所示,在“RGD”序列下游(朝向C端)发现的氨基酸数量在不同VP1序列间相同。然而,RGD序列的上游(朝向N端)的氨基酸数量依赖于特定的血清型(如O,亚洲1,A或C)而不同。在各血清型中,N末端序列与那个特定血清型的共有序列具有至少75%的同一性(如,对于血清型亚洲1,当与SEQ ID NO:12相比时的SEQ ID NOs:13至15;对于血清型A,当与SEQ ID NO:16相比时的SEQ ID NOs:17至19)。在一个实施方案中,变体O缅甸/7/02株同源物(SEQ ID NO:7)与SEQ ID NO:2(与共有序列中的那些不同的残基以阴影显示)具有超过85%同一性。在另一个实施方案,变体株OOzk/93同源物(SEQ ID NO:8)与SEQ ID NO:2(与共有序列中的那些不同的残基以阴影显示)具有约90%的同一性。
如表2所示和另外描述的,可以将同源VP1肽以适当的比例合并于组合物中并施用于动物,以有效引发靶向特定FMDV株的中和抗体。因此,含有同源VP1肽的药物组合物是用于预防FMD感染的有效疫苗。例如,含有同源VP1肽,制备为油包水(w/o)乳化(如与ISA50V2)或水包油包水(w/o/w)乳化(如与乳化剂(Emulsigen))的制剂有效地预防FMD感染。
以下提供各种实施方案和实施例,讨论含有多种VP1序列肽的组合物的效果的用途。例如,实施例6,7,9和10描述了多价FMDV猪和/或牛疫苗组合物,所述疫苗组合物包含对应于O共有,O猪/牛/O/Mya/7/02(简称为O缅甸)与OOzk/93(简称为OOzk)的序列的三种FMDV O血清型VP1肽的组合。含有此肽混合物的组合物,可产生有效的三价猪疫苗以抵抗由多种不同O型株的导致的感染。类似地,可以将使用具O共有(2570a),亚洲1江苏/中国/2005(简称为亚洲1江苏),与A甘肃/中国/60Y(简称为A甘肃)的VP1肽组合的多血清型疫苗混合以形成三价血清型牛疫苗以抵抗由来自中国的多种FMDV血清型株导致的感染。此外,含有来自O坎波斯/巴西/58Y(简称为O坎波斯),A24克 鲁塞罗加利福尼亚(简称为A24),与C因达亚尔/巴西/84Y(简称为C因达亚尔)的VP1序列肽的组合,其为适于南美洲的有效的多血清型牛疫苗,有效抵抗由来自南美洲的多种最流行的血清型株导致的FMD感染。
相对于FMDV的其它区域和蛋白,选择以包括在本发明的合成肽中的FMDV VP1蛋白上的B细胞表位的定位显示于图1中。所述蛋白序列是基于FMDV O中国台湾99基因组/编码氨基酸序列(GenBank登录号AJ539137)的序列。
合成肽免疫原的免疫功能类似物还有效引发动物中的免疫应答,且也作为本发明的部分包括在内。免疫功能类似物包括SEQ ID NOs:1,2,12与16的共有序列变体和/或SEQ ID NOs:3-11,13-15与17-23同源物的基本上保留与原肽相同的抗原性及免疫原性的免疫功能类似物。例如,为功能类似物的变体可以具有在氨基酸位置上的保守置换;具有整体电荷中的改变;具有与另一部分的共价连接;或具有氨基酸的添加,插入或缺失,和/或其任何组合。
保守置换是一个氨基酸残基被置换为另一个具有类似化学性质的氨基酸残基。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸与蛋氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺与谷氨酰胺;带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸,赖氨酸与组氨酸;以及带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸与谷氨酸。
在一个实施方案中,特定肽的免疫功能性类似物含有与原肽相同的氨基酸序列,且进一步包括在肽的氨基端添加的3个赖氨酸(Lys-Lys-Lys)。在此实施方案中,原肽包括3个赖氨酸改变原肽的整体电荷,但不改变原肽的功能。
在一个特定的实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少50%的同一性。在另一实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少80%的同一性。在另一实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少85%的同一性。在其它实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少90%的同一性。
b.FMDV内源性T辅助细胞(Th)表位
含有合成免疫原肽的组合物可以包括FMDV内源性Th表位肽。药物/疫苗制剂中存在Th表位通过起始抗原特异性的T细胞活化,以在治疗的动物中引发免疫应答,此为产生FMDV保护的重要因素。此外,包括仔细选择的存在于FMDV蛋白上的免疫显性(immunodominant)的Th表位的制剂,可产生广泛的细胞介导的免疫,其使得所述制剂有效地治疗及保护具有不同遗传特性的动物,如牛。
以单次施用含有组合来自FMDV蛋白的B细胞表位与T辅助细胞表位肽的免疫原肽的制剂免疫动物后,在随后暴露于来自天然感染或FMDV攻毒试验时,能够引发淋巴细胞的增生反应。所述增生反应导致细胞因子的产生,包括IFN-γ的产生,其增强动物中对不同细胞病变病毒感染的细胞介导的免疫应答。
在用含有Th表位的FMD制剂/疫苗免疫的宿主动物中,使用体外T细胞增生分析,和通过体内与体外评估细胞因子IFN-γ的产生,鉴定SEQID NOs:34-63的Th表位肽。此外,分析含有(a)FMDV B表位簇VP1肽与(b)FMDV内源性Th肽的大型库组合(pool combinations)的制剂,以确定能够在具不同遗传背景的多种宿主动物(如,牛)中,有效及持续地产生必需的细胞免疫的适当的药物组合物。除了监测免疫/接种的宿主中的体外IFN-γ生成,还评估中和抗体效价以确定仅单次施用所述制剂的情况下是否这些宿主能够产生针对FMDV的中和抗体。
在各种实施方案中,FMDV内源性Th表位肽源自FMDV蛋白VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,3A,3B与3D的抗原片段。表4确定当用于本发明的制剂时,发现为特别有用的特定FMDV内源性Th性肽(SEQ IDNOs:34-63)。特别是,表4中所列的FMDV内源性Th表位可被获自用(a)FMDV病毒溶解(viral lysate)制剂/疫苗,与(b)含有FMDV候选Th肽的肽制剂免疫的宿主的猪与牛T细胞识别。FMDV VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,2C,3A,3B与3D蛋白上的Th表位(如表4所示)相对于其它FMDV的区域与蛋白的分布和定位显示于图1中。所述蛋白序列基于FMDV O中国台湾99基因组/编码的氨基酸序列的序列(GenBank登录号AJ539137)。
表4中确定的Th表位的同源物也是有效的并且包括在本发明中。例如,SEQ ID NOs:64-78为来自FMDV OTAW/2/99(Genbank登录号AJ539137)的同源Th表位序列。表5提供比较来自FMDV O中国台湾/99的Th表位与来自FMDV OTAW/2/99的同源Th表位的序列比对。特别是,表5比对来自FMDV3D蛋白(SEQ ID NOs:61对64;62对65;63对66;60对71与72),FMDV 2B蛋白(SEQ ID NOs:48对67与68),FMDV 3A蛋白(SEQ IDNOs:53对69与70),FMDV VP4蛋白(SEQ ID NOs:34对73与74),FMDV VP2蛋白(SEQ ID NOs:36对75与76),FMDV VP3蛋白(SEQID NOs:37对77与78)的同源Th表位。
FMDV内源性Th表位肽的免疫功能类似物也是有效的,并且作为本发明的部分包括在内。免疫功能类似物包括基本上保留与原肽相同的免疫原性的SEQ ID NOs:34-63的变体和/或SEQ ID NOs:64-78的同源物。例如,为功能类似物的变体可以具有氨基酸位置处的保守置换;整体电荷中的改变;与另一部分的共价连接;或氨基酸的添加,插入或缺失,和/或其任何组合。
保守置换是一个氨基酸残基被置换为另一个具有类似化学性质的氨基酸残基。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸与蛋氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺与谷氨酰胺;带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸,赖氨酸与组氨酸;以及带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸与谷氨酸。
在一个特定的实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少50%的同一性。在另一实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少80%的同一性。在另一实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少85%的同一性。在进一步另一实施方案中,所述功能类似物与原氨基酸序列具有至少90%的同一性。
在一个实施方案中,特定肽的免疫功能类似物含有与原肽相同的氨基酸序列,且进一步包括在肽的氨基基端添加的3个赖氨酸(Lys-Lys-Lys)。在此实施方案中,原肽包含3个赖氨酸改变原肽的整体电荷,但不改变原肽的功能。
表6确定Th表位肽的其它功能类似物变体。特别是,SEQ ID NOs:39与40为彼此的功能类似物,因为它们仅由在C-端有四个氨基酸缺失(SEQID NO:39)或增加(SEQ ID NO:40)而不同。这两种类似物序列间的差异不会影响包含在这些序列中的Th表位的功能。
在其它变异中,FMDV内源性Th表位可以组合序列(combinaterialsequence)存在,其含有基于特定肽的同源物的可变残基的肽框架中特定位置表示的氨基酸残基的混合物。在一种工艺中,可在合成程序中通过添加指定的保护氨基酸的混合物而非指定位置的一个特定氨基酸,来进行合成组合肽的组装。此种组合FMDV内源性Th肽组装可允许对具有不同遗传背景的动物广泛的Th表位覆盖。FMDV内源性Th肽的代表性组合序列包括SEQ ID NOs:79-87,显示于表7中。这些组合序列源自于为代表性的FMDV内源性Th表位的SEQ ID NOs:34-63(显示于表4中)。
在各种实施方案中,可通过在单一肽中将多个FMDV内源性Th表位序列连接在一起以增强T细胞免疫原性。连接在一起的Th表位序列可为相同的Th表位(以产生具有重复Th表位序列的肽),不同的Th表位(以产生具有多种Th表位序列的性肽),或其组合。此外,可将Th表位序列与间隔子连接或不连接。在某些实施方案中,间隔子用于促进将含多个FMDV Th表位的肽于适当的位置细胞内切割为单一序列。在一些实施方案中,所述间隔子包含氨基酸。在一个优选的实施方案中,所述间隔子为赖氨酸。
本发明的表位肽提供对来自目标动物物种的遗传多样群体的动物广泛的反应性与免疫原性。发现在本发明的制剂中特别有用的肽包括含有多个FMDV Th表位簇的肽,如SEQ ID NOs:34-78,和含有Th表位序列组合序列的肽,如SEQ ID NOs:79-87。在某些实施方案中,FMDV内源性Th表位簇肽可通过将Th表位连接于人工Th(SEQ ID NO:24)以进一步增强T细胞免疫原性,如表7所示(SEQ ID NOs:88-95)。
c.间隔子
合成的FMDV肽免疫原,包括其同源物及类似物,可利用,或不利用间隔子共价连接至包含已知含有Th表位的序列的肽。所述连接的肽可以提供比未连接Th表位肽的等同免疫原增强的免疫原性。
在一些实施方案中,将含有人工Th表位的肽共价连接至合成的FMDV肽免疫原的N-端。在一些变化形式中,间隔子存在于两个序列的间。优选地,间隔子为单一氨基酸εNLys。在一个特定的实施方案中,通过一εNLys间隔子将人工Th表位肽SEQ ID NO:24共价连接至合成的FMDV肽免疫原SEQ ID NO:2的N端(也如表3所示的SEQ ID NO:25)。另外的典型的含有Th表位序列的,共价连接至合成的FMD肽免疫原的氨基端的肽显示于表3中。特别是,将表位肽SEQ ID NO:24通过εNLys间隔子连接至不同合成的FMD肽免疫原的氨基端(SEQ ID NOs:25至33)。
d.组合物
本公开的内容还针对含有合成肽的组合物。所述组合物可用于检测,治疗和/或预防动物中的FMD。在某些实施方案中,包含具有FMDV B细胞表位的合成肽的组合物用于检测样品中FMDV抗体的存在。在其它实施方案中,包含具有FMDV B细胞表位的合成肽的组合物为用于治疗和/或预防动物中FMD感染的药物组合物。在某些实施方案中,包含具有FMDV B细胞表位的药物组合物用于引发动物中针对FMDV的免疫应答。包含具有FMDV B细胞表位合成肽的药物组合物可用作FMDV疫苗。
含有合成的FMDV肽免疫原的药物组合物有效引发针对靶FMD蛋白的功能性抗体以向动物提供对FMD攻毒的保护。事实上,仅接受单次施用这些药物组合物的动物充分且适当地保护抵抗FMD感染。因此,不需要多次施用或加强剂量(booster doses)来提供给动物对FMD感染的完全保护。所以,含有合成的FMDV肽免疫原的药物组合物符合根据OIE指导原则的紧急疫苗。
本公开的组合物可以含有一种或更多种合成的FMDV肽免疫原。例如,所述组合物可以含有表1中所示的具有共有序列(SEQ ID NOs:1或2)的合成的FMDV肽免疫原,和/或如表2所示的其同源物或类似物,和/或其组合。此外,用于组合物的FMDV肽免疫原可连接至人工组合T辅助细胞表位,以增强组合物的B细胞免疫原性。在一个优选的实施方案中,合成的FMDV肽免疫原可连接至人工组合T辅助细胞表位SEQ ID NO:24。表3确定源自各种血清型的代表性FMDV VP1肽免疫原。
含有FMDV肽免疫原的组合物还可以含有一种或更多种FMDV内源性Th表位肽。例如,所述组合物可以包括源自FMDV VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,2C,3A,3B与3D蛋白的Th表位肽。发现组合物中特别有用的Th表位肽包括表4,5,6和7所示的肽(SEQ ID NOs:34-95)及实施例9和10中描述的表18,19,25及26中所示的肽。药物组合物,包括疫苗制剂,仅在单次施用下,即可引发FMDV特异性抗体反应和引发肽抗原特异性-T细胞反应的开始,以保护猪与牛抵抗FMDV感染。
此外,在药学上可接受的递送系统中,组合物可以含有载体和/或其它添加物。因此,可以使用佐剂,药学上可接受的载体或其他常规用于疫苗制剂中的成分将含有合成的FMDV肽免疫原的组合物配制为药物疫苗制剂。其中,可用于本发明的成分为佐剂或乳化剂,包括明矾,不完全弗氏佐剂,liposyn,皂素,角鲨烯,L121,Emulsigen,单磷酰脂A(MPL),QS21,ISA 35,ISA 206,ISA50V2和ISA 720以及其它有效的佐剂与乳化剂。在一个特定的实施方案中,递送载体及佐剂为MontanideTM ISA 50V2(一种由植物油与二缩甘露醇酯组成的用于产生油包水乳化物的油性疫苗佐剂组合物),80(也称为:聚山梨酯80或聚氧乙烯(20)山梨醇单油酸酯),CpG寡核酸,和/或其任意组合。在其它实施方案中,所述药物组合物为以Emulsigen或Emulsigen D作为佐剂(实施例9,表19的第27,28,31与32组)的水包油包水(即w/o/w)乳化物。还提供的是常规并入疫苗制剂的其它成分,和剂量的使用说明(实施例9,10),以致于在单次施用时可增加平衡的B与T细胞免疫应答并且在病毒攻毒是提供保护。
可将药物细合物配制成速释或缓释制剂。此外,可以通过免疫原捕获(immunogen entrapment)及与微粒共施用,将药物组合物配制用于诱导系统性的,或局部黏膜的免疫性。由本领域技术人员容易确定此种递送系统。
含有本公开的肽的各种疫苗制剂对于保护有蹄动物抵抗FMDV是有效的。例如,用作FMDV疫苗制剂的药物组合物,含有合成的FMDV肽免疫原及兽药可接受的递送系统或佐剂,其中所述合成的FMDV肽免疫原具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:
a)SEQ ID NOs:1-2;
b)(a)的同源物;
c)(a)或(b)的抗原性及免疫原性功能类似物;
d)具有至少一个保守氨基酸置换,氨基酸添加和/或氨基酸缺失的(a),(b)或(c);以及
e)(a)-(d)的任意组合。
在一种特定制剂中,所述合成的FMD肽免疫原选自由SEQ ID NOs:2,7与8组成的组。
在另一种制剂中,所述组合物包含通过间隔子连接至人工组合Th肽的合成的FMD肽免疫原,并且具有SEQ ID NO:25的序列。
其它制剂进一步含有以重量计等比的SEQ ID NOs:34至63的30种FMDV Th表位,以每剂量介于约0.1μg至约1mg的间的量存在。在一种特定制剂中,等重量比的SEQ ID NOs:34至63的含量为每剂量介于约1μg至约100μg的间。
在其它制剂中,于兽药可接受的载体或佐剂中,所述组合物包括SEQID NOs:25,27和28的合成的FMDV肽抗原的混合物与具有等重量比的SEQ ID NOs:34至63的FMDV内源性Th表位肽库,其中肽抗原的含量为每剂量介于约10μg至约1mg的间。
e.施用
可通过任何方便的途径,包括皮下,口服,肌肉内,或其它肠胃外或肠内途径施用药物组合物与疫苗制剂。同样地,可单次施用或多次施用疫苗。本领域技术人员可容易确定免疫时间表。
将所述药物组合物配制为含有有效量的合成肽抗原与药学上可接受的载体。还将所述药物组合物以适当的剂量单位形式配制,所述剂量单位形式一般含有每kg体重从约0.5μg至约1mg的免疫原。当以多个剂量递送时,所述药物组合物可以容易地被分为每剂量单位形式适当的量。施用的剂量将依赖于受试者的年龄,体重与一般健康状况,此为疫苗与治疗领域公知。
含有合成FMDV肽免疫原的药物组合物,如疫苗制剂,即使以单次施用时,也可产生有效反应。这些药物组合物的单次施用足以引发具有不同T辅助细胞的动物,包括猪,牛,绵羊,山羊及其它易感野生物种。特别是,含有合成FMDV肽免疫原组合Th表位肽的药物组合物可引发均衡的B(中和抗体)与T细胞(细胞因子的释放等)免疫应答,以保护动物抵抗后续的病毒攻毒。
根据OIE,中国台湾与PRC的指导原则,对使用含有合成FMDV肽免疫原与Th表位肽组合的药物组合物的单次施用免疫进行评估(在实施例9和10中进一步讨论)。获自这些试验的结果,重复与可再现地证实这些制剂在保护经免疫的宿主抵抗FMD感染的有效性。因此,这些试验证实了FMDV制剂的设计,以及使用所述FMDV制剂作为动物中紧急FMDV疫苗的能力。
f.制造方法
本公开的内容还针对制造所述合成FMDV肽免疫原,Th表位肽,组合物与药物制剂/疫苗以引发免疫应答和保护动物抵抗FMDV感染的方法。
使用合成的FMDV肽免疫原提供许多比传统灭活病毒疫苗显著的优点。例如,传统灭活病毒疫苗可能需要昂贵的生物防护设备,对直接在实验室工作的个体,以及在防护设备/程序失败的情况下对公众造成严重的生物危害性风险。相较的下,在肽抗原的制造中不使用生物危害性材料,其大幅地降低健康和安全风险,且不需要昂贵的生物防护设备。此外,位点特异性免疫原呈现高摩尔浓度的选择的表位,其有助于确保使用FMDV抗原肽的疫苗的安全性与免疫原性。
此外,当这些试剂用作疫苗的免疫原性成分时,使用具有已知B细胞与Th表位的限定的合成肽作为免疫原,消除由源自FMDV感染的或重组病毒感染的宿主细胞,或源自可以用FMDV和/或重组蛋白共纯化的重组蛋白表达系统的抗原物质(当这些试剂用作疫苗的免疫原成分时)引起的不需要的非FMDV特异性免疫应答。例如,猪血清可以具有针对宿主细胞或重组大肠杆菌,酵母菌或杆状病毒的抗体,其可以与用于基于生物衍生抗原的诊断试验的抗原物质交叉反应。由具有这些外来免疫原作为成分的疫苗所产生的免疫应答将不具保护性。相比的下,接受现在描述的合成FMDV肽疫苗的猪或牛将产生集中的(focused)免疫应答,而不具有针对源自宿主细胞或表达载体的蛋白的意外抗体或其它免疫应答。
另外,在灭活病毒的制造过程中,可能引入的不一致或错误,可以阻碍被治疗的动物中适当和/或所需的免疫应答。然而,虽然在长片断合成FMDV肽免疫原的合成过程中可能引入不一致和/或错误,但其几乎不防碍或阻止被治疗动物中所需的免疫应答。事实上,在肽合成中可能引入的不一致和/或错误会伴随目标肽产生多种肽类似物。这些类似物可以包括氨基酸的插入,缺失,置换及提前终止(premature termination)。如上所述,此种肽类似物作为抗原性及免疫原性的提供者,当用于免疫学应用(如为了免疫诊断的固相抗原,或为了疫苗的免疫原)时,在肽的制备中是合适的。
在合成肽的长达25年的免疫学应用经验中,申请人已发现允许保留预期的免疫活性的结构变异范围,比起允许保留由小分子药物导致的特定药物活性,或与生物衍生的药物共同产生的大分子中发现的所需的活性或不需的毒性的结构变异范围更具包容性。因此,肽类似物,不论是刻意设计或因合成程序错误而无法避免产生的,作为具有与所需肽相似的层析与免疫性质的缺失序列的副产物混合物,常常与所需肽的纯化产物具有相同的效果。只要形成严格的QC程序,以监控制造过程与产品评估过程,从而确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性,则设计的类似物与非预期的类似物混合物也有效。
鉴于上述优点,可容易地使用标准技术,例如固相合成法合成本公开内容描述的肽,且在合成程序中具有无数的可用的改善(Moore,V,1992)。也可利用重组DNA技术(包括核酸分子,载体,和/或宿主细胞)合成肽。因此,编码FMDV B细胞和T细胞表位簇抗原肽与FMDV B细胞表位簇抗原性肽的免疫功能类似物的核酸分子及其互补序列也作为本发明的部分包括在本公开的内容中。同样地,载体,包括含有核酸的表达载体以及含有载体的宿主细胞也作为本发明的部分包括在本公开的内容中。
各种典型的实施方案亦包括生产FMDV抗原肽与FMDV抗原肽的免疫功能类似物的方法。例如,方法可以包括在肽和/或类似物被表达的条件下,孵育含有具有编码FMDV抗原肽和/或其免疫功能类似物的核酸的表达载体的宿主细胞的步骤。
此外,可以通过固相合成生产肽。可以控制和限定通过此化学过程生产的肽的品质,因此可以确保抗原性,免疫原性以及产量的再现。
g.特定实施方案
本发明的特定实施方案包括,但不限于以下各项:
(1)一种口蹄疫(FMD)疫苗组合物,包括:
a)合成的FMDV VP1肽抗原;
b)合成的FMDV T辅助细胞表位肽;以及
c)兽医学上可接受的递送载体或佐剂,
其中(a)中的FMDV VP1肽抗原包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:
i)SEQ ID NOs:1或2
ii)(a)的同源物;和
iii)(a)或(b)的任何组合,
且其中(b)中的合成的FMDV T辅助细胞表位肽未共价连接至(a)中的肽抗原。
(2)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列。
(3)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原包括SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
(4)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(b)中的同源物为含有选自由SEQ ID NOs:3至23组成的组的氨基酸序列的SEQ ID NO:2的同源物。
(5)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原共价连接在含有Th表位序列的肽的氨基端或羧基端。
(6)根据(5)所述的FMD疫苗,其中所述Th表位序列为SEQ ID NO:24。
(7)根据(5)所述的FMD疫苗,其中所述Th辅助表位通过含有ε赖氨酸残基的间隔子共价连接于肽抗原。
(8)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽选自由SEQ ID NOs:34至95及其组合组成的组。
(9)根据(1)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原的总量介于每剂量约10μg至约1mg。
(10)根据(1)所述的FMD疫苗,其中所述递送载体或佐剂选自以下组成的组:Montanide ISA 50V,聚氧乙烯(20)山梨醇单油酸酯,Emulsigen,Emulsigen D,和CpG寡核酸。
(11)一种口蹄疫(FMD)疫苗组合物,所述组合物包括:
a)合成FMDV VP1肽抗原,其选自由SEQ ID NOs:25-33及其组合组成的组;
b)合成的FMDV T辅助细胞表位肽,其选自由SEQ ID NOs:34-95组成的组;和
c)兽医学上可接受的递送载体或佐剂。
(12)如(11)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原为SEQ ID NOs:25,27,28,29和/或其组合。
(13)如(11)所述的FMD疫苗,其中(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NOs:34-63,90和/或其组合。
(14)如(11)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽为SEQ ID NOs:25,27,28,29和/或其组合,且(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NOs:34-63,90及其组合。
(15)一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(14)中的疫苗。
(16)如(15)所述的方法,其中所述动物为猪。
(17)一种保护动物抵抗FMD感染的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(14)中的疫苗。
(18)如(17)所述的方法,其中所述动物为猪。
(19)如(11)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽为SEQ ID NOs:25,27,28,29,31和/或其组合。
(20)一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(19)中疫苗。
(21)如(20)所述的方法,其中所述动物为牛。
(22)一种保护动物抵抗FMD感染的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(19)中的疫苗。
(23)如(22)所述的方法,其中所述动物为牛。
(24)如(11)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原为SEQ ID NOs:26,30,32,33和/或其组合。
(25)如(11)所述的FMD疫苗,其中(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NOs:91-95及其组合。
(26)如(11)所述的FMD疫苗,其中(a)中的肽抗原为SEQ ID NOs:26,30,32,33和/或其组合,且其中(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NOs:91-95及其组合。
(27)一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(26)中的疫苗。
(28)如(27)所述的方法,其中所述动物为牛。
(29)一种保护动物抵抗FMD感染的方法,所述方法包括向动物单次施用药学上有效量的(26)中的疫苗。
(30)如(29)所述的方法,其中所述动物为牛。
以下实施例用于对本发明进行说明,并且不用于限制本发明的范围。
实施例1
FMDV肽的合成
描述了包括在药物组合物中的FMDV肽的合成方法。可以小量合成所述肽用于实验室试验与田间研究的,以及大量(公斤级)合成,用于疫苗和分析制剂的工业/商业化生产。
设计了表示源自FMDV VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,2C,3A,3B与3D蛋白的FMDV B与T细胞表位簇的FMDV抗原性肽的大的系列组合,其长度约为10至70个氨基酸。对于一些肽,在适当的位点进行氨基酸置换,以允许形成环状肽,对局部结构的保持加以限制,以最大化与相应天然蛋白的交叉反应(例如,置换成半胱氨酸)。代表性的FMDV抗原肽在表2中确认(SEQ ID NOs:1-23)。
还合成的是连接于人工组合Th肽以增强各肽各自的免疫原性的抗原肽。连接于SEQ ID NOs:24的组合Th肽的代表性FMDV抗原肽在表3(SEQ ID NOs:24-33)和表7及表8(SEQ ID NOs:89-102)中确定。
使用Fmoc化学法以Applied BioSystems Models 430A,431与433合成所有用于免疫原性试验的肽。通过于三官能基氨基酸的N-端及侧链有Fmoc保护的,在固相支持物上的独立合成生产各个肽。从固相支持物上切割完成的肽并以90%三氟乙酸去除侧链保护基团。可利用基质辅助激光解吸飞行时间基质辅助激光解吸飞行时间(MALDTOF)质谱仪进行评估合成的肽制备物,以确保正确的氨基酸组成。还通过反相HPLC评估合成的肽以确认合成特征及制备物的浓度。
尽管严格控制合成程序(包括监测偶联效率),而由于延长循环中的意外事件,包括氨基酸的插入,缺失,置换及提前终止,也产生肽类似物。因此,合成的肽制备物典型地包括目标肽并伴随多种肽类似物。尽管包括此种预期外的肽类似物,但产生的合成的肽制备物仍适合用于免疫应用,包括免疫检测(如抗体捕获抗原)与接种疫苗(如肽免疫原)。典型的,只要形成严格的QC程序以监控制造过程及产品评估过程,以保证使用这些肽的终产物的再现性和有效性,此种肽类似物,包括刻意设计或通过合成程序产生的副产物混合物,经常与所需肽的纯化制备物同样有效。
将所有肽进行劳动密集的和时间敏感的血清或体外IFN-γ产生的筛选过程(包括反复循环的肽合成,疫苗制剂,动物免疫),以及血清与体外IFN-γ产生测试,以收获候选肽,用于目标动物中对于各个诊断与疫苗应用的进一步测试。在各种实施例中使用的特定制剂描述如下。
实施例2
测定与试剂
开发用于评估本发明的合成肽与制剂的试剂并描述如下。
a.基于FMDV VP1(aa134-168)或VP1(aa129-168)肽的ELISA
开发评估在以下实施例中描述的各种样品的ELISA分析并描述如下。
将100μL的各目标肽,以2μg/mL(除非另有说明),于10mM NaHCO3缓冲液中,pH 9.5(除非另有说明),在37℃包被96孔板1小时。
将包被肽的孔板与250μL的以重量计3%溶于PBS的明胶于37℃孵育1小时,以封闭非特异性蛋白结合位点,接著,用以体积计含0.05%20的PBS清洗三次并干燥。将要分析的血清用含以体积计20%正常山羊血清,以重量计1%明胶及以体积计0.05%20的PBS,以1∶20(除非另有说明)稀释。将一百微升(100μL)的稀释的样品加至各个孔中并允许于37℃下反应60分钟。
随后将孔用以体积计0.05%20的PBS清洗6次以去除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG作为标记的示踪剂结合阳性孔中形成的抗体/肽抗原复合物。将预滴定的优化稀释度的一百微升的过氧化酶标记的山羊抗猪IgG与以体积计1%的正常山羊血清用以体积计0.05%的20的PBS稀释后加至各孔中,并于37℃下孵育30分钟。用以体积计含0.05%20的PBS清洗孔6次以去除未结合的抗体,并与100μL含以重量计0.04%3’,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(TMB)与以体积计0.12%过氧化氢的柠檬酸钠缓冲液的底物混合物反应15分钟。利用所述底物混合物通过形成有色产物以检测过氧化酶标记。通过加入100μL的1.0M H2SO4终止反应并确定波长450nm(A450)的吸光值。
依照用于检测动物血清中FMDV抗体的目的完成血清稀释:(a)为了鉴定潜在的天然感染,使用1∶20的稀释度,记录A450读值,并使用用于临界值(cutoff)计算的内在阴性对照,或(b)为了确定接受基于肽的FMDV疫苗制剂的猪的抗体效价,测试血清的从1∶10至1∶10000的10倍系列稀释,并通过A450的临界值(cutoff)设为0.5的A450的线性回归分析计算测试的血清的效价,以Log10表示。当需要时,使用特异于这些Serotec提供的同种型的单克隆抗体,测量血清中同型-特异性抗-FMDV抗体(如,IgG1,IgG2与IgA)的检出。如以上描述的,类似地确定抗体效价。
在各VP1ELISA分析中,使用FMDV VP1B细胞表位簇肽(SEQ IDNOs:1-23),2μg/mL,每孔100μL,于10mL NaHCO3缓冲液,pH 9.5,作为包被抗原。
b.基于非结构蛋白3B的肽的ELISA
如先前报道的(Wang,CY等人2001)进行用于血清抗体FMDV与非结构(NS)蛋白3B反应的ELISA,稀释度为1∶21。在各试验中包括来自接种的肽与阴性牛对照的血清。以减去OD临界值(一般为0.220OD)后的OD单位报告获得的结果。
基于FMDV NS 3B性的肽的ELISA测定能够区分接种的动物与被感染动物。特别是,可以基于获自动物的血清是否与非结构FMDV蛋白反应,区分接种动物与感染的动物。尤其是,由于疫苗制剂仅含有来自结构蛋白VP1的表位,因此获自用本公开的疫苗制剂免疫的动物的血清不与非结构FMDV蛋白反应。因此,仅获自被感染动物的血清样品与非结构FMDV蛋白反应。
c.从接种的动物区分被感染动物(Differentiation of Infected fromVaccinated Animals,DIVA)检测系统
基于FMDV NS 3B的肽的ELISA结合基于血清特异性FMDV VP1的肽的ELISA的使用提供用于(1)从接种的动物中辨别被感染动物,以及(2)鉴定感染或接种动物的特定FMDV血清型的有价值且方便的工具。因此,此ELISA测定组合在病毒攻毒时通过血清学方法提供对FMDV疫苗有效性方便且有价值的评估。
d.免疫原性的评估
根据在以下实施例中描述的方法免疫动物。在施用疫苗制剂后,获取血液样品,并评估免疫原性。
特别是,对于牛,在初次免疫后周数(wpi)的第0,3,5周获取来自免疫的动物的样品,并且,对于猪,在初次免疫后周数(wpi)的第0,4,6周获取免疫动物的样品。将所述样品在56℃加热30分钟以灭活血清补体因子。如上所述,使用相应的FMDV VP1抗原肽作为固相抗原,通过基于肽的ELISA评估含有合成肽的制剂的免疫原性。测试系列稀释的实验动物血清,且阳性效价表示为稀释度倒数的Log10
如以下描述的,通过组别收集血清阳性的样品,并确定对FMDV的不同分离株的中和活性。
e.FMDV病毒
使用不同FMDV株对动物进行攻毒研究(在以下实施例中讨论),所述不同FMDV株包括血清型A的FMDV A12与A24;血清型O的O1,O2,O中国台湾,OOzk,O缅甸;亚洲1XJ株等。用于这些实验的FMDV株在梅岛动物疾病中心,USDA(Greenport,NY)和/或国家动物卫生研究所,中国台湾(NIAHT),以单层幼仓鼠肾脏(BHK)细胞培养并在防护条件下纯化。病毒也可获自中国农业部参考实验室,中国农业科学院兰州兽医研究所,用于工业用途,基本上如之前所述(Brown 1963),在通过15-45%蔗糖梯度离心前,先通过1%SDS或1%Nonidet P-40处理沉淀。
通过抽取各离心管中的内含物,通过设定为260nm的分光光度计的流路池(flow cell)鉴定和分离纯化的病毒峰。
f.以中和指数血清学评价FMDV中和活性
从获自动物的血液处理血清样品,并且在测试前先保持在-20℃。使用如上文所述制备的不同血清型的等份(10,000MPD50),通过在一系列增加的输入病毒载量中的中和测定,完成被1∶100稀释的血清样品中和的病毒的列举。
使用之前描述方法(Morgan 1990)评估血清样品。在1∶100稀释度下,显示2.5Log10FMDV微斑(microplaques)的减少的样品被认为高度预期针对FMDV感染的保护性免疫。
g.FMDV-特异性中和抗体测定:标准β中和试验
在96孔板中通过将系列两倍稀释的各个血清与100或200TCID50(50%组织培养感染剂量)的FMDV,于37℃下孵育30分钟,进行标准β中和试验。在含有新鲜单层BHK-21细胞的96孔板中测定剩余的病毒活性。测定血清中和效价为中和50%病毒接种物的Log10血清稀释度。
例如,在平底微孔板中使用等体积200μl针对BHK-21细胞进行中和FMDV O1中国台湾的抗体的定量测定。从各实验动物收集五十微升(50μl)免疫前和免疫后的稀释血清。分别将这些血清与50μl的包含200TCID50的FMDV O1中国台湾等份混合,并于37℃下孵育1小时。接著,向各个测定加入一百微升(100μl)含有2.5x 105BHK-21细胞的培养基(补充以10.0%胎牛血清的MEM(Gibco))。在48小时后,显微镜检查培养物的细胞病变影响(cytopathic effect,CE)。效价表示为抑制50%的200TCID50病毒诱导的CE的最终血清稀释度的倒数。
h.免疫原性研究中所使用的动物
豚鼠:在成熟,未经实验的成年雄性及雌性Duncan-Hartley豚鼠(300-350g/BW)中进行免疫原性研究。实验中每组使用3只豚鼠。
来自无特定病源(SPF)农场的约4至12周龄的豚鼠,于耳部进行标示以用于免疫原性研究,并依据研究方案分成组,每组包含3至5只小猪。
牛:在获自当地提供商的,2至6个月龄的健康肉牛中,进行免疫原性研究,并依据研究方案分组,每组包含3至5只牛。将用于病毒攻毒研究的动物安置于生物安全性3级的农业围阻设施中,且让其在研究开始前适应新的环境1周。
山羊:在获自本地提供商的健康山羊中进行免疫原性研究。
在免疫前,先测试来自各个动物的血清样品中FMDV-特异性中和抗体的存在,以证实所述动物先前未接种或感染FMDV。还使用上文描述的对NS 3B与FMDV VP1的ELISA测定评估来自这些动物的血清,以进一步确保这些动物也不具有针对这些蛋白的抗体。
根据物种与实验流程,以每剂量25至300μg的疫苗免疫各个动物。
i.组合物
在以下描述的实施例中更详细地描述用于各个实验的药物组合物与疫苗制剂。简言之,在各个研究细中指定的制剂通常包括:(1)选自SEQ IDNOs:1-23,25-32的单一VP1B细胞表位簇肽免疫原;(2)包括选自SEQID NOs:1-23与25-32的同源物的VP1B细胞表位簇肽免疫原的混合物;或(3)选自SEQ ID NOs:1-23与25-32的VP1B细胞表位簇肽免疫原的混合物辅以选自SEQ ID NOs:33-92的FMDV内源性Th表位簇肽的混合物。将肽以特定佐剂制剂进行乳化。通常通过以约25至300μg/mL将合成FMDV肽免疫原溶解于水并与Seppic Montanide ISA 50V2佐剂配制成油包水(w/o)乳化物(体积比1∶1)制备疫苗。在免疫前,将疫苗保持于室温约30分钟,并震荡约10至15秒。
用2个剂量的特定疫苗制剂免疫一些动物,其分别在第0(初始)与3wpi(加强)肌肉内注射(IMO)。接著,测试这些免疫的动物以评估存在于疫苗制剂中的合成的FMDV表位免疫原的免疫原性。用单次剂量的特定疫苗制剂免疫剩余的动物,以评估制剂中所使用的肽是否能够有效地诱发可观的中和抗体反应,以符合用于FMDV的紧急疫苗。
实施例3
筛选与鉴定FMDV内源性Th表位簇肽的T细胞功能性测定
如下详细描述T细胞功能试验的实验步骤。
a.外周血单核细胞(PBMCs)的分离,冷冻与解冻
收集肝素化血液,并使用Ficoll-Hypaque通过密度梯度离心分离PBMC。以磷酸缓冲液(PBS)清洗2次后,将PBMC重悬于由补充以10%FCS的RPMI 1640组成的细胞培养基中。对于一些实验,将分离的PBMC冷冻,储存于液态N2中,解冻用于后续的体外培养。
b.血清IFN-γ定量
使用夹心ELISA定量收集自猪或牛的血清样品中的IFN-γ。在免疫前,以及在用FMDV对动物攻毒前第21或28天,定量IFN-γ。通过首先用捕获抗体(购买自PBLBiomedical Laboratories,USA),以每孔0.5μg包被Maxisorb ELISA板(Nunc)的单个孔进行测定。通过添加200μl的ELISA封闭缓冲液至各个测定孔中封闭未被固定的抗体占据的位点。以每次200μl含0.025%Tween 20的PBS(PBS-T20)清洗板4次后,将以ELISA稀释缓冲液分别稀释的血清样品(以1于10,25和75中)加入测定孔中。将板于37℃下孵育1小时使细胞因子结合至固相抗-IFN-γ捕获抗体。接著,以PBS清洗板4次,并将抗-IFN-γ抗体的检测物以每孔0.25μg加至测定孔中。在37℃孵育1小时后,清洗板,并添加100μl的蛋白A缀合物至各个测试孔中。1小时反应期后,清洗过量的缀合物(以PBS清洗6次),并且随后加入100μl的建议的底物溶液用于反应检测。30分钟后,通过加入50μl的1N H2SO4于其中,终止各个测定孔中的显色,并通过测量450nm的吸光值记录颜色强度。首先通过将获自个体血清的测量的A450吸光值与通过在相同测试条件下测定标准重组IFN-γ(PBL BiomedicalLaboratories,USA)的稀释液构建的校准曲线进行比较计算结果。通过减去免疫前动物的测量值,表示免疫后28天,各个动物血清中的IFN-γ反应。最终结果以血清的pg/ml表示。
c.PBMC产生的IFN-γ的测定
将源自免疫接种动物的PBMCs以2.5x 106细胞/mL培养于24孔板(Nunc)的各个孔中,孔中存在有10.0g的选择的疫苗免疫原组合物。还包括仅含有PBMC,无刺激抗原的阴性对照培养物。将所有培养物在37℃,5.0%CO2培养箱中保持3天。培养开始后3天,收集上清液,并使用上述定量测定测量IFN-γ的含量。
实施例4
动物猪与牛中的FMDV攻毒程序
一般来说,攻毒程序基于OIE标准作业手册中的口蹄疫章节中描述的方案。攻毒程序中使用的FMDV株包括:O-1中国台湾(99),O-1缅甸(02),O-1Ozk(中国,93),O-1坎波斯与亚洲1(XJ或江苏,中国,05)。在中国进行的猪的攻毒研究过程,则依据农业部的指导原则,修改为通过肌肉内途径施用FMDV病毒。
a.猪
计算动物中标准化的保护感染剂量(PD50)(即,当50%测试动物被保护时的剂量)。在功效试验中,利用15只体重约40kg的猪(随机分成3组,每组包含5只猪)测定猪中的PD50。分别向所述三组施用1剂量,1/3剂量,与1/9剂量的测试疫苗制剂。剂量给药的改变也用于评估特定制剂的效力,例如,含2X,1X,0.5X与0.25X的剂量。此外,常常利用使用1X剂量快速筛选制剂进行。
为了评估疫苗制剂的有效性,根据实验设计与当时动物的可利用性,将猪分组,每组含有3只(而非5只猪)以用于特定研究。于这3组中的每只猪耳后通过肌肉内途径(IM)接种疫苗。在单次接种后28天,通过用1,000ID50的来自猪FMD O型株的毒性病毒接种动物对15只被接种的猪与2只对照猪中的每个进行攻毒。
在理想实验中,监控10天后,在对照猪的至少一只蹄上应该发现水泡。此外,在免疫接种的猪中应观察不到FMD症状或病征,否则就算疫苗保护失败。利用Reed-Muench方法基于攻毒试验结果计算疫苗产品的PD50。疫苗的目标剂量应该至少含有3PD50,以通过品质释放检验。
在中国台湾,于国家动物卫生研究所(National Institute for AnimalHealth,淡水,中国台湾),根据农委会的指导原则,于P3实验室中通过将在组织培养物中测定效价为1x 105TCID50的FMDV O1中国台湾病毒(比根据PRC指导原则施用的病毒量高约至少10倍)接种至猪前肢的蹄球(heelbulbs)中以进行攻毒。监视实验动物的FMD临床病征超过14天观察期。这些观察包括:(1)每天记录体温,(2)监视动物中任何跛腿的发展,以及(2)监视在动物腿部冠状垫与口鼻部任何获得的水泡。利用Reed-Muench法基于攻毒试验结果计算疫苗产品的PD50。疫苗的目标剂量应该至少含有3PD50,以通过品质释放检验。
b.牛
在牛中,以舌皮内(IDL)接种1mL(在舌上10个位点,每个位点100μL)进行病毒攻毒,测定效价并调整以包含总量为1x 104TCID50的FMDV(牛感染单位或BIU)。每天监测记录直肠温度检测动物,并依据损伤的出现时间与数目和严重度确定保护分数(protection score)。
完全保护被定义为完全没有损伤(分数0),分数小于8被认为是部分保护。如下计算临床分数
i)体温升高至40℃(1分),>40.5(2分),或>41(3分);
ii)食欲降低(1分),或没有摄取食物,且前一天的食物仍有剩余(2分);
iii)跛行(1分)或不愿站立(2分);
iv)在触碰冠状垫后出现发热与疼痛(1分)或受影响的脚无法站力(2分);
v)脚有泡,依赖于受影响脚的数目,最多4分;和
vi)舌头(1分),牙龈和嘴唇(1分)或口鼻部(1分)上的可见口腔病变,最多3分。
所有活体动物实验都依据OIE标准手册,中国农业部或中国台湾农委会的指导原则进行。剂量的改变也用于评估特定制剂的效力,如含有2X,1X,0.5X与0.25X的剂量。此外,也经常利用使用1X剂量对制剂的快速筛选。
实施例5
使用FMDV O中国台湾99分离序列作为FMDV B与内源性Th表位的氨基酸框架结构及位置,比较分析FMDV分离株完整基因组序列,用于肽免疫原设计
在彻底回顾FMDV基因结构后,使用FMDV血清型O中国台湾99的多蛋白氨基酸序列作为基础来鉴定及设计FMDV抗原性肽。一旦确定肽的框架,则可调整此种肽以呈现用于区域应用的多个血清型的序列。FMDV O 国台湾99序列与代表7个血清型的103个FMDV分离株的完整基因组序列进行比对,通过之前描述的对应的GenBank登录号(Carrillo 2005)评估,确定显示出变异上的功能限制以及具有潜在生物相关性新病毒基序的高度保守的FMDV蛋白质区域。特别是,以围绕FMDV VP1蛋白“RGD”受体结合位点的序列及其血清型相关的共有序列(即基于设计的特定血清型FMDV分离株序列的比较,在各个位置上最频繁出现的氨基酸)为蓝图,用以设计B细胞表位簇肽免疫原,然而高度保守的FMDV蛋白质区域为设计FMDV内源性Th表位簇肽免疫原的目标位点。在通过以实施例3中详细描述的工艺进行的血清与细胞测定的筛选后,鉴定了一系列参考的B与T辅助细胞表位簇肽(SEQ ID NOs.:1至102),以应用于如显示于第1图及表1至8中的,代表不同毒株及血清型的FMDV疫苗制剂中。
实施例6
作为基于FMDV肽疫苗的关键组分的FMDV B细胞表位簇肽免疫原的分析
a.设计历史
各个疫苗或免疫治疗产物需要基于特定疾病机制与对于干预所需的目标蛋白的其自身的设计焦点和方法。之后设计所仿照的靶可以包括参与疾病传染途径的细胞蛋白或其中可以包括有多种蛋白的感染剂。
先前对于B与T细胞表位鉴定及分步的了解也有助于分子设计过程。一旦选定目标分子,则需要大量的血清学验证过程。接著,在小型动物中进行持续的先导免疫原性研究,以评估由设计的肽疫苗制剂诱发的抗体的功能特性。随后在目标物种的动物上进行此种血清学应用,以进一步验证疫苗诱发抗体的免疫原性与功能特性。用收集自免疫宿主的血清以多个平行组进行所有研究用于评估。还在目标物种中进行早期攻毒研究以进一步证实设计的方向。然后以不同的混合物制备目标肽,以评估合并使用以制备各个制剂设计时,与各性肽构建体间相互作用相关的功能性质上细微的差异。在额外的评估之后,建立伴随制剂的各个物理参数的最终肽构建体,肽组合物及其制剂,引起最终产物开发过程。
大量的设计经验允许如图2中所示的,从研发至商业化以加快的步伐开发出下一代的疫苗产物。
在特定FMDV肽与组合物的开发过程中,考虑以下开发目标:1)鉴定足以广泛诱导中和抗体的VP1环状结构域目标位点,2)设计用于优化呈递到免疫系统的肽靶位点,3)选择针对猪与反刍动物目标物种免疫效力的位点,4)将这些基本组分并入肽免疫原设计中,其可以被经济地生产,以及5)开发疫苗制剂,剂量大小,以及用于保护性免疫的免疫程序。分析与评估FMDV肽免疫原的总的目的,需要对FMDV序列库与分子模式密集的研究,接著合成大量的用于疫苗制剂的候选免疫原以免疫动物。对总共831只猪与860头牛进行免疫原及中和抗体效价研究,发现,在仅单次施用时,组合物与制剂可有效地保护动物猪与牛抵抗病毒攻毒。整体来说,在研发本发明的过程中,包括除早期的豚鼠与山羊的研究之外的关于猪的25项研究与关于牛的32项研究。
b.最有效VP1环状结构域靶的鉴定
FMDV的有效肽疫苗的关键因子为选择来自VP1的G-H环状结构域的精确序列,其对于呈递引发产生中和抗体的B细胞表位是最佳的。用于通过肽免疫原的最佳结构域呈递的框架可以受到小至一个氨基酸位置改变影响。检查VP1衣壳蛋白的构象结构的可用分子模型,并评估这些高变区内的序列比较,以确定对VP1具良好交叉反应的合成免疫原应包括环状结构域的延伸片段。
基于如表8中所示的血清型A的FMDV A12的序列,制备覆盖aa134-159或aa134-169,具有VP1靶位点的肽免疫原。确认仅含有肽的组合物或还包括FMDV内源性Th表位或外源Th表位用于补充的T细胞辅助的组合物中的肽免疫原性。并且,还对具有或不具有环化限制(cyclicconstraints)以稳定环状结构的肽进行的免疫原测定。可通过在特定位置上用半胱氨酸残基置换氨基酸形成二硫键(如,VP1位置134(N->C)与158(Q->C))促进肽的环化。
评估含有各种肽的组合物在豚鼠中的免疫原性。表9提供获自各种肽的评估的实验结果。表9显示:
i.较长的肽构建体提供更佳的中和反应。例如,相较于SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97提供更好的中和反应。此外,也证明了靶位点的进一步延伸至129残基(SEQ ID NO:99)对于某些应用时有价值的。
ii.相较于不含环化结构的肽,环化的肽提供更高的中和活性。例如,相较于SEQ ID NO:97,环化肽SEQ ID NO:98提供更高的中和活性。
iii.相较于不含此种表位的肽结构,通过来自连接于FMDV VP1结构域的人工Th表位(SEQ ID NO:24)的Th位点提供的外源Th产生较高的中和效力。例如,相较于SEQ ID NOs:99,98,97与96,SEQ IDNO:100提供更佳的中和活性。
iv.通过在组合物中添加外源Th表位进一步增强免疫原性。
由这些结果可知,含有由第129至169位氨基酸的延长的VP1靶位点的环肽是最具免疫效力的(例如,SEQ ID NO:99)。
c.血清型-特异的VP1靶位点的设计
检索由英国Pirbright的世界参考实验室所提供的对于全球FMDV的FMDV序列数据库,以获得来自O,A,亚洲,C,与其它血清型的亚型的可变VP1环状结构域(第129-169位的氨基酸)。接著,如表2中所示的,设计每个位置的共有氨基酸。制备如表8所示的在单个位置具有多种氨基酸的组合文库靶序列(SEQ ID NOs:101与102),以包括VP1环状结构域的更广泛的抗原变异性。
使用单一共有序列(表11,SEQ ID NO:25)的免疫原性试验与使用组合文库靶(表10,SEQ ID NO:98与99)进行免疫原性试验的比较,显示,对于这两种方式,共有序列提供涵盖由对于免疫原性的基于VP1的ELISA效价测定以及由对于各血清型的FMDV病毒株的中和指标判断的血清型覆盖的广度的同等效力(表10与11)。因此,为了便于制造与QC,选择单一共有序列的环化的靶VP1位点与一些选自基于区域需要特定血清型的特定VP1序列,如SEQ ID NOs:2-23与25-33中所示。
d.增强VP1免疫原性的有效Th表位的选择
先前的研究中,鉴定了FMDV抗原中的Th位点,如VP121-40表位,并将它们并入其合成VP1免疫原的设计中。然而,在猪与牛中的免疫原性研究已显示,由于目标动物的有限的混杂与遗传限制,这些FMDV内源性Th位点无法完全有效地增强目标动物中的VP1免疫原性。因此,不使用部分有效的FMDV Th表位,而以更有效的人工Th表位取代以增强FMDV VP1环状肽免疫原。所述人工位点合并包括组合文库库Th位置的Th基序,这样设计以容纳遗传多样的群体的可变T细胞相应性。Th表位中的此种改变导致潜在同源抗-FMDV记忆反应的缺失(在暴露的情况下),但提供更宽广且更有效的免疫应答性。已证实所述人工序列(SEQ ID NO:24)在多个物种,包括猪中的免疫效力。
由表10概括的用于实验中的构建体包括人工位点(SEQ IDNO:24),作为间隔子的ε赖氨酸,以及设计为组合文库(SEQ ID NOs:101与102)的O或亚洲血清型的第134至169位氨基酸的环化VP1靶位点。由免疫的豚鼠的抗体与中和反应(以中和指数表示)显示,两种结构都具有免疫原性。
表11显示豚鼠对具有通过ε赖氨酸间隔子连接于具有共有O序列的(SEQ ID NO:25)从第129至169位氨基酸的环化VP1靶位点的位点(SEQ ID NO:24)的类似O血清型免疫原的响应性。在初始免疫后3周有效的广泛的中和抗体反应证实,该含有O共有序列的VP1构建体也显示强的免疫原性(表11)。
e.中和反应预料不到的广度
在表10和11中,分析中和活性的豚鼠免疫血清显示出预料不到的宽广的中和作用。特别是,SEQ ID NOs:101与25的O血清型免疫原引发对抗两种O亚型的中和抗体,且还提供对来自A,亚洲血清型的亚型的中和作用。这些结果提示FMDV免疫原通过个别免疫原对多种血清型具有宽广的有效性的潜力。
当来自免疫和攻毒的猪的血清展示针对O中国台湾,OManisa,O坎波斯与O缅甸的中和指数的广度时,还可以通过将如表12所示的多种免疫原(含有SEQ ID NOs:25,27与28三种肽的混合物的UBI FMDV O疫苗)结合入单一疫苗中,以提供血清型中和作用的此种广度。
f.猪的免疫/攻毒试验
在猪(目标动物)的三个分开的免疫/攻毒试验中,已证实对于FMDV的第一个Untied Biomedical,Inc.(UBI)合成肽疫苗,FMDV-O疫苗,针对FMDV O1中国台湾株的感染攻毒有保护性。此试验在三个分开的机构中完成,包括国立中国台湾动物科技研究所(National Institute ofAnimal Health中国台湾,NIAHT)与美国农业部梅岛动物疾病中心(USDAPlum Island Animal Disease Center,PIADC)。
这些实验的结果概括在表13中。向第1-4组给予2个剂量的FMDV-O共有(SEQ ID NO:25,肽2570)疫苗。剂量范围为25,50,100至300μg(第1-4组)。第5-7组为安慰剂对照。
通过注射104.5TCID50的FMDV O1中国台湾病毒(病毒培养于幼仓鼠肾细胞或猪中)至蹄球(heel bulbs)中对所有猪进行攻毒。在其最后一次免疫后,以2至10周的间隔对猪进行攻毒。所有经免疫的猪被保护,包括经15 -免疫的猪。保护性免疫在经-免疫的猪持续10周。还获得了如由实验免疫但未攻毒猪中的中和抗体显示的,在最终免疫后高达20周仍具有保护性免疫的证据。
所有的接种动物具有显著的中和抗体的血清水平,且在攻毒中被保护。通过安慰剂免疫的猪的100%感染率建立了用于3个分开的试验中的病毒攻毒储存的病毒传染性。因此,所有3次试验的结果都被验证。鉴于获得的结果,仅免疫2次,剂量大小为25μg(第1组),FMDV O共有(SEQ ID NO:25,肽2570)疫苗即提供完全的保护性免疫。
g.被攻毒的猪保护性免疫的广度
使用含等量的三种VP1O构建体(含有来自分别以SEQ ID NOs:25,27与28表示的毒株2570a共有,OOzk/93,O缅甸的序列)的FMDVO疫苗,以每剂25μg的剂量进行另一种攻毒研究,并且在第0与3周以两剂量方案免疫。类似地,所有的六只猪以FMDV O1中国台湾攻毒,并且所有都被保护。从六只用于攻毒试验的经免疫的猪收集血清,并对测定高度流行的FMDV O亚型,O1中国台湾,OManisa,O缅甸与O坎波斯的中和抗体(表12)。所有猪产生具稳固免疫性的O1中国台湾中和抗体水平,其也含有针对OManisa,O缅甸与O坎波斯更强的中和反应,表明跨O血清型亚型的更可靠保护性免疫。
h.反刍动物中的免疫原性
在12只山羊的免疫原性试验中显示,反刍动物物种中FMDV-O共有(SEQ ID NO:25,肽2570)疫苗的免疫原性。山羊在第0和8周免疫山羊2剂,或于第0,4和8周免疫3剂。剂量为30μg,100μg或300μg。通过确定针对FMDV O1中国台湾的中和抗体的血清水平来评估有效性。在第8周最后免疫后12周(即经过20周的研究时期)获得预期保护的中和抗体水平。两次剂量或三次剂量的计划皆同样有效,且30μg剂量与300μg剂量一样有效。因此,当以2或3个剂量施用时,以与在猪中用于保护性免疫的剂量大小与疫苗制剂相当的剂量大小与疫苗制剂,对于FMDV-O疫苗在目标反刍动物中已显示出免疫原性。
i.结论与研究结果的解释
上述实验结果可总结如下:
于3个国际机构的4个实验组中进行的研究中,在以剂量为每剂25μg,50μg,100μg与300μg剂量两次施用后,基于FMDV VP1的疫苗(SEQ ID NO:25)有效地保护所有(15/15)经接种的猪抵抗FMDVO中国台湾的攻毒。所有(10/10)对照动物在病毒攻毒的第2天都被感染。
含有VP1O构建体的混合物的FMDV O疫苗(等比例的SEQID NOs:25,27与28,初始免疫后第0和3周施用两个剂量,每剂25μg)在猪中针对多种FMDV O型分离株,包括O中国台湾,O坎波斯,O缅甸与OManisa,诱导宽广的保护性中和抗体。
FMDV O疫苗在反刍动物(山羊)中展示与猪中看到的相当的免疫原性。此结果预期,以与对于猪的免疫原性剂量范围相当的剂量范围,本UBI制剂在牛中将是有效的。
个体合成FMDV免疫原在豚鼠中同时诱导针对A,O与亚洲1血清型的中和抗体,显示对跨多种血清型的预料不到的宽广效力的潜力。
使用O共有血清型序列的FMDV O肽可诱导针对多种血清型,包括来自A,亚洲1与O血清型的亚型的中和抗体(通过中和指数测量)。
FMDV疫苗免疫原本质上为“功能性位点”指向的和合成的。制剂疫苗为安全的,有效的,具有宽广的中和作用的,可重复的,与稳定的,因此避开与传统灭活病毒疫苗有关的生产与品质控制相关困难与缺点。
完全安全的化学定义的疫苗的可用性可以通过鼓励接种,甚至在几乎无FMD状态的地区接种,可促进将FMDV根除。
实施例7
作为适应地区需求的基于FMDV肽的多价疫苗的关键组分的合成的FMDV肽免疫原的肽同源物
就销售而言,口蹄疫疫苗传统上代表了全球兽用疫苗市场中最大的份额,为全部家畜生物交易的26.4%。由于FMDV血清型与亚型的高度变异,因此,针对世界的特定区域(在许多情况下,是针对其内的特定国家或区域)定制传统基于病毒溶解物的抗原组成的FMD疫苗。,在FMD-流行区域中的疫苗目前的使用需要深入研究疾病的流行病学与疫苗一致性(vaccineharmonization)研究以(1)确定疫苗针对目标地区内流行的毒株是否是有效的,与(2)确保疫苗实际属性适合用于控制与移除。
随著分子病毒学的来临,可容易地通过反转录相关聚合酶链反应(RT-PCR)从来自根据国家监测实践中提交的FMD病例的组织样品以及从FMDV爆发收集的多个组织与食道探针(probang)样品获得的病毒分离株,扩增口蹄疫病毒的大部分的衣壳蛋白VP1序列。可以比对鉴定的VP1序列。所述比对包括具与其它指定的分离株遗传相关的血清型的序列。可容易地基于代表对于地区性鉴定的FMDV爆发的本发明建立的氨基酸框架(VP1 129-168)与此框架的肽同源物(表2,SEQ ID NOs:2-23)获得在目标地区流行的毒株的VP1序列,且在疫苗制剂中包括此种设计的VP1肽同源物(表3,SEQ ID NOs:25-33)以针对特定地区需求定制,保证其用于控制与根除的适用性。
当以两个剂量或更多剂量施用时,作为关键成分的,含有源自合成FMDV肽免疫原(具有VP1aa129至aa168)的肽同源物的特定制剂包括表14中所示的实例:
(a)具有肽同源物(SEQ ID NO:25)的单价猪FMDV O血清型疫苗;
(b)具有等重量比的两种肽同源物(SEQ ID NO:25与28)的混合物的二价猪FMDV O血清型疫苗;
(c)具有等重量比的三种肽同源物(SEQ ID NO:25,27与28)的混合物的三价猪FMDV O血清型疫苗;
(d)用于亚洲,具有等重量比的两种肽同源物(SEQ ID NOs:25与29)的混合物的二价牛/反刍动物FMDV O与亚洲1血清型疫苗;
(e)用于中国,具等比例的三价牛/反刍动物FMDV O,亚洲1江苏与A甘肃血清型疫苗(SEQ ID NOs:25,29与31);
(f)用于巴西,具等比例的三价牛/反刍动物FMDV O坎波斯,A24与C因达亚尔疫苗(SEQ ID NOs:26,30与32);
(g)用于阿根廷,具等比例的三价牛/反刍动物FMDV O坎波斯,A24/阿根廷2001与C因达亚尔疫苗(SEQ ID NOs:26,30,33与32)。
可通过用如实施例1描述的基于特定FMDV VP1序列的肽ELISAs检测对于来自不同分离株的FMDV VP1抗原的相对免疫原性与交叉反应评估最终疫苗制剂中所使用的设计的肽同源物的适用性。
如表15至17中所示,基于VP1同源物的疫苗制剂(a)至(g)(含有SEQ ID NOs:25-33的同源物)满足特定地区的需要(如,中国,东南亚,巴西与阿根廷)。特别是,这些制剂对于目标血清型(如,O中国台湾,O坎波斯,OOzk,O缅甸,亚洲1,A甘肃,A24,A阿根廷2001,C因达亚尔)的VP1序列提供所需的免疫原性。此外,对于这些FMDV疫苗制剂,还观察到如通过其针对目标血清型,包括,但不限于O中国台湾99血清型诱导中和抗体的能力来证明的功能性免疫原性(如实施例6,表12中描述的)。在免疫计划中,当以2个剂量施用时,诱导总FMDV中和抗体的用于疫苗制剂的基于VP1的B细胞成分可低至每剂量25μg。
实施例8
以仅含VP1蛋白衍生的B细胞表位簇肽的FMDV疫苗制剂在单次施用时,无法作为紧急疫苗来抵抗FMDV攻毒
如在实施例7中描述的,制备并入合成的FMD肽同源物的特定制剂。在施用两个或更多剂量后,这些制剂能够诱导猪与牛/反刍动物的FMDV中和免疫应答。然而,若依据OIE攻毒程序所需的仅单次施用制剂,这些制剂不能持续地保护猪与牛抵抗FMDV的病毒攻毒。由于使用单次施用,这些制剂不能提供给动物完全保护,造成了基于VP1肽同源物的FMDV疫苗制剂商业化的严重困难。
密切回顾所有VP1同源物疫苗制剂的中和抗体的动力学,揭示了在单次施用后高达四周,中和抗体效价仍低或接近于背景效价(≤3)(图3A与3B)。猪与牛中的中和抗体效价仅在第4周的第二次接种后第6周提升到显著的高水平(图3A与3B;表15-17)。此种高效价中和抗体的延迟产生,提示基于VP1的肽疫苗中缺少某些免疫应答元件(或降低所述元件的水平)。这些缺乏/降低的元件似乎存在于基于FMDV病毒溶解物的疫苗中,其能够作为紧急疫苗的产生保护。
在暴露于病毒时,引起病毒复制显著降低的初始与快速的回忆(recall)应答,可以为单次施用时,从在完全保护性免疫应答中所需的基于VP1同源物的疫苗制剂缺少的元件。如由在图3A与3B中与表15至17显示的中和抗体效价的显著提升所证明的,当外源表位连接至VP1肽同源物时,在二次或更多次施用后,产生有效的T辅助细胞反应。然而,紧急疫苗必须在以单次施用疫苗制剂后快速且显著地引发动物的免疫系统,以在病毒感染时有效提供快速的回忆应答。
以下实施例描述了通过使用含有源自多成分FMDV的B与T表位的疫苗制剂评估的快速反应(fast-acting)的T细胞应答的实验。
实施例9
用于单次施用紧急疫苗的基于多成分B与T表位的FMDV疫苗制剂的原理,筛选,鉴定与优化
如实施例8中所述,仅使用FMDV VP1衍生的B细胞表位簇肽的组合在紧急FMD疫苗制剂的研发方面的重复尝试,单次施用时,在初始免疫后第3至4周时,不能持续地产生高效价的中和抗体。因此,这些制剂在FMDV攻毒时不能保护动物。花费大量的努力以鉴定用于开发成功的高效力紧急FMD疫苗所需的免疫元件。
商业化的基于FMD病毒溶解物的紧急疫苗诱导未经实验的猪γδT细胞增生,且这些未经实验的猪γδT细胞在暴露于FMD疫苗病毒抗原后,表达各种细胞因子/趋化因子mRNA。在接受高效力紧急FMD疫苗的动物中观察到的一个显著的变化为高水平地全身性产生细胞因子,包括IFN-γ(Cox 2003)。在FMD病毒攻毒与恢复后,当用FMDV抗原立即体外刺激来自FMD免疫猪(接种并病毒攻毒的动物)的PBL时,γδT细胞为发现的主要增殖亚群,表明此种γδT细胞增殖可能是某些病毒感染的特征。观察到γδT细胞和MHC II类+CD4+细胞间的细胞相互作用为显示明显突触形成的细胞簇,并且此种相互作用展现为T细胞增殖可被针对MHC II类与CD4的单克隆抗体阻断,表明γδT细胞通过MHC II类的抗原呈递能力(Takamatsu 2002)。γδT细胞参与发炎的诱导与差别细胞因子的产生,揭示γδT细胞在免疫调控(控制先天与后天免疫应答)方面的重要作用。这些细胞可能具有与专业的抗原呈递细胞(APC)有关的特性。γδT细胞参与在基于病毒溶解物的高效力紧急FMDV疫苗中产生针对FMDV抗原的快速免疫应答方面的重要性,促使我们通过体外测量IFN-γ的产生作为由FMDV内源性Th表位簇肽介导的T细胞活化开始的指示剂,来广泛地评估对于我们的基于合成的肽的高效力紧急FMD疫苗中包含一种或更多种FMDV内源性T表位簇肽的设计,筛选和选择。
如在实施例3中描述的,利用特定T细胞功能测定以筛选及鉴定源自于FMDV蛋白VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,3A,3B与3D的抗原片段的FMDV内源性Th表位簇肽,其可被源自以(a)FMDV病毒溶解物疫苗与(b)含FMDV候选Th肽的肽制剂免疫的宿主的猪和牛T细胞识别。
a.通过体外检测IFN-γ产生作为免疫T细胞活化开始的指示剂,鉴定动物猪与牛中FMDV内源性Th簇肽
在体外刺激时,以掺有FMDV内源性Th表位肽制剂免疫的动物引发的T细胞释放IFN-γ,且持续地增强FMDV中和抗体的产生。由于此种测定更易于再现,并且因此已被用作用于评估效力和用于鉴定包含在最终FMDV疫苗制剂中的FMDV内源性Th表位簇的大量筛选测定。
通过首先测试具有显示结合MHC II类的基序簇的序列的肽诱导获自FMDV O中国台湾99病毒溶解物疫苗免疫的,之后攻毒且恢复的猪或牛的外周血单核细胞(PBMCs)的培养物中IFN-γ反应的能力,进行T细胞表位簇肽免疫原的设计。从该筛选,将能够诱发低,中与高IFN-γ产生的肽分组用以进一步筛选和设计疫苗制剂的掺入。图1显示选择的B与内源性T细胞表位在FMDV VP4,VP2,VP3,VP1,2B,2C,3A,3B,3C与3D蛋白上的分布/定位,其通过实施例1与3中描述的方法鉴定,并用于之后疫苗制剂的应用。
源自FDMV O中国台湾99毒株的各T细胞表位簇肽的序列如表4(SEQ IDNOs:34-63)所示。将FMDV Th肽与在表5中显示来自其它FMDV毒株的同源FMDV T辅助细胞表位序列(SEQ ID NOs:64-78)进行比对。为了改善这些疏水肽抗原的溶解度,在个体T辅助细胞肽免疫原的N端添加三个赖氨酸残基(KKK)。将含有一些或所有等重量比的Th肽免疫原(SEQID NOs:34-87)的T细胞簇肽库用作补充物,加至疫苗制剂中的VP1肽同源物混合物中,以进一步增强猪与牛中FMDV B细胞簇肽免疫原的免疫原性。将这些疫苗制剂用于大量的实验,其中在单次施用后体外测量/评估第0与3周的中和抗体效价,作为体内保护效力的指示(表18,19)。这些汇集的FMDV Th肽也可用作细胞介导的免疫的FMDV T细胞肽免疫原。
为了进一步扩大T细胞表位对具有不同遗传背景动物的覆盖度,还设计了基于9种不同的T表位特异的同源序列的组合肽(表19,第7组,SEQ ID NOs:79-87)。同样地,将三个赖氨酸(KKK)添加至各组合T表位簇肽免疫原的N端,以改善其水溶性以供进一步制剂使用。这些T表位簇组合肽免疫原库也用作疫苗制剂的辅助,以进一步增强FMDV VP1B细胞表位簇肽免疫原的免疫原性,并且其本身为用于细胞介导的免疫的FMDV T细胞肽免疫原(表19)。
经过大量的测试,优选的猪FMDV内源性Th簇肽的列表为SEQ IDNOs:61至63;且牛的为SEQ ID NOs:34至60。通过在Th表位簇肽的N-端加上赖氨酸残基(如,KKK)使这些肽可溶。可通过基于用于组合文库序列设计(如,O,亚洲1,A,C等)的血清型的各Th表位制备组合肽序列以增强这些肽的免疫原性,且进一步以盒的形式将选择的各FMDVTh簇肽(为单一序列或组合序列)连接至表位(SEQ ID NO:24),形成为组合FMDV Th构建体(combo FMDV Th constructs)。具有这些特征的典型序列显示于表7中,为SEQ ID NOs:88至95。
由于牛特别多样的遗传背景,测试可引发接受已含有优化的FMDV B表位簇VP1肽疫苗制剂的动物中抗原特异性T细胞反应起始的源自大的肽库的预选择的FMDV内源性Th肽的不同组合,在动物体内的普遍免疫原性(表19)。动物中仅单次施用此种疫苗制剂引发抗原特异性T细胞反应起始的能力是疫苗能够在猪和牛中产生中和抗体的高效价的例子(表18与19)。在没有这些FMDV内源性Th表位簇肽的情况下,对于仅含有VP1性肽免疫原同源物的各制剂,在单次施用此疫苗(图3A与3B)后,于初始免疫后第0,3周,仅能够产生可忽略的(即<=3)的中和抗体效价。
制备了简单的FMDV疫苗制剂,其含有(1)来自O血清型的FMDVVP1B免疫原(SEQ ID NO:25);(2)10%(以重量计)的设计的FMDV Th表位肽构建体(SEQ ID NO:90);和(3)以盒形式被(SEQ ID NO:24)连接的三种猪FMDV Th表位。给予猪单次施用此制剂,并体外从PBMCs和体内通过血清的定量ELISA分析测量IFN-γ量的水平(如在实施例3中描述的),持续超过四周。如图4A与4B所示,在此研究中观察到接种后增加的IFN-γ的产量水平。
此发现进一步证实,在免疫后,选择的FMDV内源性Th表位簇可立即诱发经免疫宿主的T细胞。在以天然感染或通过攻毒研究暴露于FMDV时,暴露的病毒抗原通过先前由FMDV疫苗T辅助细胞肽抗原所引发的记忆T细胞,起始抗原特异性T细胞反应的开始。甚至在仅单次施用各疫苗制剂后,这些仔细选择的存在于FMDV VP1,VP2,VP3,VP4,2A,2B,2C,3A,3B与3D蛋白上的免疫显性Th表位提供FMDV相关Th细胞的预先引发(prior priming),且在暴露于FMDV时,在免疫的宿主中引发显著的淋巴细胞增殖反应,导致细胞因子的产生,包括IFN-γ。已知细胞因子在针对动物体内多种细胞病变病毒感染的细胞介导的免疫应答中发挥重要作用。
b.如以中和作用测定确定的,鉴定用作猪与牛中的紧急疫苗的最佳疫苗制剂
通常发现,经接种与攻毒的动物中,对于掺有FMDV内源性Th表位簇肽的制剂,比没有所述肽的那些,有显著更高的对FMDV淋巴组织增生反应。肽制剂中包括特定T细胞表位,允许引发可更有效地识别在之后的遭遇病毒的情况下呈递的病毒表位的T细胞。
IFN-γ是巨噬细胞的主要激活剂,增强其抗菌的活性和处理与呈现抗原给T淋巴细胞的能力。已报道,IFN-γ刺激抗原呈递细胞中的MHC表达,并有效地抑制FMDV复制。因此,这些早期机制的活化对于在单次施时诱导紧急疫苗所需的针对FMDV的保护性免疫应答是相关的。在FMDV内源性Th表位簇肽存在下,将活化与FMDV VP1反应的B细胞,导致快速的B细胞增殖与抗体产生。这些FMDV内源性Th表位簇肽也会活化T辅助细胞,导致细胞因子分泌,以形成产生B细胞记忆的合适的环境。这些发现提示,相较于只有VP1B肽,由组合的VP1B肽与内源性Th肽,提供更好的临床保护,其主要归因于诱导更有效的淋巴增殖反应与IFNγ释放,其还导致更好的诱导,因此更高的中和抗体效价为此早期事件的部分。
使用标准中和测定用于疫苗制剂的筛选,所述疫苗制剂最好将诱发紧急疫苗所需的此种体内早期保护性免疫应答。对收集的免疫的猪(表18)与牛(表19)中初始免疫后三周的血清进行评估。由于中和抗体测定被用作替代试验,以取代被某些国家机构作为紧急FMDV疫苗的释放标准的部分的昂贵且繁琐的身体攻毒试验,因此通过在实施例2中简述的此替代性中和抗体测定,进行用很多使用源自FMDV VP1的B与内源性Th表位簇肽的不同组合与比例的FMDV疫苗制剂的系统性研究,并评估其各个保护效力。
特别是,对于分别为8-12周龄的猪与6-12月龄的牛,于第0周用基于多成分B与T表位肽的不同组合的FMDV疫苗制剂对每组3至5头无FMDV的动物进行免疫,单次施用后,对收集的血清进行中和抗体效价测试。
1.猪
来自猪研究的13组动物的数据示于表18中。如以下描述的制备这些实验中所使用的制剂。将所有猪以1mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第1组-仅含有原形FMDV VP1O共有肽(SEQ ID NO:25)。
第2至4组-将原形FMDV VP1O共有肽(SEQ ID NO:25)与等重量比的内源性FMDV Th肽(如,SEQ ID NOs:34-63,SEQ ID NOs:61-63或SEQ ID NO:90)的混合物(B∶Th的重量比为10:1)组合,使用ISA50V2(Seppics,France)作为佐剂,含0.1%Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物制备。
第5至7组-以总量25μg/mL,等重量比的FMDV VP1O共有(SEQ IDNO:25)与OOzk(SEQ ID NO:28)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的内源性FMDV Th肽(如,SEQ ID NOs:34-63,SEQ ID NOs:61-63或SEQ ID NO:90)混合物(B∶Th的重量比为10∶1)组合,使用ISA50V2(Seppics,France)作为佐剂,含0.1%Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物免疫。
第8至10组以总量25μg/mL,等重量比的FMDV VP1O共有(SEQ IDNO:25)与OOzk(SEQ ID NO:28)与O缅甸(SEQ ID NO:27)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比内源性FMDV Th肽SEQ ID NOs:34-63,SEQ ID NOs:61-63,与SEQ ID NO:90的混合物(B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物免疫。
第11至13组以总量25μg/mL,等重量比的FMDV VP1O共有(SEQ IDNO:25)与OOzk(SEQ ID NO:28)与O缅甸(SEQ ID NO:27)与亚洲1江苏(SEQ ID NO:29)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的内源性FMDV Th肽(如,SEQ ID NOs:34-63,SEQ ID NOs:61-63与SEQ IDNO:90)混合物(B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)作为佐剂,含0.1%Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物免疫。
综上所述,在不同时间点开始各研究时,所有猪在第0周无FMDV抗体。单次施用含有多种源自FMDV VP1的B与内源性Th表位簇肽的多成分FMDV疫苗制剂,诱导大量针对目标性肽(或其中之一)O共有(SEQ IDNO:25)的抗体的产生,经ELSIA,Log10效价为介于2至3之间(即,10E2至10E3)。
2.牛
来自牛研究的32组动物(每组3头牛)的数据显示于表19中。如以下所述制备这些实验中所使用的制剂。将所有的牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第1至8组从将原形FMDV VP1O共有肽(SEQ ID NO:25)与等重量比的内源性FMDV Th肽(包括SEQ ID NOs:34-63(30种Th);SEQ ID NOs:34-39,44,46-51,53-63(24种Th);SEQ ID NO:34-39,44,46-51,53-60(21种Th);SEQ ID NOs:34,36,37,40-43,45,48,52,53,60-63(15种Th);SEQ ID NOs:34,36,37,48,50,53(6种Th);SEQ IDNOs:62-78(17种Th同源物);SEQ ID NOs:79-87(9种Th短文库);和SEQ ID NO:88,89(2种增强Th盒)的混合物分别组合(所有的B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物制备。
第9至11组以总量50μg/mL,等重量比的FMDV VP1O共有肽(SEQID NO:25),OOzk(SEQ ID NO:28)和O缅甸(SEQ ID NO:27)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:88,89(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒),与SEQ ID NOs:34,36,37,40-43,45,48,52,53,60-63(15种Th)的内源性FMDVTh肽混合物(B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第12至16组以总量50μg/mL等重量比的FMDV VP1O共有肽(SEQID NO:25),OOzk(SEQ ID NO:28),O缅甸(SEQ ID NO:27)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:34,36,37,40-43,45,48,52,53,60-63(15Ths)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为1∶1,5∶1,10∶1,50∶1与100∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第17至19组以总量50μg/mL的等重量比FMDV VP1O共有性肽(SEQID NO:25),OOzk(SEQ ID NO:28),O缅甸(SEQ ID NO:27),亚洲1江苏(SEQ ID NO:29)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:34,36,37,40-43,45,48,52,53,60-63(15种Th);SEQ ID NOs:88,89(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第25与26组以总量50μg/mL等重量比的FMDV VP1O共有肽(SEQID NO:26),A24(SEQ ID NO:30)与C因达亚尔(SEQ ID NO:32)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第27与28组以总量50μg/mL等重量比的FMDV VP1O共有肽(SEQID NO:26),A24(SEQ ID NO:30)与C因达亚尔(SEQ ID NO:32)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为10∶1),使用Emulsigen D(12%)为佐剂的50+5μg/mL油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第29与30组以总量50μg/mL等重量比的FMDV VP1O坎波斯(SEQ IDNO:26),A阿根廷2001(SEQ ID NO:33),C因达亚尔(SEQ ID NO:32)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有等重量比的SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为10∶1),使用ISA50V2(Seppics,France)为佐剂,含0.1%Tween 80的50+5μg/mL的油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
第31与32组以总量50μg/mL等重量比的FMDV VP1O坎波斯(SEQ IDNO:26),A阿根廷2001(SEQ ID NO:33),C因达亚尔(SEQ ID NO:32)作为FMDV疫苗B细胞成分,分别辅以等重量比的具有SEQ ID NOs:91,92(2种增强Th盒);SEQ ID NOs:91,93-95(4种增强Th盒)的内源性FMDV Th肽混合物(并且B∶Th的重量比为10∶1),使用EmulsigenD(12%)为佐剂的50+5μg/mL油包水乳化物免疫。所有牛以2mL的乳化液作为疫苗制剂进行免疫。
综上所述,当各研究在不同时间点开始时,所有牛在第0周无FMDV抗体。由于其它相关的不同血清型的VP1B免疫原(主要由于这些VP1肽免疫原间的高度交叉反应)通常伴随有Log10效价范围通常介于2至3的效价,单次施用含多种源自FMDV VP1的B与内源性Th表位簇肽的多成分FMDV疫苗制剂,甚至当目标肽为B成分片段时,允许产生大量针对目标性肽(或其中之一)O共有(SEQ ID NO:25)的抗体。
出人意料的,具有宽范围B∶Th肽比例的制剂有效诱导受测试动物中的免疫应答。即,对于包含此种FMDV内源性Th簇肽的%范围可以从低至1%(即Th对B比为1∶100)到高至50%(即Th对B比为1∶1)(参见牛免疫试验的第12至16组),这些制剂为在诱导动物中在其初始免疫后3周收集的血清中的中和抗体的显著提升有效制剂。
一般来说,最终基于肽的FMDV疫苗制剂中选择10%至20%的FMDVTh簇肽对FMDV VP1B表位簇肽的比例(即1∶5或1∶10的比例),在动物中通过肌肉内注射途径接受单次施用FMDV疫苗制剂产生平衡的B与T免疫应答。
实施例10
接受作为单次施用紧急疫苗的基于多成分B与T表位的FMDV疫苗制剂后,保护动物猪与牛抵抗FMDV病毒攻毒
a.猪中进行的攻毒研究:
以设计用于单次施用的紧急疫苗,在初始免疫后3周收集的血清中产生显著中和抗体效价提升的,优化的基于多成分B与T表位FMDV疫苗制剂,在台中,中国台湾进行6次额外的攻毒研究以评估和证实之前实施例9中测试的选择的各制剂的保护效力。
特别是,在接种的动物上使用FMDV O中国台湾的毒株的FMDV攻毒研究。依照类似的方案/方法进行攻毒研究。在本实施例(以下)中详细描述了一种代表性的/典型的攻毒研究。特别是,在表20至24中详细描述/评估了如表20(对应于表25中所示的研究II的第5,6和7组;研究IV的第12,13和14组;以及研究V的第15,16,17,18与19组)中显示的攻毒研究。以总结的形式分别在表25,26中提供了猪与牛中进行的此种攻毒研究中包括的其它组别。
动物:在攻毒研究中利用32只,8周龄的SPF杂交猪(0wpi)。猪无FMD,且先前未用FMD疫苗免疫(即未经实验的)。将猪安置于行政院农业委员会动物卫生研究所(Animal Health Research Institute(AHRI),Council of Agriculture,Executive Yuan)。从初始免疫至攻毒研究完成,在AHRI进行该研究。
特别饲养条件:依据现实情况,将不同组别安置于公用笼子中。将对照组安置于独立的房间。将出现感染病征的动物移至隔离的房间。
病毒:FMDV OTAW/97K病毒株。
试剂盒:使用如实施例1中描述的FMDV非结构蛋白ELISA试剂盒与FMD肽2570a EIA滴定试剂盒。
分组:将32头猪随机分成11组。动物ID编号,剂量体积,注射途径,和注射位点总结于表20中。
采血时间表:在接种后周数(WPV)0,2,4周和攻毒后天数(DPC)14天。
接种:接种是在0WPV以分别指定的剂量施用。
攻毒时间表:在免疫后4周,对接种与控制的猪用FMDV O-中国台湾(猪传代病毒)通过SC途径在右前足的蹄球进行攻毒。病毒量为0.5ml(105TCID50)。
监测测定:病毒攻毒后,监测猪中FMD临床病征与症状的发展14天,且每天记录体温。
在表21中记录了病毒攻毒后猪的体温。在攻毒后天数(DPC)监测的14天中,猪的温度稍微提升,但大都低于40℃。
中和效价:在接种后周数(WPV)0,2与4周和14DPC对猪采血。从凝固样品通过离心收集每个动物的血清,并进行病毒中和测定。计算中和效价与几何平均值并显示于表22中。对于所有的制剂,都观察到剂量依赖的方式的显著中和抗体(NA)效价。尽管某些组的NA效价的几合平均值在4WPV时低于16,而所有实验组(100%)中的所有动物在14DPC时都受到保护,但对照安慰剂组或阴性对照中的两头动物中的两头都受到感染,并早在第2天就检测到临床病征。研究V的第19组使用基于FMDV病毒溶解物的O血清型疫苗(来自俄罗斯)作为阳性对照,其中所有三头动物在单次施用时都受到保护。
FMDV NS ELISA:在AHRI用FMDV非结构蛋白ELISA测定血清样品,结果如表23所示。在攻毒前,测试的所有实验组别都为未经实验的对FMDV NS蛋白不显示反应性。仅安慰剂阴性对照组的动物在14DPC显示对NS蛋白的阳性反应性,表明其感染特性。
抗-VP1(肽2570a)ELISA滴定:利用基于VP1肽2570a的ELISA(描述于实施例1中)测试抗-VP1抗体效价结果,结果显示于表24中。多数猪甚至在免疫后2周发展出显著的免疫应答。
当FMDV肽疫苗制剂包括其各个制剂中所示的内源性FMDV Th肽时,除了阴性安慰剂对照组外,无论其NA效价如何,所有实验组的动物都可被保护抵抗FMDV攻毒。
尽管实验组中在4WPV时的中和抗体效价的一些几何平均值低于16,所有猪仍都受到保护。这清楚表明,除了中和抗体外,在攻毒时保护动物方面还包括其它因素。以短或长盒形式包括内源性FMDV Th肽都证明其在单次施用肽疫苗制剂时诱导细胞免疫方面的关键作用。在与VP1环状肽组合时,可以存在多达30个FMDV Th(SEQ ID NOs:34-63)或少至3个先前精制与选择的Th(SEQ ID NOs:61-63)用以在猪中提供此种细胞免疫。并入来自FMDV VP1O同源物的序列的组合疫苗给出对猪抵抗O中国台 株的FMDV攻毒的相当的有效(如果不是更好)保护。在整个监测时期中,接受各疫苗制剂的实验组中未检测到针对FMDV NS蛋白的抗体,其进一步说明甚至在面临高剂量的FMDV病毒攻毒(高于10倍OIE所需的病毒剂量)时,也完全保护这些动物抵抗FDMV感染。在所有测试的制剂中,当与每剂2mL的那些相比时,仅接受每剂0.5mL的那些猪受到同等保护。
十三(13)组(第1-3,5-7,8-10与12-15组)使用FMDV O共有(SEQ IDNO:25)作为源自FMDV VP1的B表位免疫原。第16组使用FMDV O ,OOzk,O缅甸(SEQ ID NOs:25,28,和27),并且第17组使用FMDV O共有,OOzk,O缅甸与亚洲1江苏(SEQ ID NOs:25,28,27,与29)分别作为源自FMDV VP1的B表位免疫原(以相当的重量比)。剩余的组使用安慰剂对照。
如在表25中所述详细表明的,在所有这些制剂中,除了安慰剂对照组外,所有组中将内源性FMDV Th表位簇肽加至FMDV VP1B表位组分中。以每个研究的组施用每剂2mL,1mL,0.5mL进行研究II与IV以测试各疫苗制剂的效力(PD50)。监测所有实验动物的FMD临床病征超过14天的观察期。对于研究III的第8-10组,对从1∶1,5∶1与10∶1的不同比例的FMDV VP1O共有(SEQ ID NO:25)与增强FMDV Th盒肽(SEQID NO:90)进行测试。对于研究V,也以FMDV VP1组合肽免疫原与增强FMDV Th盒肽(SEQ ID NO:90)的分别对于第15组与第16组为5∶1和10∶1进行类似的不同比例的研究。
综上所述,将所有安慰剂或阴性(无注射)组的所有动物早到攻毒后第2天即被FMDV O中国台湾感染,表明所有的攻毒测试的有效性。尽管在这些攻毒研究中应用比OIE所需量高10倍剂量的FMDV病毒分离株,如由整个监测期中的阴性临床病征和FMDV NS ELISA为阴性反应证明的,在所有实验组中观察到对所有猪的完全保护。通过剂量研究计算PD50,表明在组II与IV中至少PD50>11.23。
30个FMDV Th表位肽(SEQ ID NO:34-63)中,选择3个FMDV Th肽(SEQ ID NOs:61-63)用于有效保护猪抵抗FMDV病毒攻毒。使用通过进一步连接于(SEQ ID NO:24)的N端的赖氨酸间隔子连接此3个肽的盒样设计(如SEQ ID NO:90中所示),增强这3个FMDV猪Th表位肽的呈递。此种FMDV Th表位肽可以以相对B肽免疫原的不同的比例辅以源自FMDV的VP1B表位肽免疫原,以提供针对FMDV病毒攻毒的保护。在研究V的攻毒测试中,当B表位肽组成以单价O血清型肽(SEQID NO:25,2570kb),或以O血清型组合(combo)制剂(SEQ ID NOs:25,28与27),或以多价O与亚洲1血清型组合制剂(SEQ ID NOs:25,28,27与29)存在时,在10%的内源性Th表位肽存在下,获得完全保护,表明VP1B表位肽的免疫原性方面的适应性。
b.牛攻毒试验:
在牛中,通过改良的肌肉内注射在颈背部施用1x 104TCID50的FMDV(牛感染单位或BIU)进行病毒攻毒。对于O血清型攻毒,使用OS/99毒株,且对于亚洲1血清型的攻毒,使用亚洲1高毒力株。在接受单次施用各FMDV疫苗制剂28天后进行攻毒下,每天检查动物,监测直肠温度,且基于病变的出现时间与数目和严重度确定保护分数(protection score)。所有活体动物实验在中国农业部的指导原则下进行。使用对剂量进行修改,如使用2X,1X与0.5X剂量的测试疫苗,来评估特定制剂的效力。为快速地筛选具保护效力的制剂,使用1X的剂量。为了评估疫苗制剂效力,依据实验设计与实验期间动物的可使用性,将动物分成每组3至5只动物。
在研究I中,接种含有作为疫苗制剂关键成分的优化的源自FMDVVP1的B细胞表位簇肽免疫原(SEQ ID NO:25),无任何内源性FMDV Th表位肽,或存在10%源自DT,TT,和PT类毒素蛋白的外源性Th表位肽的肽疫苗制剂的第1至4组中的动物(如表26中所示),不能保护动物抵抗FMDV OOS/99血清型毒株的攻毒。以优化的基于多成分B与T表位的FMDV疫苗制剂用于单次施用紧急疫苗,进行四次额外的攻毒研究以评估实施例9(如表26中所示)中测试的选择的代表性制剂的保护效力。
八(8)组(研究II与III的第6-8组和10-14组)使用FMDV O共有(SEQID NO:25)作为源自FMDV VP1的B表位免疫原。研究IV(第16组)使用FMDV O共有,OOzk,O缅甸(SEQ ID NOs:25,28,和27)作为源自FMDVVP1的B表位免疫原(以等重量比)。研究V(第18组)使用FMDV O ,OOzk,O缅甸,亚洲1江苏与A甘肃(SEQ ID NOs:25,28,27,29与31)作为源自FMDV VP1的B表位免疫原(以等重量比)。
在所有这些制剂中,除了安慰剂对照组与研究I中的那些实验组外,如在表26中所示详细表明地,将研究III的第10组的内源性FMDV Th表位簇肽SEQ ID NOs:34-63,(30个Ths);研究III的第11组的SEQ ID NOs:34-39,44,46-51与53-60(21个Ths)肽;研究II的第6至8组的增强FMDV Th盒肽的混合物(SEQ ID NO:88与89),和研究IV的第16组与研究V的第18组的其它4个盒FMDV Th肽(SEQ ID NOs:91,93,94与95)的混合物,加至FMDV VP1B表位组分中。
在各施用每剂2mL,1mL,0.5mL的疫苗制剂的组中,当各组中4/5,4/5,3/5的动物受到保护时,测试研究II的第6,7,8组的疫苗制剂效力,表明疫苗制剂显著的效力。
综上所述,安慰剂对照组中的所有动物,早在攻毒后第2天就被用于攻毒研究的FMDV OOS/99或亚洲1病毒感染,表明所有攻毒试验的有效性。如由整个监测期间受保护动物中的阴性临床病征证明的,所有试验组中获得显著的(4/5或3/5)或完全的保护。我们能够选择三十(30)个FMDV Th表位肽(SEQ ID NO:34-63)中的等重量比的二十一(21)个(SEQ ID NOs:34-39,44,46-51,53-60)(21个Ths),等重量比的十五(15)个Ths(SEQID NOs:34,36,37,40-43,45,48,52,53,60-63)(15个Ths),与最终等重量比的六(6)个FMDV Th肽(SEQ ID NOs:34,36,37,48,50,53)(6个Ths),用于对不同遗传背景的牛的有效保护。,通过将三个Th肽以赖氨酸间隔子连接形成盒样设计(cassette like design)并随后将其连接至(SEQ ID NO:24)的N-端,作为FMDV Th盒肽(SEQ ID NOs:88,89,91,92,93,94,95),以增强这15个和进一步减少至六(6)个的FMDV牛Th表位肽的呈递。可以以10%或20%将此种FMDV Th表位盒肽补充至源自FMDV VP1的B表位肽免疫原,以帮助产生更需要的FMDV T细胞免疫。在研究IV与V中,10%的选自12个以盒形式存在于四个增强肽(SEQ ID NOs:91,93,94,95)上的FMDV Th表位的内源性Th表位肽的存在下,同时B表位肽组成以组合O血清型制剂(SEQ ID NOs:25,28,和27),或以多价血清型O,亚洲1与A甘肃制剂(SEQ ID NOs:25,28,27,29,与31)存在时,分别在由FMDV OOS/99血清型株(研究IV)或高毒力FMDV亚洲1株(研究V)攻毒下,达到第16和18组的4/5的动物的保护,表明VP1B表位肽的免疫原性方面的适应性。
实施例11
预防牛中FMD巴西O型病毒/A24/C因达亚尔病毒感染的FMDV多价疫苗口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(巴西)的样品产品插页(sample product inserts)
以下为用于巴西与中国FMD多价疫苗口啼疫(FMD)合成肽疫苗的样品产品插页。
a.巴西
用于注射的无菌油包水(STERILEWATER-IN-OIL)乳化物
注意:仅用于动物。
说明:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(巴西)为含有三种FMD VP1合成肽构建体的油包水乳化三价疫苗。各肽构建体由具有来自基于特定南美区域需求的巴西O,A24与C因达亚尔血清型口蹄疫病毒(FMDV)的免疫显性的VP1表位的合成肽组成,其通过合成连接于表位(人工T辅助细胞(Th)细胞肽)用作抗原。包括四种额外的Th肽,以进一步增强针对这三种FMDV血清型的细胞介导的免疫。将所述三种FMD VP1构建体以相当的比例混合,并辅以所述四种Th构建体混合物的小片段。接著,将FMDV B与T表位相关的合成构建体混合物与油性佐剂混合,以形成油包水乳化物。
应用的适应证:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(巴西)用于预防牛对口蹄疫病毒巴西O,A24与C因达亚尔血清型的感染。
剂量与施用:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(巴西)。经由肌肉内注射至肩前的颈部区域施用疫苗制剂。针头与皮肤表面见尽可能保持接近45度角以避免当针头拔出时,疫苗由针孔流出。紧急使用时建议使用一个单次剂量。对于先前无任何FMD接种的牛,应该间隔4-5周施用2mL的两次免疫以增加免疫性与延长免疫应答,并从而提供针对FMD感染的更佳的保护力。之后可每6个月进行额外的免疫。在具有FMDV感染的动物的地区,建议每6个月重复接种。递送的剂量为2.0mL。
使用说明
·使用前,将疫苗产品回温至室温。
·使用前,完全混合疫苗内含物。
·用无菌注射器和针头移出内含物。
·一旦开瓶,立即使用所有内含物。
通过由政府规章允许的程序销毁容器和所有未使用的内含物。
b.中国
抑制牛忠FMD中国O/亚洲1/A 甘肃 型病毒感染的 口蹄疫 (FMD)合成肽三价疫苗(中国)
注射用的无菌油包水乳化物
注意:仅用于动物。
产品说明:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(中国)为含有三种FMD VP1合成肽构建体的油包水乳化物三价疫苗。各肽结构由基于中国和亚洲区域的需要具有来自中国O,亚洲1与A甘肃血清型口蹄疫病毒(FMDV)的免疫显性的VP1表位的合成肽构成,其通过合成连接于表位(人工T辅助细胞(Th)细胞肽)用作抗原。包括四种额外的Th肽,以进一步增强针对这三种FMDV血清型的细胞介导的免疫。以等比例混合所述三种FMD VP1构建体并辅以所述四种Th构建体的混合物的小片段。接著,将FMDV B与T表位相关的合成构建体混合物与油性佐剂混合,以形成油包水乳化物。
应用的适应证:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(中国)用于预防牛对口蹄疫病毒中国O/亚洲1/A甘肃血清型病毒的感染。
剂量与施用:口蹄疫(FMD)合成肽三价疫苗(中国)为通过肌肉内注射入肩前的颈部区域。针头与皮肤表面之间尽可能保持接近45度角以避免当针头拔出时,疫苗由针孔流出。紧急使用时建议使用一个单次剂量。对于先前无任何FMD接种的牛,应该间隔4-5周施用两次2mL免疫,以增加免疫性与延长免疫应答,并从而提供针对FMDV感染更佳的保护。之后可每6个月进行额外免疫。在具有FMDV感染的动物的地区,建议每6个月重复接种。递送的剂量为2.0mL。
使用说明
·使用前,将疫苗产品回温至室温。
·使用前,完全混合疫苗内含物。
·用无菌注射器和针头移出内含物。
·一旦开瓶,立即使用所有内含物。
·通过由政府规章允许的程序销毁容器和所有未使用的内含物。
表4
源自于FMDV O型,毒株TAW/2/99(GenBank登录号AJ539137)的FMDV内源性Th肽
基因组aa位置 FMDV蛋白 蛋白aa位置 Seq ID No 序列
S221-M235 VP4 20-35 34 SIINNYYMQQYQNSM
I223-T237 VP4 22-36 35 INNYYMQQYQNSMDT
P360-K374 VP2 74-88 36 PFGRCYLLELPTDHK
D582-A596 VP3 78-92 37 DLSLAAKHMSNTFLA
E745-V7964 VP1 21-40 38 ETQVQRRQHTDVSFILDRFV
I759-N773 VP1 35-49 39 ILDRFVKVTPKDQIN
I759-L777 VP1 35-53 40 ILDRFVKVTPKDQINVLDL
V786-L800 VP1 62-76 41 VGALLRTATYYFADL
G808-P828 VP1 84-104 42 GNLTWVPNGAPETALDNTTNP
P835-G856 VP1 111-132 43 PLTRLALPYTAPHRVLATVYNG
T895-C911 VP1 167-183 44 TRVTELLYRMKRAETYC
P912-V933 VP1 188-209 45 PRPLLAIHPSKARHKQKIVAPV
R924-L937 VP1 200-213 46 RHKQKIVAPVKQLL
P954-V968 2B 1-15 47 PFFFSDVRSNFSKLV
F1093-K1106 2B 140-153 48 FFRSTPEDLERAEK
L1108-N1122 2C 1-15 49 LKARDINDIFAILKN
S1143-I1157 2C 36-50 50 SEEKFVTMTDLVPGI
V1148-R1162 2C 41-55 51 VTMTDLVPGILEKQR
A1446-K1450 3A 21-35 52 AAIEFFEGMVHDSIK
N1516-K1529 3A 91-104 53 NEYIEKASITTDDK
T1551-L1564 3A 101-114 54 TDDKTLDEAEKNPL
E1551-N1564 3A 126-139 55 EKTLPGHKASDDVN
G1579-K1592 3B1 1-14 56 GPYAGPMERQKPLK
P1584-L1597 3B1 6-19 57 PLERQKPLKVRAKL
P1607-A1620 3B2 6-19 58 PMERQKPLKVKVKA
P1631-N1644 3B3 6-19 59 PVKKPVALKVKAKN
M1878-F1892 3D 16-30 60 MRKTKLAPTVAHGVF
I1918-D1932 3D 56-70 61 IFSKHKGNTKMSEED
A2108-V2122 3D 246-260 62 ANHCSDAMNIMFEEV
L2248-K2262 3D 386-400 63 LKRHFHMDYGTGFYK
表22、研究动物的中和抗体效价
a:接种后周数
b:攻毒后天数
c:几何平均
表23、抗FMDV NS ELISA结果
注:WPV=接种后周数;
DPC=攻毒后天数。

Claims (30)

1.一种口蹄疫(FMD)疫苗组合物,所述组合物包含,
a)合成的免疫原性肽,其包含FMDV VP1环状B细胞表位序列与Th表位序列;
b)分离的肽,其包含合成的FMDV T辅助细胞表位序列;和
c)兽医学上可接受的递送载体或佐剂,
其中(a)中的所述合成的免疫原性肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:
i)SEQ ID NO:1或2
ii)(a)的同源物;和
iii)(a)或(b)的任意组合。
2.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中的合成的免疫原性肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中的合成的免疫原性肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(b)中的同源物为SEQ IDNO:2的同源物,所述同源物包含选自由SEQ ID NO:3至23组成的组的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽共价连接于所述Th表位序列的羧基端。
6.根据权利要求5所述的FMD疫苗,其中所述Th表位序列为SEQ IDNO:24。
7.根据权利要求5所述的FMD疫苗,其中所述T辅助细胞表位通过间隔子共价连接于所述肽抗原,所述间隔子包含ε赖氨酸残基。
8.根据权利要求5所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽选自由以下各项组成的组:SEQ ID NO:25至33及其组合。
9.根据权利要求5所述的FMD疫苗,其中(b)中的FMDV T辅助细胞表位肽选自由以下各项组成的组:SEQ ID NO:34至95及其组合。
10.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中肽抗原的总含量为介于每剂约10μg至约1mg之间。
11.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中所述递送载体或佐剂选自由以下各项组成的组:Montanide ISA 50V、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、Emulsigen、Emulsigen D和CpG寡核苷酸。
12.根据权利要求8所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽为SEQ ID NO:25,27,28,29和/或其组合。
13.根据权利要求9所述的FMD疫苗,其中(b)中FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NO:34-63,90和/或其组合。
14.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽为SEQ ID NO:25,27,28,29和/或其组合,并且(b)中FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NO:34-63,90和/或其组合。
15.一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求14中所述的疫苗。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述动物为猪。
17.一种保护动物免受FMD感染的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求14中所述的疫苗。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述动物为猪。
19.根据权利要求8所述的FMD疫苗,其中(a)合成的免疫原性肽为SEQ ID NO:25,27,28,29,31和/或其组合。
20.一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求19中所述的疫苗。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述动物为牛。
22.一种保护动物免受FMD感染的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求19中所述的疫苗。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述动物为牛。
24.根据权利要求8所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽为SEQ ID NO:26,30,32,33和/或其组合。
25.根据权利要求9所述的FMD疫苗,其中(b)中FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NO:91-95及其组合。
26.根据权利要求1所述的FMD疫苗,其中(a)中合成的免疫原性肽为SEQ ID NO:26,30,32,33和/或其组合,并且(b)中FMDV T辅助细胞表位肽为SEQ ID NO:91-95及其组合。
27.一种引发动物中免疫应答的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求26中所述的疫苗。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述动物为牛。
29.一种保护动物免受FMD感染的方法,所述方法包括向所述动物单次施用药学上有效量的权利要求26中所述的疫苗。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述动物为牛。
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