BR112015010756B1 - Composições de vacina para a doença do pé-e-boca (fmd),e uso das mesmas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE VACINA PARA A DOENÇA DO PÉ-E-BOCA (FMD), MÉTODOS PARA ELICITAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNE EM UM ANIMAL E PARA PROTEÇÃO DE UM ANIMAL DE INFECÇÃO POR FMD E USO. A presente invenção refere-se a imunógenos de peptídeo de FMD sintético e composições contendo os mesmos. Métodos para detecção, tratamento e prevenção de uma infecção por FMD em um animal usando os imunógenos de peptídeo de FMD sintético são também revelados. Em uma modalidade específica, uma vacina de emergência baseada em peptídeo e formulações da mesma contra a Doença do Pé-e-Boca são descritas. Várias formulações de vacina contêm uma mistura de peptídeos derivados de proteína VP1 de FMDV; cada peptídeo contendo uma sequência de epítopo de neutralização/ligação a receptor de FMDV de célula B ligada a um epítopo Th artificial para aumentar a imunogenicidade de cada peptídeo. Formulações de vacina reveladas contendo imunógenos virais podem ser opcionalmente suplementadas com uma mistura de peptídeos representando os epítopos Th endógenos de FMDV derivados de proteínas de FMDV, seus homólogos e análogos funcionais. Tais composições de peptídeo viral são preparadas em um sistema de administração aceitável como formulações de vacina e podem prover proteção para porcos (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma vacina de emergência baseada em peptídeo e formulações da mesma contra o Vírus da Doença do Pé-e-Boca (FMDV) (Foot and Mouth Disease Virus) para o controle da Doença do Pé-e-Boca (FMD) (Foot and Mouth Disease).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A Doença do Pé-e-Boca (FMD) é a doença animal mais contagiosa. O agente causador, Vírus da Doença do Pé-e-Boca (FMDV), é um aftovírus da família Picornaviridae que tem um genoma de RNA de sentido positivo codificando quatro proteínas do capsídeo (VP1-VP4) e polipeptídeos não estruturais (2A-2C e 3A-3D) (revisão de Carrillo, C. e outros, 2005).

[003] FMDV replica rapidamente e pode se espalhar pelo ar (transmissível por aerossol) dentre animais infectados e suscetíveis em contato, incluindo animais biungulados tais como gado, porcos, ovelha e cabras. FMD está na lista A de doença infecciosa animal do Office International des Epizooties (OIE) e foi reconhecida como a mais importante restrição ao comércio internacional em animais e produtos de animais. Atualmente, FMD é controlada por quarentena e destruição de animais infectados e expostos; e, na maioria dos países, por vacinação com composições de vírus quimicamente inativado. Devido às consequências econômicas prejudiciais resultantes desta presença, os países que estão livres da doença introduziram várias medidas para reter este estado sem vacinação.

[004] Sete sorotipos distintos de FMDV foram descritos e cada sorotipo é dividido mais em subtipos múltiplos. Esses sorotipos incluem: tipos A, O, C, Ásia e África do Sul SAT-1, 2 e 3 com A, O e Ásia sendo os mais comuns. Em adição à complexidade e variabilidade genética do vírus, FMDV pode mudar em uma taxa alta em uma base aleatória.

[005] Uma dificuldade significante em formulação de vacinas para FMDV é a notável diversidade antigênica do vírus e a falta de proteção cruzada entre os sorotipos. Isto é, animais vacinados contra, ou recuperados de, um vírus de um sorotipo são suscetíveis à infecção com vírus dos seis sorotipos restantes. Além disso, o grau de variação anti- gênica dentro de um sorotipo é tal que uma vacina eficaz contra um subtipo pode não ser protetora contra outro subtipo dentro daquele mesmo sorotipo.

[006] Vacinas para FMD atuais contêm uma mistura de vírus ina- tivados incluindo uma cepa de referência de cada sorotipo ou subtipo relevante, que é determinada através de monitoramento das cepas de vírus presentes em circulação local. Para prevenir que surtos surjam a partir de variantes de FMD, isolados de campo devem ser periodicamente monitorados e comparados com a vacina atual em produção. Desta maneira, para assegurar que a vacina seja atual e eficaz, a produção de vacinas com vírus FMD inativado necessita: (1) cultivo e ina- tivação de várias cepas de vírus a serem incluídas na vacina, (2) monitoramento da potência e eficácia de cada cepa inativada e (3) reformu-lação do produto de vacina periodicamente para incluir cepas atuais para prevenir perda de eficácia protetora por novas variantes emergentes.

[007] Produção e manutenção de uma vacina de vírus inativado eficiente é onerosa e complicada em vista da variação antigênica signi- ficante entre e dentre os sorotipos de FMDV. Várias questões e desvantagens conhecidas associadas com vacinas para FMDV inativadas incluem: riscos de perigo biológico e biossegurança, instabilidade e variabilidade de produto e efeitos colaterais não intencionais, prejudi- ciais, em animais tratados.

[008] Por exemplo, fabricação de vacinas com vírus inativado cria riscos de perigo biológico/biossegurança porque o vírus deve ser produzido em uma instalação de alta contenção para prevenir contaminação do ambiente imediato. Ainda, a inocuidade do produto de vírus inativado não pode ser completamente assegurada. Na realidade, vários casos recentes de FMDV na Europa foram rastreados para vírus incompletamente inativado. Esses riscos de perigo biológi- co/biossegurança potenciais limitam o número de fornecedores de vacina qualificados a apenas alguns. Tais limitações podem dificultar a habilidade de uma região em responder efetivamente e imediatamente a um surto.

[009] Vacinas para FMD atuais também sofrem de instabilidade de produto bem como variabilidade de lote para lote. Conforme acima discutido, as vacinas devem ser monitoradas e reformuladas periodicamente para incluir ambas as cepas atuais e emergentes de FMDV. Além disso, cada região do mundo necessitará proteção contra uma cepa corrente/emergente diferente de FMDV em um dado momento. Desta maneira, composições complexas e não definidas de vacinas de vírus inativado sendo produzidas em todo o mundo. Essas misturas complexas de vacinas de vírus inativado devem ser continuamente inspecionadas em intervalos regulares para assegurar imunopotência.

[0010] Em adição às questões acima, vacinas para FMDV atuais foram mostradas causar efeitos colaterais prejudiciais, não intencionais, em animais tratados. Por exemplo, relatos de reações alérgicas, choque anafilático e morte espontânea foram feitos em animais tratados com vacinas atuais.

[0011] A desvantagem das vacinas comerciais baseadas em lisa- do viral inativado existentes encorajou pesquisa para criar produtos de subunidade mais seguros e com definição melhor (Brown, F., 1992). No entanto, para ser uma substituição aceitável para o vírus inativado, tais produtos de subunidade devem ter uma imunogenicidade equivalente àquela das vacinas de vírus inativado e prover um amplo espectro de proteção contra variantes antigênicas. Mais importante, os produtos de subunidade precisam satisfazer às orientações da OIE para estudos de provocação após apenas administração única da vacina a fim de que sejam qualificados como uma vacina de emergência de FMD.

[0012] Para superar alguns dos problemas associados com vacinas para FMD baseadas em lisado viral comercial existente, o inventor e seu time de pesquisadores deram passos significantes nos últimos 15 anos em desenvolvimento de vacinas para FMDV baseadas em peptídeo sintético para proteger suíno de provocação por FMDV. Em particular, o inventor desenvolveu com sucesso uma vacina para FMDV eficaz que é capaz de elicitar uma faixa ampla de anticorpos de neutralização contra FMDV usando uma formulação contendo um pep- tídeo de epítopo de célula B na alça em VP1 otimizado. Imunogenici- dade deste peptídeo de epítopo de célula B na alça com VP1 pode ser potencializada mais por ligação covalente do peptídeo a um epítopo de T auxiliar artificial (Wang, C.Y. e Shen, M., 2000; Wang, C.Y. e outros, 2001; Wang, C.Y. e outros, 2002). Esta vacina foi mostrada proteger com eficácia suíno de provocação por FMDV após administrações múltiplas de uma formulação (Wang, C.Y. e outros, 2002). A formulação de peptídeo de epítopo de célula B na alça em VP1 provou ser uma vacina importante em proteção de animais contra cepas de vírus FMDV clássicas.

[0013] Para qualificar como uma vacina para FMD de “emergência” sob protocolo OIE, uma formulação deve induzir uma imunidade protetora rápida com uma cobertura antigênica ampla nos sorotipos de FMD após apenas uma única administração. Embora administrações múltiplas da formulação de peptídeo de epítopo de célula B na alça em VP1 proveja proteção eficaz contra cepas de vírus FMDV clássicas, administrações únicas da formulação não foram capazes de proteger suíno contra provocação com FMDV em uma base de emergência. Ainda, a formulação de peptídeo de epítopo de célula B na alça em VP1 não foi mostrada proteger gado de provocação por FMDV após uma ou duas administrações (Rodriguez, L.L. e outros, 2003).

[0014] Há uma necessidade urgente em explorar a literatura extensiva no domínio público, identificar e validar correlações das respostas imunes protetoras requeridas em uma vacina de emergência de FMD de maneira a permitir desenvolvimento de uma vacina para FMD baseada em peptídeo segura e eficaz e formulações da mesma para uso de emergência e proteção geral contra FMDV.

[0015] Em vista das desvantagens e limitações de vacinas atualmente disponíveis para FMD, permanece uma necessidade urgente de uma formulação de vacina de emergência que seja capaz de proteger suíno e gado contra FMDV após apenas uma única administração. Referências: Blanco, E. e outros, “Interspecies major histocompatibility complex- restricted Th cell epitope on foot-and-mouth disease virus capsid protein VP4.” J. Virol., 74:4902-4907. (2000) Brown, F. e outros, “The Effect of Various Inactivating Agents on the Viral and Ribonucleic Acid Infectivities of Foot-and-Mouth Disease Virus and on its Attachment to Susceptible Cells.” J Gen Microbiol., 31:179-186. (1963) Brown F., “New approaches to vaccination against foot-and-mouth disease.” Vaccine, 10:1022-6. (1992) Carrillo, C. e outros, “Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus.” J. Virol., 79:6487-6504. (2005) Collen, T. e outros, “A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle.” J. Immunol., 146:749755. (1991) Collen, T. e outros, “Heterotypic recognition of recombinant FMDV proteins by bovine T-cells: the polymerase (P3Dpol) as an immunodominant T-cell immunogen.” Virus Res., 56:125-133. (1998) Cox, S.J. e outros, “Longevity of antibody and cytokine responses following vaccination with high potency emergency FMD vaccines.” Vaccine. 21(13-14), 1336-1347 (2003) Filgueira, M.P. e outros, “Detection and characterization of functional T cell epitopes on the structural proteins VP2, VP3 and VP4 of Foot and Mouth Disease Virus O1 Campos.” Virology, 271: 234-2. (2000) Garcia-Briones, M. e outros, “Association of bovine DRB3 alleles with immune response to FMDV peptides and protection against viral challenge.” Vaccine, 19:1167-1171. (2001) Garcia-Briones, M. e outros, “Immunogenicity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D.” Virology, 322:264-27. (2004) Gerner, W. e outros, “Identification of novel foot-and -mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine.” Virus Res., 121:223-228. (2006) Gerner, W. e outros, “Identification of a novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitope with immunodominant characteristics in cattle with MHC serotype A31.” Vet. Res., 38:565-572. (2007) Gerner W. e outros, “Identification of Major histocompatibility Complex Restriction and Anchor Residues of Foot-and-Mouth Disease Virus- Derived Bovine T-cell epitopes.” J. Virol., 83:4039-4050. (2009) Guzman, E. e outros, “An MHC-restricted CD8+ T-cell response is induced in cattle by foot-and-mouth disease virus (FMDV) infection and also following vaccination with inactivated FMDV.” J. Gen. Virol., 89:667-675. (2008) Haghparast, A. e outros, “Selection of T-cell epitopes from foot-and- mouth disease virus reflects the binding affinity to different cattle MHC class II molecules.” Immunogenetics, 51:733-742. (2000) Hohlich, B.J. e outros, “Induction of an antigen-specific immune response and partial protection of cattle against challenge infection with foot-and-mouth disease virus (FMDV) after lipopeptide vaccination with FMDV-specific B cell epitopes.” J. of Gen. Virology, 84:3315-3324. (2003) Mason, P.W. e outros, “Comparisons of the complete genomes of Asian, African and European isolates of a recent foot-and-mouth disease virus type O pandemic strain (PanAsia).” J. Gen. Virol., 84:15831593. (2003) Moore V., Chapter 2. In: Synthetic Peptides: A Users Guide. Grant GA, ed. New York: WH Freeman and Company: 63-7. (1992) Morgan, D.O. and Moore, D.M. “Protection of cattle and swine against foot-and-mouth disease, using biosynthetic peptide vaccines.” Am J Vet Res. 51(1):40-5. (1990) Rodriguez, A. e outros, “Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and-mouth disease virus structural proteins: identification of T helper epitopes in VP1.” Virol., 205:24-33. (1994) Rodriguez, L.L. e outros, “Synthetic peptide containing the consensus sequence of the G-H Loop region of FMDV Type O VP1 Combined with a promiscuous T-helper epitope induces peptide specific AB but fails to protect cattle against viral challenge.” Vaccine, 21:3751-3756. (2003) Takamatsu, H.H., “A sub-population of circulating porcine gammadelta T cells can act as professional antigen presenting cells.” Vet Immunol Immunopathol., 87(3-4):223-4 (2002) Van Lierop, M.J. e outros, “T cell-stimulatory fragments of foot-and- mouth disease virus released by mild treatment with cathepsin D.” J. Gen. Virol., 75:2937-2946. (1994) Van Lierop, M.J. e outros, “Sequences derived from the highly antigenic VP1 region 140 to 160 of foot-and-mouth disease virus do not prime for a bovine T-cell response against intact virus.” J. Virol., 69:45114514. (1995a) Van Lierop M.J. e outros, “The influence of MHC polymorphism on the selection of T-cell determinants of FMDV in cattle.” Immunology, 84:79-85. (1995b) Wang C.Y., Shen, M., “Synthetic peptide vaccines for foot-and-mouth disease.” U.S. Patent No. 6,107,021. (2000) Wang, C.Y. e outros, “Synthetic Peptide-based Vaccine and Diagnostic System for Effective Control of FMD.” Biologicals, 29:221-228. (2001) Wang, C.Y. e outros, “Effective Synthetic peptide vaccine for foot-and- mouth disease in swine.” Vaccine, 20:2603-2610. (2002)

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção refere-se a peptídeos sintéticos que são úteis para a detecção, tratamento e/ou prevenção da doença do pé-e-boca (FMD) em um animal. Os peptídeos sintéticos da invenção incluem antígenos de peptídeo que podem ser usados para sensivelmente e especificamente detectar infecção por FMD em um animal. Os peptídeos sintéticos também incluem imunógenos de peptídeo tendo ambos os epítopos de célula B (B) e célula T auxiliar (Th) que agem juntos para estimular a geração de respostas imunoprotetoras à infecção por FMD. Em certas modalidades, os peptídeos sintéticos são ambos antígenos de peptídeo bem como imunógenos de peptídeo. Em algumas modalidades, os peptídeos sintéticos são usados para detectar a presença de anticorpos para vírus FMD (FMDV) em um animal. Em outras modalidades, os peptídeos sintéticos são usados para tratar animais que testam positivos para a presença de FMDV e/ou em animais que foram expostos a animais que testaram positivos para FMDV. Em ainda outras modalidades, os peptídeos sintéticos são usados para prevenir infecção por FMD em um animal.

[0017] A presente invenção refere-se também a composições contendo peptídeos sintéticos. Tais composições podem ser usadas para a detecção, tratamento e/ou prevenção de FMD em um animal. Em certas modalidades, composições contendo os peptídeos sintéticos são usadas para detecção da presença de anticorpos para FMD em uma amostra. Em outras modalidades, composições contendo os peptídeos sintéticos são composições farmacêuticas para tratamento e/ou prevenção de infecção por FMD em um animal. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é usada para elicitar uma resposta imune a FMDV em um animal. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica é uma composição de vacina que pode prevenir infecção por FMD em um animal exposto ao vírus.

[0018] A presente invenção também inclui métodos para detecção, tratamento e/ou prevenção de infecção por FMD em um animal. Os métodos revelados utilizam os peptídeos sintéticos e composições contendo os peptídeos sintéticos também revelados aqui.

[0019] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica baseada em peptídeo que qualifica como uma vacina de emergência de acordo com as orientações OIE porque a composição provê animais com proteção suficiente e adequada contra infecção por FMD após uma única administração. Nessas modalidades, a composição farmacêutica que pode ser usada como uma vacina de emergência contém imunógenos de peptídeo que imitam sítios antigênicos em proteínas de FMD nativas bem como proteínas de patógeno derivadas de epítopos de célula T endógenos. As formulações descritas elicitam eficientemente anticorpos funcionais contra proteínas de FMD alvo para prover animais com proteção de provocação por FMD.

[0020] Em várias modalidades, imunógenos de peptídeo sintético podem conter peptídeos na alça em VP1 tendo um sítio antigênico de célula B capaz de elicitar anticorpos de neutralização contra FMDV (SEQ ID NOs: 1 e 2), seus homólogos (por exemplo, SEQ ID NOs: 323, 96-99) e suas combinações .

[0021] Os peptídeos na alça em VP1 revelados podem também conter um epítopo de T auxiliar (SEQ ID NO: 24) que é covalentemen- te ligado ao terminal amino ou carboxila do antígeno de peptídeo para potencializar a imunogenicidade do peptídeo antigênico de célula B (por exemplo, SEQ ID NOs: 25-33, 100-102). Em certas variações, os imunógenos de peptídeo são suplementados com uma mistura de pep- tídeos representando epítopos de célula T para prover imunidade mediada por célula hospedeiro. Tais peptídeos incluem epítopos de T auxiliar derivados das proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B e 3D de FMDV (por exemplo, SEQ ID NOs: 34-63), seus homólogos e análogos funcionais, bem como peptídeos de biblioteca derivada de sequências combinatoriais (por exemplo, SEQ ID NOs: 64-87) e peptí- deos de epítopo de Th de FMDV projetados em uma forma de cassete potencializada UBITh® (por exemplo, SEQ ID NOs: 88-95).

[0022] A presente invenção também provê métodos para elicitação de respostas imunes mediadas por ambos anticorpo e célula contra FMDV em um animal. Tais métodos proveem proteção cruzada contra FMD a animais que são livres de anticorpo para FMDV quando da provocação viral com FMDV. Em modalidades específicas, os métodos revelados incluem uma etapa de administração de uma composição farmacêutica contendo um agrupamento de peptídeos de epítopo de B e T auxiliar de FMDV a um animal.

[0023] A presente invenção também provê um método para a fabricação de baixo custo e controle de qualidade de peptídeos imuno- gênicos para FMD, uma formulação de vacina de emergência conten- do os mesmos, bem como um sistema de administração capaz de proteger animais de provocação por FMDV em uma base de emergência com apenas uma única administração da formulação de vacina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A Figura 1 é um esquema que ilustra a distribuição e a localização de epítopos de B e Th em proteínas de FMDV de acordo com uma modalidade particular revelada aqui. As posições de aminoácido identificadas no desenho para as proteínas são baseadas na sequência de sequência genômica de FMDV OTaiwan99. O nome de cada produto de gene (VP4, VP2, VP3, VP1+2A, 2B+2C, 3A+3B1+B2, B3, 3C e 3D) é identificado seguido por barras abertas de comprimentos diferentes com base nos tamanhos das respectivas proteínas codificadas. Epítopos de células B e T são também identificados com base em seus respectivos tamanho (número de aminoácidos) e localização (número de aminoácido dentro da proteína onde epítopo é derivado) dos epítopos com cada epítopo sendo marcado por seus primeiro e último aminoácidos e sua numeração dentro desta proteína (por exemplo, para VP4: S221-M235 significa que o epítopo de célula T é de 15 aminoácidos de comprimento começando com Serina na posição de aminoácido 221 e terminando em Metionina na posição de aminoácido 235 dentro da proteína VP4).

[0025] Figura 2 é um fluxograma identificando o processo de desenvolvimento, do desenvolvimento até a comercialização, de uma formulação de vacina de acordo com uma modalidade particular revelada aqui.

[0026] A Figura 3A é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de neutralização (NA) (Neutralizing Antibody) de gado que recebeu duas administrações de vacina UBITh® VP1 (SEQ ID NO: 25). Quinze gados livres de FMDV, de idade 6-12 meses, foram imunizados nas semanas 0 e 3. Soros foram coletados semanalmente entre 0 e 6 semanas e ensaiados quanto a títulos de NA após cada imunização.

[0027] A Figura 3B é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de neutralização (NA) de suíno que recebeu duas administrações de vacina UBITh® VP1 (SEQ ID NO: 25). Quinze suínos livres de FMDV, de a 6 semanas de vida, foram imunizados em 0 e 3 semanas. Soros foram coletados semanalmente entre 0 e 6 semanas e ensaiados quanto a títulos de NA após cada imunização.

[0028] A Figura 4A é um gráfico ilustrando a resposta imune celular (produção de IFN-Y) induzida por PBMCs em porcos recebendo uma administração única de uma formulação de vacina para FMD UBITh® contendo um epítopo de célula B derivado de VP1 (OConsenso SEQ ID NO: 25) e peptídeo de agrupamento de cassete de Th de FMDV endógeno potencializado UBITh® (SEQ ID NO: 90) em uma razão 10:1 em peso em emulsão água-em-óleo ISA50V2 (a/o 50/50) a 27,5 μg/mL por dose. Os animais sofreram sangria semanalmente e a capacidade de suas PBMCs em responder in vitro a antígenos de pep- tídeo de vacina de memória imunológica (recall) com resposta de IFN- Y foi determinada conforme descrito no Exemplo 3.

[0029] A Figura 4B é um gráfico ilustrando a resposta imune celular (produção de IFN-Y) induzida por PBMCs em porcos recebendo uma administração única de uma formulação de vacina para FMD UBITh® contendo um epítopo de célula B derivado de VP1 (OConsenso SEQ ID NO: 25) e peptídeo de agrupamento de cassete de Th de FMDV endógeno potencializado UBITh® (SEQ ID NO: 90) em uma razão 10:1 em peso em emulsão água-em-óleo (w/o 50/50) ISA50V2 a 27,5 μg/mL por dose (quadrado fechado ■) comparado com animais controle negativos não vacinados (círculos abertos o). Os animais sofreram sangria no dia 28 antes da provocação e os valores finais foram corrigidos por subtração dos valores de linha de base do dia 0.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0030] A presente invenção refere-se a peptídeos sintéticos que são úteis para a detecção, tratamento e/ou prevenção de doença do pé-e-boca (FMD) em um animal. Os peptídeos sintéticos da invenção incluem antígenos de peptídeo que podem ser usados para sensivelmente e especificamente detectar anticorpos para vírus da FMD em um animal. Os peptídeos sintéticos também incluem imunógenos de peptídeo tendo ambos os epítopos de célula B (B) e célula T auxiliar (Th) que agem juntos para estimular a geração de respostas imuno- protetoras à infecção por FMD. Em certas modalidades, os peptídeos sintéticos são ambos antígenos de peptídeo bem como imunógenos de peptídeo. Em algumas modalidades, os peptídeos sintéticos são usados para detectar a presença de anticorpos para vírus de FMD (FMDV) em um animal. Em outras modalidades, os peptídeos sintéticos são usados para tratar animais que testam positivo quanto à presença de FMDV e/ou em animais que foram expostos a animais que testavam positivo pra FMDV. Em ainda outras modalidades, os peptí- deo sintéticos são usados para prevenir infecção por FMD em um animal.

[0031] A presente invenção refere-se também a composições contendo peptídeos sintéticos. Tais composições podem ser usadas para a detecção, tratamento e/ou prevenção de FMD em um animal. Em certas modalidades, composições contendo os peptídeos sintéticos são usadas para detecção da presença de FMDV em uma amostra. Em outras modalidades, composições contendo os peptídeos sintéticos são composições farmacêuticas para tratamento e/ou prevenção de infecção por FMD em um animal. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é usada para elicitar uma resposta imune a FMDV em um animal. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica é uma composição de vacina que pode prevenir infecção por FMD em um animal exposto ao vírus.

[0032] A presente invenção também inclui métodos para detecção, tratamento e/ou prevenção de infecção por FMD em um animal. Os métodos revelados utilizam peptídeos sintéticos e composições contendo peptídeos sintéticos revelados aqui.

a. Epítopos de célula B - Imunógenos de Peptídeo Sintético de FMDV

[0033] Sequências de aminoácido para imunógenos de peptídeo sintético foram obtidas através de alinhamento e avaliação de sítios antigênicos de célula B em proteínas de estrutura de VP1 de cepas de sorotipo I de FMDV homólogas, múltiplas. Com base no alinhamento mostrado na Tabela 2, uma sequência de consenso antigênica de 25 aminoácidos, correspondendo aos resíduos de aminoácido 134 a 158 de proteína de estrutura de VP1 de FMDV de comprimento integral, foi obtida (SEQ ID NO: 1). (Um exemplo de numeração de aminoácido para uma sequência de VP1 de comprimento integral pode ser encontrado no No. de Acesso Genbank NP_740460). Aminoácidos correspondendo às posições 134 e 158 foram substituídos com resíduos cis- teína para permitir que o peptídeo formasse uma estrutura de alça in- tradissulfeto. Um peptídeo de consenso antigênico de FMDV mais lon-go contendo 41 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) foi também obtido deste alinhamento. A segunda sequência de consenso compreende SEQ ID NO: 1 e inclui sequências de flanqueamento adicionais em ambos os terminais N e C. A segunda sequência de consenso corresponde aos resíduos de aminoácido 129 a 168 de proteína estrutural VP1 de FMDV com aminoácidos correspondendo às posições 134 e 158 substituídas com resíduos cisteína. As duas sequências de consenso são identificadas conforme mostrado na Tabela 1.

[0034] Sequências de consenso para epítopos de célula B de VP1 de sorotipos O, Asia 1 e A foram também obtidas através de alinhamentos homólogos similares e são mostradas como SEQ ID NOs: 2, 12 e 16 na Tabela 2. Aminoácidos para as posições variáveis dentro de cada sequência de consenso foram atribuídos com base no amino- ácido que aparecia com mais frequência dentro da respectiva cepa de sorotipo nessas posições.

[0035] Variações eficazes e aceitáveis dos imunógenos de peptí- deo sintético SEQ ID NO: 1 e 2 incluem homólogos imunologicamente funcionais que têm sequências correspondentes e elementos confor- macionais de cepas mutantes e variantes de FMDV. Peptídeos antigê- nicos de FMDV homólogos têm resíduos de aminoácido que se relacionam intimamente com posições de proteína estrutural VP1 129 a 168 da cepa OTaiwan de FMDV variante originária e a sequência de consenso derivada de cepas múltiplas de sorotipo O de FMDV (Mason, P.W. e outros, 2003). Tais homólogos podem ser prontamente identificados através de programas de alinhamento de sequência tais como Clus- talW (produzido por Julie, D. Thompson, Toby Gibson of European Molecular Biology Laboratory, Germany and Desmond Higgins of Euro-pean Bioinformatics Institute, Cambridge, UK. Algorithmic). A Tabela 2 mostra a sequência de FMDV OConsensus (2570a, SEQ ID NO: 2) bem como alinhamento ClustalW de vinte e duas sequências antigênicas em proteína de estrutura de VP1 de FMDV tomadas de múltiplos soro- tipos e diversas cepas incluindo: OCampos, OTaiwan, OMyanmar, OOzk, OLanzou, Asia 1 Yunnan, Asia 1 Jiansu, A24, AGansu, AXinjiang, C Indaial, C3Belgium, C3Argentina, etc. (SEQ ID NOs: 3 a 23).

[0036] Homólogos adicionais de VP1 que estão incluídos na presente invenção incluem peptídeos e proteínas que contêm a sequência de ligação de receptor celular “RGD” (Arg-Gly-Asp) invariavelmente encontrada na estrutura na alça de sequências de VP1 de todas as cepas de FMDV. Esta sequência RGD correspondendo às posições de aminoácido 145 a 147 da proteína VP1.

[0037] Conforme mostrado na Tabela 2, o número de aminoácidos encontrado a jusante (em direção ao terminal C) da sequência “RGD” é o mesmo entre as várias sequências de VP1. No entanto, o número de aminoácidos a montante (em direção ao terminal N) da sequência RGD varia dependendo do sorotipo particular (por exemplo, O, Asia 1, A ou C). Dentro de cada sorotipo, as sequências N-terminais têm pelo menos 75% de identidade com a sequência de consenso para aquele sorotipo particular (por exemplo, SEQ ID NOs: 13 a 15 quando comparado com SEQ ID NO: 12 para sorotipo Asia 1; e SEQ ID NOs: 17 a 19 quando comparado com SEQ ID NO: 16 para sorotipo A). Em uma modalidade, o homólogo de cepa OMyanmar/7/02 variante (SEQ ID NO: 7) tem mais de 85% de identidade com a SEQ ID NO: 2 (com os resíduos diferentes daqueles na sequência de consenso mostrados como sombreado). Em outra modalidade, o homólogo OOzk/93 de cepa variante (SEQ ID NO: 8) tem aproximadamente 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2 (com os resíduos diferentes daqueles na sequência de consenso sendo mostrados como sombreado).

[0038] Peptídeos de VP1 homólogos, mostrados na Tabela 2 e de outro modo descritos, podem ser combinados em uma composição em uma razão apropriada e administrados a um animal para elicitar eficazmente anticorpos de neutralização que se direcionam a cepas de FMDV específicas. Desta maneira, composições farmacêuticas contendo peptídeos de VP1 homólogos são vacinas eficazes para prevenção de infecção por FMDV. Por exemplo, formulações contendo peptí- deo(s) de VP1 homólogo(s) preparadas como uma emulsão água-em- óleo (a/o) (por exemplo, com ISA50V2) ou como uma emulsão água- em-óleo-em-água (a/o/a) (por exemplo, com Emulsigen), são eficazes na prevenção de infecção por FMD.

[0039] Várias modalidades e exemplos são providos abaixo, os quais discutem o uso de efeitos de composições contendo peptídeos de sequência de VP1 múltiplos. Por exemplo, os Exemplos 6, 7, 9 e 10 descrevem uma composição de vacina para suíno e/ou gado para FMDV multivalente contendo uma combinação de três peptídeos de VP1 sorotipo O de FMDV correspondendo às sequências de OConsensus, Oswine/cattle/O/Mya/7/02 (abreviada como OMyanmar) e OOzk/93 (abreviada como OOzk). A composição contendo esta mistura de peptídeos pode produzir uma vacina para suíno trivalente potente para combater a infecção imposta por múltiplas cepas O divergentes múltiplas. Similarmente, uma vacina de sorotipo múltiplo usando uma combinação de peptídeos de VP1 com OConsensus (2570a), Asia 1 JiangSu/China/2005 (abreviada como Asia 1JiangSu) e AGansu/China/60Y (abreviada como AGansu) pode ser misturada para formar uma vacina para gado de sorotipo trivalente para combater a infecção imposta por cepas de sorotipos de FMDV múltiplos na China. Ainda, uma vacina para gado de sorotipo múltiplo eficaz adaptada para a América do Sul contém uma combinação de peptídeos de se-quência de VP1 de OCampos/Brazil/58Y (abreviada como OCampos), A24 Cruzeiro California (abreviada como A24) e CIndaial/Brazil/84Y (abreviada como CIndaial) é eficaz no combate de infecções por FMD impostas por cepas de soro- tipos múltiplos mais prevalentes na América do Sul.

[0040] A localização do epítopo de célula B na proteína VP1 de FMDV que foi selecionada para ser incluída nos peptídeos sintéticos da presente invenção, com relação a outras regiões e proteínas de FMDV, é mostrada na Figura 1. As sequências de proteína são baseadas na sequência de FMDV (OTaiwan 99 genoma/sequência de aminoá- cido codificada) (No. Acesso GenBank AJ539137).

[0041] Análogos imunologicamente funcionais dos imunógenos de peptídeo sintético são também eficazes na elicitação de uma resposta imune em um animal e estão incluídos como parte da presente invenção. Análogos imunologicamente funcionais incluem variantes das sequências de consenso de SEQ ID NOs: 1, 2, 12 e 16 /ou homólogos de SEQ ID NOs: 3-11, 13-15 e 17-23 que retêm substancialmente as mesmas antigenicidade e imunogenicidade que o peptídeo original. Por exemplo, variantes que são análogos funcionais podem ter uma substituição conservativa em uma posição de aminoácido; uma mudança em carga geral; uma ligação covalente com outra porção; ou adições, inserções ou deleções de aminoácido; e/ou qualquer combinação das mesmas.

[0042] Substituições conservativas são quando um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com propriedades químicas similares. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, feni- lalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0043] Em uma modalidade, o análogo imunologicamente funcional de um peptídeo particular contém a mesma sequência de aminoá- cido que o peptídeo original e inclui ainda três lisinas (Lys-Lys-Lys) adicionadas ao terminal amino do peptídeo. Nesta modalidade, a inclusão de três lisinas na sequência de peptídeo original muda a carga geral do peptídeo original, mas não altera a função do peptídeo original.

[0044] Em uma modalidade particular, o análogo funcional tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácido original.

b. Epítopos de T Auxiliar (Th) Endógenos de FMDV

[0045] Composições contendo peptídeos de imunógeno sintéticos podem incluir peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV. A presença de epítopo de Th em formulações farmacêuticas/vacina provê a resposta imune em animais tratados ao iniciar ativação de célula T específica de antígeno, uma correlação crítica para proteção contra FMDV. Ainda, formulações que incluem epítopos de Th imunodomi- nantes cuidadosamente selecionados presentes em proteínas de FMDV podem produzir imunidade mediada por célula ampla, o que torna as formulações eficazes no tratamento e proteção de animais tendo composições genéticas diversas, tal como gado.

[0046] Animais imunizados com uma administração única de formulações contendo peptídeos de imunógeno com epítopos de célula B em combinação com peptídeos de epítopo de T auxiliar de proteínas de FMDV são capazes de disparar respostas proliferativas de linfócito quando da subsequente exposição a FMDV ou de uma infecção natural ou um teste de provocação com FMDV. As respostas proliferativas levam à produção de citocina, incluindo produção de IFN-Y, que potencializa as respostas imunes mediadas por célula para uma variedade de infecções virais citopáticas em animais.

[0047] Os peptídeos de epítopo de Th de SEQ ID NOs: 34-63 foram identificados usando ensaios de proliferação de célula T in vitro e avaliando produção de IFN-y citocina in vivo e in vitro em animais hospedeiro imunizados com formulações/vacinas para FMD contendo os epítopos de Th. Ainda, formulações contendo (a) peptídeos de VP1 de agrupamento de epítopo de B de FMDV e (b) combinações de grupo grandes dos peptídeos de Th endógenos de FMDV foram analisadas para determinar a composição farmacêutica apropriada capaz de eficazmente e consistentemente produzir a imunidade celular necessária em uma variedade de animais hospedeiro tendo uma base genética diversa, tal como gado. Em adição a monitoramento da produção de IFN-Y in vitro em hospedeiros imunizados/vacinados, títulos de anticorpo de neutralização foram também avaliados para determinar se esses hospedeiros eram capazes de montar anticorpos de neutralização contra FMDV com apenas uma única administração da formulação.

[0048] Em várias modalidades, peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV são derivados de segmentos antigênicos de proteínas de VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B e 3D de FMDV. A Tabela 4 identifica peptídeos de Th endógenos de FMDV específicos (SEQ ID NOs: 34-63) que foram verificados ser particularmente úteis quando usados em formulações da presente invenção. Especificamente, os epítopos de Th endógenos de FMDV listados na Tabela 4 são reconhecidos por células T de suíno e gado obtidas de hospedeiros imunizados com (a) formulações/vacinas de lisado viral de FMDV e (b) formulações de peptídeo contendo peptídeos de Th candidatos de FMDV. A distribuição e a localização dos epítopos de Th nas proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B e 3D de FMDV (listadas na Tabela 4), com relação a outras regiões e proteínas de FMDV, são mostradas na Figura 1. As sequências de proteína são baseadas na sequência de FMDV (OTaiwan 99 genoma/sequência de aminoácido codificada) (No. Acesso GenBank AJ539137).

[0049] Homólogos dos epítopos de Th identificados na Tabela 4 são também eficazes e incluídos na presente invenção. Por exemplo, as SEQ ID NOs: 64-78 são sequências de epítopo de Th homólogo de FMDV OTAW/2/99 (No. Acesso GenBank AJ539137). A tabela 5 provê alinhamentos de sequência de comparação dos epítopos de Th de OTaiwan/99 de FMDV com epítopos de Th homólogos de OTAW/2/99 de FMDV. Especificamente, a Tabela 5 alinha epítopos de Th homólogos de proteína 3D de FMDV (SEQ ID NOs: 61 vs 64; 62 vs 65; 63 vs 66; 60 vs 71 e 72); proteína 2B de FMDV (SEQ ID NOs: 48 vs 67 e 68), proteína 3a de FMDV (SEQ ID NOs: 53 vs 69 e 70), proteína VP4 de FMDV (SEQ ID NOs: 34 e 73 e 74), proteína VP2 de FMDV (SEQ ID NOs: 36 vs 75 e 76) e proteína VP3 de FMDV (SEQ ID NOs: 37 vs 77 e 78).

[0050] Análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV são também eficazes e incluídos como parte da presente invenção. Análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV são também eficazes e incluídos como parte da presente invenção. Análogos imunologicamente funcionais incluem variantes de SEQ ID NOs: 34-63 e/ou homólogos de SEQ ID NOs: 64-78 que retêm substancialmente a mesma imunogenicidade que o peptídeo original. Por exemplo, variantes que são análogos funcionais podem ter uma substituição conserva- tiva em uma posição de aminoácido; uma mudança em carga geral; uma ligação covalente a outra porção; ou adições, inserções ou dele- ções de aminoácido; e/ou qualquer combinação dos mesmos.

[0051] Substituições conservativas são quando um resíduo de aminoácido é substituído por outro aminoácido com propriedades químicas similares. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbi- cos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoá- cidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e his- tidina; e os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0052] Em uma modalidade particular, o análogo funcional tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácido original.

[0053] Em uma modalidade, o análogo imunologicamente funcional de um peptídeo particular contém a mesma sequência de aminoá- cido que o peptídeo original e inclui ainda três lisinas (Lys-Lys-Lys) adicionadas ao terminal amino do peptídeo. Nesta modalidade, a inclusão de três lisinas na sequência de peptídeo original muda a carga total do peptídeo original, mas não altera a função do peptídeo original.

[0054] A Tabela 6 identifica outra variação de um análogo funcional para peptídeo de epítopo de Th. Em particular, as SEQ ID NOs: 39 e 40 são análogos funcionais uma da outra porque elas diferem apenas pela deleção (SEQ ID NO: 39) ou a inclusão (SEQ ID NO: 40) de quatro aminoácidos no terminal C. As diferenças entre essas duas sequências análogas não afetariam a função dos epítopos de Th contidos dentro dessas sequências.

[0055] Em outras variações, peptídeos de epítopo de TH endógenos de FMDV podem ser apresentados como uma sequência combinatorial, que contém uma mistura de resíduos de aminoácido representados em posições específicas dentro da estrutura principal do peptídeo com base nos resíduos variáveis de homólogos para esse peptídeo particular. Uma montagem de peptídeos combinatoriais pode ser sintetizada em um processo através de adição de uma mistura dos aminoácidos protegidos projetados, ao invés de um aminoácido particular, em uma posição especificada durante o processo de síntese. Tais montagens de peptídeo de Th endógenos de FMDV combinatori- ais podem permitir cobertura de epítopo de Th ampla para animais tendo uma base genética diversa. Sequências combinatoriais representativas de peptídeos de Th endógenos de FMDV incluem SEQ ID NOs: 79-87, que são mostradas na Tabela 7. Essas sequências com- binatoriais são derivadas das SEQ ID NOs: 34-63 (mostradas na Tabela 4) para os epítopos de Th endógenos de FMDV representativos.

[0056] Em várias modalidades, a imunogenicidade de célula T pode ser potencializada unindo sequências de epítopo de Th endógeno de FMDV múltiplas juntas em um peptídeo único. As sequências de epítopo de Th que são unidas podem ser a mesma sequência de epí- topos de Th (para criar um peptídeo tendo uma sequência de epítopo de Th de repetição); sequências de epítopo de Th diferentes (para criar um peptídeo tendo uma variedade de sequências de epítopo de Th); ou combinações das mesmas. Ainda, sequências de epítopo de Th podem ser unidas com um espaçador ou sem um espaçador. Em certas modalidades um espaçador é usado para facilitar a clivagem intracelular de um peptídeo contendo epítopos de Th de FMDV múltiplos como sequência única na localização apropriada. Em algumas modalidades, o espaçador contém um aminoácido. Em uma modalidade pre-ferida, o espaçador é lisina.

[0057] Os peptídeos de epítopo da presente invenção proveem reatividade e imunogenicidade amplas a animais de populações geneticamente diversas de espécies animais alvo. Peptídeos verificados ser particularmente úteis em formulações da presente invenção incluem peptídeos contendo um agrupamento de epítopos de Th de FMDV múltiplos, tais como SEQ ID NOs: 34-78, e peptídeos contendo uma sequência combinatorial de sequências de epítopo de Th, tais como SEQ ID NOs: 79-87. Em certas modalidades, peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógenos de FMDV podem potencializar mais a imunogenicidade de célula T ligando os epítopos de Th a uma Th artificial (UBITh®) (SEQ ID NO: 24) conforme mostrado na Tabela 7 (SEQ ID NOs: 88-95).

c. Espaçador

[0058] Imunógenos de peptídeo de FMDV sintéticos, incluindo homólogos e análogos dos mesmos, podem ser covalentemente ligados, com ou sem um espaçador, a um peptídeo contendo uma sequência conhecida conter um epítopo de Th. Os peptídeos ligados podem oferecer imunogenicidade potencializada com relação aos imunó- genos equivalentes que não são covalentemente ligados aos peptí- deos de epítopo de Th.

[0059] Em algumas modalidades, um peptídeo contendo um epí- topo de Th artificial é covalentemente ligado ao terminal N de um imunógeno de peptídeo de FMDV sintético. Em algumas variações, um espaçador está presente entre as duas sequências. Preferivelmente, o espaçador é o aminoácido único εNLys. Em uma modalidade específica, o peptídeo de epítopo de Th artificial de SEQ ID NO: 24 é covalen- temente ligado ao terminal N do imunógeno de peptídeo de FMDV sintético de SEQ ID NO: 2 através de um espaçador εNLys (também mostrado na Tabela 3 como SEQ ID NO: 25). Peptídeos exemplares adicionais contendo uma sequência de epítopo de Th covalentemente ligada ao terminal amino de um imunógeno de peptídeo de FMD sintético são mostrados na Tabela 3. Em particular, o peptídeo de epítopo de Th SEQ ID NO: 24 é ligado ao terminal amino de vários imunóge- nos de peptídeo de FMDV sintéticos através de um espaçador -εNLys (SEQ ID NOs: 25 a 33).

d. Composições

[0060] A presente invenção refere-se também a composições contendo peptídeos sintéticos. As composições podem ser usadas para a detecção, tratamento e/ou prevenção de FMD em um animal. Em certas modalidades, composições contendo peptídeos sintéticos tendo epítopos de célula B de FMDV são usadas para detecção da presença de anticorpos para FMDV em uma amostra. Em outras modalidades, composições contendo peptídeos sintéticos tendo epítopos de célula B de FMDV são composições farmacêuticas para tratamento e/ou prevenção de infecção por FMD em um animal. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica contendo peptídeos sintéticos tendo epítopos de célula B de FMDV é usada para elicitar uma resposta imune para FMDV em um animal. Composição farmacêutica contendo peptídeos sintéticos tendo epítopos de célula B de FMDV pode ser usada como uma vacina para FMDV.

[0061] Composições farmacêuticas contendo imunógenos de pep- tídeo de FMDV sintéticos elicitam eficientemente anticorpos funcionais contra proteínas FMD alvo para prover animais com proteção de provocação por FMD. Na realidade, animais que recebem apenas uma única administração dessas composições farmacêuticas são suficientemente e adequadamente protegidos contra infecção por FMD. Desta maneira, administrações múltiplas ou doses de reforço não são requeridas para prover animais com proteção integral de infecção por FMD. Desta maneira, composições farmacêuticas contendo imunógenos de peptídeo de FMDV sintético qualificam como vacinas de emergência de acordo com orientações OIE.

[0062] As composições da presente invenção podem conter um ou mais imunógenos de peptídeo de FMDV sintéticos. Por exemplo, as composições podem conter imunógenos de peptídeo de FMDV sintéticos tendo a sequência de consenso (SEQ ID NOs: 1 e 2) mostrada na Tabela 1, e/ou homólogos ou análogos dos mesmos conforme mostrado na Tabela 2, e/ou combinações dos mesmos. Ainda, os imunóge- nos de peptídeo de FMDV usados nas composições podem ser ligados a um epítopo T auxiliar combinatorial artificial para potencializar a imunogenicidade de célula B das composições. Em uma modalidade preferida, imunógenos de peptídeo de FMDV sintéticos são ligados a um epítopo de T auxiliar combinatorial artificial de SEQ ID NO: 24. Imunógenos de peptídeo de VP1 de FMDV representativos de vários sorotipos são identificados na Tabela 3.

[0063] Composições contendo imunógenos de peptídeo de FMDV podem também conter um ou mais peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV. Por exemplo, as composições podem incluir peptí- deos de epítopo de Th derivados de proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B e 3D de FMDV1. Peptídeos de epítopo de Th verificados ser particularmente úteis em composições incluem os peptídeos mostrados nas Tabelas 4, 5, 6 e 7 (SEQ ID NOs: 34-95) e nas Tabelas 18, 19, 25 e 26 descritas nos Exemplos 9 e 10). Composições farmacêuticas, incluindo formulações de vacina, podem elicitar respostas de anticorpo específicas de FMDV e disparam o início de reação de célula T específica de antígeno de peptídeo que protege suíno e gado contra infecção por FMDV com apenas uma única administração.

[0064] Ainda, as composições podem conter carreadores e/ou aditivos em um sistema de administração farmaceuticamente aceitável. Desta maneira, uma composição contendo os imunógenos de peptí- deo de FMDV sintéticos pode ser formulada como uma formulação de vacina farmacêutica usando adjuvantes, carreadores farmaceutica- mente aceitáveis ou outros ingredientes rotineiramente providos em formulações de vacina. Dentre os ingredientes que podem ser usados na presente invenção estão adjuvantes ou emulsificantes incluindo alume, adjuvante de Freund incompleto, liposina, saponina, esqualeno L121, Emulsigen, lipídeo de monofosforila A (MPL), QS21, ISA 35, ISA 206, IS50V2 e ISA 720 bem como os outros adjuvantes e emulsifican- tes eficazes. Em uma modalidade particular, o veículo ou adjuvante de administração é Montanide® ISA 50V2 (uma composição adjuvante de vacina de óleo compreendida de óleo vegetal e oleato de manida para produção de emulsões água-em-óleo), Tween® 80 (também conhecido como Polissorbato 80 ou Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, um oligonucleotídeo de CpG e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma emulsão água-em-óleo-em-água (isto é, a/o/a) com Emulsigen ou Emulsigen D como o adjuvante (conforme descrito no Exemplo 9, Tabela 19, para grupos 27, 28, 31 e 32). São também providos outros ingredientes rotineiramente incorporados com formulações de vacina e instruções para dosagem (Exemplos 9 e 10) de maneira que uma resposta imune de células B e T equilibrada pode ser produzida quando de administração única e oferece proteção quando de provocações virais.

[0065] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações de liberação imediata ou liberação sustentada. Ainda, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica, ou mucosal localizada, através de aprisionamento de imunógeno e co-administração com micropartículas. Tais sistemas de administração são prontamente determinados por um versado comum na técnica.

[0066] Várias formulações de vacina contendo peptídeos da presente invenção são eficazes para proteger animais ungulados contra FMDV. Por exemplo, uma composição farmacêutica que é útil como uma formulação de vacina para FMDV contém um imunógeno de pep- tídeo de FMDV sintético e um veículo ou adjuvante de administração veterinariamente aceitável, onde o imunógeno de peptídeo de FMDV sintético tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: a) SEQ ID NOs: 1-2; b) um homólogo de (a); c) um análogo antigenicamente e imunologicamente funcional de (a) ou (b), d) (a), (b) ou (c) tendo pelo menos um substituição de amino- ácido, adição de aminoácido e/ou deleção de aminoácido conservati- va; e e) qualquer combinação de (a)-(d).

[0067] Em uma formulação específica, o imunógeno de peptídeo de FMD sintético é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 7 e 8.

[0068] Em outra formulação, a composição contém um imunógeno de peptídeo de FMDV sintético ligado a um peptídeo de Th combinatorial artificial através de um espaçador, e tem a sequência de SEQ ID NO: 25.

[0069] Outras formulações contêm ainda uma razão igual em peso de trinta peptídeos de epítopo de Th de FMDV de SEQ ID NOs: 34 a 63 presentes em uma quantidade entre cerca de 0,1 μg a cerca de 1 mg por dose. Em uma formulação específica, a quantidade da razão igual em peso de SEQ ID NOs: 34 a 63 está entre cerca de 1 μg a cerca de 100 μg por dose.

[0070] Em ainda outra formulação, a composição compreende uma mistura de antígenos de peptídeo de FMDV sintéticos de SEQ ID NOs: 25, 27 e 28 e um grupo com razão igual em peso de peptídeos de epítopo de Th endógeno de FMDV de SEQ ID NOs: 34 a 63, em um veículo ou adjuvante de administração veterinariamente aceitável, onde a quantidade de antígeno de peptídeo está entre cerca de 10 μg a cerca de 1 mg por dose.

e. Administração

[0071] Composições farmacêuticas e formulações de vacina podem ser administradas através de qualquer via conveniente incluindo subcutânea, oral, intramuscular ou outras vias parenterais ou enterais. Similarmente, as vacinas podem ser administradas como uma dose única ou doses múltiplas. Programas de imunização são prontamente determinados pelo versado comum na técnica.

[0072] As composições farmacêuticas são formuladas para conter uma quantidade eficaz de imunógenos de peptídeo sintético e um car- reador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas são também formuladas em uma forma de unidade de dosagem adequada geralmente contendo de a partir de cerca de 0,5 μg a cerca de 1 g do imunógeno por kg de peso do corpo. Quando administrada em doses múltiplas, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente divididas em uma quantidade apropriada por forma de unidade de dosagem. A dosagem administrada dependerá da idade, peso e saúde geral do indivíduo como é bem conhecido nas técnicas de vacina e terapêutica.

[0073] Composições farmacêuticas contendo imunógenos de pep- tídeo de FMDV sintético, tais como formulações de vacina, podem produzir uma resposta eficaz mesmo quando providas em uma administração única. Uma administração única dessas composições farmacêuticas é suficiente para a primeira vez em animais tendo uma população diversa de células T auxiliares incluindo suíno, gado, ovelha, cabras e outras espécies selvagens suscetíveis. Em particular, as composições farmacêuticas contendo os imunógenos de peptídeo de FMDV sintético em combinação com peptídeos de epítopo de Th podem elicitar respostas imunes de células B (anticorpos de neutralização) e T (liberação de citocina, etc) equilibradas para proteger os animais de provocações virais subsequentes.

[0074] Imunizações com administração única usando formulações contendo imunógenos de peptídeo de FMDV sintético em combinação com peptídeos de epítopo de Th foram extensivamente avaliadas de acordo com orientações OIE, Taiwan e PRC (discutido adicionalmente nos Exemplos 9 e 10). Os resultados que foram obtidos desses testes demonstraram repetidamente e reproduzivelmente a eficácia dessas formulações em proteção de hospedeiros imunizados contra infecção por FMD. Desta maneira, esses testes validaram o projeto das formulações de FMDV bem como a habilidade em usar a formulação de FMDV como uma vacina de FMDV de emergência em animais.

f. Métodos para Fabricação

[0075] A presente invenção refere-se também a métodos para fabricação dos imunógenos de peptídeo de FMDV sintético, peptídeos de epítopo de Th, composições e formulações farmacêuticas/vacinas para elicitação de respostas imunes e proteção de animais contra infecção por FMDV.

[0076] Uso dos imunógenos de peptídeo de FMDV sintético provê várias vantagens significantes com relação a vacinas com vírus inati- vado tradicionais. Por exemplo, vacinas com vírus inativado tradicionais podem requerer equipamento de contenção biológica caro, oferecer sérios riscos de perigo biológico a indivíduos que trabalham diretamente no laboratório bem como o público no caso de equipamen- to/protocolos de contenção falharem. Em contraste, quaisquer materiais de perigo biológico são usados na fabricação de antígenos de pep- tídeo, o que reduz drasticamente os riscos para a saúde e segurança e elimina a necessidade de equipamento de contenção biológica caro. Também, imunógenos específicos de sítio apresentam concentrações molares altas de epítopos selecionados, o que ajuda a assegurar a segurança e a imunopotência da vacina empregando peptídeo antigê- nico de FMDV.

[0077] Ainda, o uso de peptídeos sintéticos definidos tendo epíto- pos de células B e Th conhecidos como imunógenos elimina respostas imunes específicas não-FMDV indesejadas causadas pela presença de materiais antigênicos tendo origem em células hospedeiro infectadas com FMDV ou infectadas com vírus recombinante ou de sistemas de expressão de proteína recombinante que podem ser co-purificados com proteínas de FMDV e/ou recombinantes, quando esses reagentes são usados como os ingredientes imunogênicos de uma vacina. Por exemplo, soros de porcos podem ter anticorpos para as células hos- pedeiro, ou para Escherichia coli, levedura ou baculovírus recombinan- te, que podem ser de reatividade cruzada com os materiais antigêni- cos usados em testes de diagnóstico baseados nos antígenos biologicamente derivados. Tais respostas imunes geradas por vacinas tendo esses imunógenos estranhos como ingredientes serão não protetoras. Em contraste, porcos ou gado recebendo a vacina de peptídeo de FMDV sintético aqui descrita gerarão respostas imunes focadas destituídas de anticorpos indesejados ou outras respostas imunes a proteínas se originando de células hospedeiro ou vetores de expressão.

[0078] Ainda, uma inconsistência ou erro que pode ser introduzido durante a produção de vírus inativado pode prevenir uma resposta imune apropriada e/ou desejada em um animal tratado. No entanto, inconsistências e/ou erros que podem ser ser introduzidos durante a síntese de imunógenos de peptídeo de FMDV sintético longos frequentemente não impedem ou previnem uma resposta imune desejada em um animal tratado. Na realidade, inconsistências/erros que seriam introduzidos durante síntese de peptídeo geram análogos de peptídeo múltiplos junto com a síntese de peptídeo alvo. Esses análogos podem incluir inserção, deleção, substituição e terminação prematura de ami- noácido. Conforme acima descrito, tais análogos de peptídeo são adequados em preparações de peptídeo como contribuintes para antigeni- cidade e imunogenicidade quando usados em aplicação imunológica ou como antígeno de fase sólida para propósito de imunodiagnóstico ou como imunógenos para propósito de vacinação.

[0079] Durante os 25 anos de experiência em aplicações imunoló- gicas de peptídeos sintéticos, a requerente constatou que a faixa em variabilidade estrutural que permite retenção de uma atividade imuno- lógica pretendida é muito mais acomodadora do que uma faixa em variabilidade estrutural permitida para retenção de uma atividade de fár- maco específica por um fármaco de molécula pequena ou as ativida- des desejadas ou toxidez indesejadas encontradas em moléculas grandes que são co-produzidas com fármacos biologicamente derivados. Desta maneira, análogos de peptídeo, ou intencionalmente projetados ou inevitavelmente produzidos por erros do processo sintético como uma mistura de subprodutos de sequência de deleção que têm propriedades cromatográficas e imunológicas similares ao peptídeo pretendido, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado. Misturas de análogos projetados e análogo não intencional são eficazes contanto que um procedimento QC de discernimento seja desenvolvido para monitorar ambos o processo de fabricação e o processo de avaliação de produto de modo a garantir a reprodutibilidade e a eficácia dos produtos finais empregando esses peptídeos.

[0080] Em vista das vantagens descritas acima, os peptídeos descritos na presente invenção podem ser prontamente sintetizados usando técnicas padrão, tal como o método de síntese de fase sólida e a miríade de aperfeiçoamentos disponíveis neste processo (Moore, V., 1992). Os peptídeos podem ser também feitos usando tecnologia de DNA recombinante incluindo moléculas de ácido nucleico, vetores e/ou células hospedeiro. Desta maneira, moléculas de ácido nucleico codificando o peptídeo antigênico de agrupamento de epítopo de célula B e célula T de FMDV e análogos imunologicamente funcionais do peptí- deo antigênico de agrupamento de epítopo de célula B de FMDV e seus compliments são também compreendidos pela presente invenção como parte da presente invenção. Similarmente, vetores, incluindo vetores de expressão, compreendendo moléculas de ácido nucleico bem como células hospedeiro contendo os vetores são também compreendidos pela presente invenção como parte da presente invenção.

[0081] Várias modalidades exemplares também compreendem métodos de produção dos peptídeos antigênicos de FMDV e análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos antigênicos de FMDV. Por exemplo, os métodos podem incluir uma etapa de incubação de uma célula hospedeiro contendo um vetor de expressão contendo uma mo- lecula de ácido nucleico codificando um peptídeo antigênico de FMDV e/ou análogo imunologicamente funcional do mesmo sob condições tais onde o peptídeo e/ou análogo é expresso.

[0082] Ainda, peptídeos podem ser produzidos através de síntese de fase sólida. A qualidade de peptídeos produzidos através deste processo químico pode ser controlada e definida e, como resultado, reprodutibilidade e antigenicidade, imunogenicidade e rendimento podem ser assegurados.

g. Modalidades Específicas

[0083] Modalidades específicas da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, o que segue: (1) Uma composição de vacina para a doença do pé-e-boca (FMD) compreendendo a) um antígeno de peptídeo de VP1 de FMDV sintético; b) um peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV sintético; e c) um veículo ou adjuvante de administração veterinaria- mente aceitável, onde o antígeno de peptídeo de VP1 de FMDV em (a) compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: i) SEQ ID NO: 1 ou 2; ii) um homólogo de (a); e iii) qualquer combinação de (a) ou (b), e onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV sintético em (b) não é covalentemente ligado ao antígeno de peptídeo em (a). (2) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o antígeno de peptídeo em (a) compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. (3) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o antígeno de peptídeo em (a) compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. (4) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o homólogo em (b) é um homólogo de SEQ ID NO: 2 compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3 a 23. (5) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o antígeno de peptídeo em (a) é covalentemente ligado no terminal amino ou car- boxila a um peptídeo compreendendo uma sequência de epítopo de Th. (6) A vacina para FMD de acordo com 5, onde a sequência de epítopo de Th é SEQ ID NO: 24. (7) A vacina para FMD de acordo com 5, onde o epítopo de T auxiliar é covalentemente ligado ao antígeno de peptídeo através de um espaçador compreendendo um resíduo épsilon lisina. (8) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV em (b) é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 34 a 95 e combinações das mesmas. (9) A vacina para FMD de acordo com 1, onde a quantidade total de antígeno de peptídeo em (a) é entre cerca de 10 μg a cerca de 1 mg por dose. (10) A vacina para FMD de acordo com 1, onde o veículo ou adjuvante de administração é selecionado do grupo consistindo em Montanide ISA 50V, Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, Emulsigen, Emulsigen D e um oligonucleotídeo de CpG. (11) Uma composição de vacina para doença do pé-e-boca (FMD) compreendendo a) um antígeno de peptídeo de VP1 de FMDV sintético selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 25-33 e combinações das mesmas. b) um peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV sintético selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 34-95; e c) um veículo ou adjuvante de administração veterinariamente aceitável. (12) A vacina para FMD de 11, onde o antígeno de peptí- deo em (a) é SEQ ID NO: 25, 27, 28, 29 e/ou combinações das mesmas. (13) A vacina para FMD de 11, onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV em (b) é SEQ ID NOs: 34-63, 90 e combinações das mesmas. (14) A vacina para FMD de 11, onde o antígeno de peptí- deo em (a) é SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29 e/ou combinações das mesmas, e onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV em (b) é SEQ ID NOs: 34-36, 90 e combinações das mesmas. (15) Um método para elicitação de uma resposta imune em um animal compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da vacina em 14 ao animal. (16) O método de 15, onde o animal é um porco. (17) Um método para proteção de um animal de infecção por FMD compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da vacina em 14 ao animal. (18) O método de 17, onde o animal é um porco. (19) A vacina para FMD de 11, onde o antígeno de peptí- deo em (a) é SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29, 31 e/ou combinações das mesmos. (20) Um método para elicitação de uma resposta imune em um animal compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da vacina em 19 ao animal. (21) O método de 20, onde o animal é uma vaca. (22) Um método para proteção de um animal de infecção por FMD compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da vacina em 19 ao animal. (23) O método de 22, onde o animal é uma vaca. (24) A vacina para FMD de 11, onde o antígeno de peptí- deo em (a) é SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 e/ou combinações das mesmas. (25) A vacina para FMD de 11, onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV em (b) é SEQ ID NOs: 91-95 e combinações das mesmas. (26) A vacina para FMD de 11, onde o antígeno de peptí- deo em (a) é SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 e/ou combinações das mesmas, e onde o peptídeo de epítopo de T auxiliar de FMDV em (b) é SEQ ID NOs: 91-95 e combinações das mesmas. (27) Um método para elicitação de uma resposta imune em um animal compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da vacina em 26 ao animal. (28) O método de 27, onde o animal é uma vaca. (29) Um método para proteção de um animal de infecção por FMDV compreendendo provisão de uma administração única de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina em 25 ao animal. (30) O método de 29, onde o animal é uma vaca.

[0084] Os exemplos que seguem servem para ilustrar a presente invenção e não devem ser usados para limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1

SÍNTESE DE PEPTÍDEOS DE FMDV

[0085] Métodos para síntese de peptídeos de FMDV que foram incluídos em composições farmacêuticas são descritos. Os peptídeos podem ser sintetizados em quantidades em escala pequena, que são úteis para estudos piloto de laboratório e de campo, bem como quantidades em grande escala (quilograma), que são úteis para produção industrial/comercial de formulações de vacina e ensaio.

[0086] Um repertório grande de peptídeos antigênicos de FMDV representando ambos os sítios de agrupamento de epítopo de células B e T de FMDV das proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B e 3D de FMDV tendo sequências com comprimentos de a partir de aproximadamente 10 a 70 aminoácidos foi projetado. Para alguns pep- tídeos, uma substituição de aminoácido foi feita em um sítio adequado para permitir formação de um peptídeo cíclico para exercer limitação para preservação de estrutura local de maneira a maximizar a reação cruzada com a proteína nativa correspondente (por exemplo, substituição para um resíduo cisteína). Peptídeos antigênicos de FMDV representativos são identificados na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 1-23).

[0087] Foram também sintetizados peptídeos antigênicos ligados a um peptídeo de Th combinatorial artificial para potencializar as respectivas imunogenicidades de cada peptídeo. Peptídeos antigênicos para FMDV representativos ligados ao peptídeo de Th combinatorial de SEQ ID NO: 24 (UBITh®) são identificados na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 24-33) e Tabelas 7 e 8 (SEQ ID NOs: 89-102).

[0088] Todos os peptídeos usados para teste de imunogenicidade foram sintetizados usando Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models 430A, 431 e 433, usando química Fmoc. Cada peptídeo foi produzido através de uma síntese independente em um apoio de fase sólida, com proteção Fmoc no terminal N e grupos de proteção de cadeia lateral de aminoácidos trifuncionais. Peptídeos completos foram clivados do apoio sólido e grupos de proteção de cadeia lateral foram removidos por ácido trifluoracético 90%. Preparações de peptídeo sintético foram avaliadas através de Espectrometria de Massa de Tempo- de-Voo de Dessorção a Laser Auxiliada por Matriz (MALDTOF) (Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight) para assegurar teor de aminoácido correto. Peptídeos sintéticos foram também avaliados através de HPLC de fase reversa para confirmar o perfil de síntese e concentração da preparação.

[0089] Apesar do controle rigoroso do processo de síntese (incluindo monitoramento da eficiência de acoplamento), análogos de peptí- deo foram também produzidos devido a eventos não intencionais durante ciclos de alongamento, incluindo inserção, deleção, substituição e terminação prematura de aminoácido. Desta maneira, preparações sintetizadas incluíam tipicamente análogos de peptídeo múltiplos junto com o peptídeo alvo. Apesar da inclusão de tais análogos de peptídeo não intencionais, as preparações de peptídeo sintetizadas resultantes eram, não obstante, adequadas para uso em aplicações imunológicas incluindo imunodiagnóstico (como antígenos de captura de anticorpo) e vacinação (como imunógenos de peptídeo). Tipicamente, tais análogos de peptídeo, ou intencionalmente projetados ou gerados através de processo sintético como uma mistura de subprodutos, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado, contanto que um procedimento de QC de discernimento seja desenvolvido para monitorar ambos o processo de fabricação e o processo de avaliação de produto para garantir a reprodutibilidade e eficácia do produto final empregando esses peptídeos.

[0090] Todos os peptídeos foram submetidos a processos de avaliação de produção de IFN-Y sorológicos de trabalho intenso e sensíveis ao tempo ou in vitro (incluindo ciclos iterativos de síntese de pep- tídeo, formulação de vacina, imunização animal) e teste de produção de IFN-Y sorológico e in vitro para fornecer peptídeos candidatos para teste adicional em animais alvo para as respectivas aplicações de diagnóstico e vacina. Formulações específicas usadas em vários exem- plos são descritas abaixo.

EXEMPLO 2 ENSAIOS E REAGENTES

[0091] Ensaios e reagentes para avaliação de peptídeos sintéticos e formulações da presente invenção foram desenvolvidos e descritos abaixo.

a. ELISAs Baseados em Peptídeo de VP1 (aa134-168) e VP1 (aa129-168) de FMDV

[0092] Ensaios ELISA para avaliação de várias amostras descritas nos Exemplos que seguem foram desenvolvidos e descritos abaixo.

[0093] As cavidades de placas de 96 cavidades foram revestidas individualmente por 1 h a 37° C com 100 μL de peptídeos alvo individuais, a 2 μg/mL (a menos que de outro modo mencionado), em tampão de NaHCO3 10 mM, pH 9,5 (a menos que de outro modo mencionado).

[0094] As cavidades revestidas com peptídeo foram incubadas com 250 μL de 3% em peso de gelatina em PBS em 37° C por 1 hora para bloquear sítios de ligação de proteína não específicos, seguido por três lavagens com PBS contendo 0,05% em volume de TWEEN® 20 e secas. Soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (a menos que de outro modo mencionado) com PBS contendo 20% em volume de soro de cabra normal, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEEN® 20. Cem microlitros (100 μL) dos espécimes diluídos foram adicionados a cada uma das cavidades e deixados reagir por 60 minutos a 37° C.

[0095] As cavidades foram então lavadas seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS a fim de remover anticorpos não ligados. IgG antissuíno de cabra conjugada à peroxidase de rábano silvestre foi usada como um traçador marcado para se ligar ao complexo de anticorpo/antígeno de peptídeo formado em cavidades positi- vas. Cem microlitros da IgG antissuíno de cabra marcada com peroxidase em uma diluição ótima pré-titulada e em 1% em volume de soro de cabra normal com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS foram adicionados a cada cavidade e incubados a 37° C por mais 30 minutos. As cavidades foram lavadas seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN® 20 em PBS para remover anticorpo não ligado e reagidas com 100 μL da mistura de substrato contendo 0,04% em peso de 3’,3’,5’,5’-Tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio por mais 15 minutos. Esta mistura de substrato foi usada para detectar o marcador peroxidase através de formação de um produto colorido. As reações foram paradas através da adição de 100 μL de H2SO4 1,0M e absorbância a 450 nm (A450) determinada.

[0096] Diluições de soro foram feitas de acordo com o propósito para detecção de anticorpos para FMDV nos soros animais: (a) Para identificação de infecção natural potencial, uma diluição de 1:20 foi usada, a leitura de A450 foi registrada e um controle negativo intrínseco embutido para cálculo de corte (cutoff) foi usado; ou (b) para a determinação de títulos de anticorpo de porcos que receberam formulações de vacina de FMDV baseada em peptídeo, diluições seriais de 10 vezes de soros de 1:10 a 1:10.000 foram testadas, e o título de um soro testado, expresso como Log10, foi calculado através de análise de regressão linear do A450 com o A450 de corte ajustado em 0,5. Detecção de anticorpos anti-FMDV específicos de isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2 e IgA) em soros foi medida, quando necessário, usando anticorpos monoclonais específicos para esses isotipos fornecidos pela Sero- tec. Títulos de anticorpo foram similarmente determinados conforme descrito acima.

[0097] Peptídeos de agrupamento de epítopo de célula B de VP1 de FMDV (SEQ ID NOs: 1-23), a 2 μg/mL usando 100 μL por cavidade em 10 mL de tampão de NaHCO3, pH 9,5, foram usados como os an- tígenos de revestimento nos respectivos ELISAs de VP1.

b. ELISAs Baseados em Peptídeo de Proteína 3B Não estrutural

[0098] ELISAs para reatividade de anticorpo no soro com proteína 3B não estrutural (NS) (Non-structural) de FMDV foram realizados conforme anteriormente relatado (Wang, C.Y. e outros, 2001) em uma diluição de 1:21. Soros de controles bovinos imunizados com peptídeo e negativos foram incluídos em cada teste. Os resultados obtidos são relatados em unidades OD após subtração do valor OD de corte (geralmente OD 0,220).

[0099] Este ensaio ELISA baseado em peptídeo 3B NS de FMDV é capaz de diferenciação de animais vacinados de animais infectados. Especificamente, animais vacinados e infectados podem ser distinguidos com base em se soros obtidos do animal reagem com proteínas de FMDV não estruturais. Em particular, soros obtidos de animais imunizados com formulações de vacina da presente invenção não reagem com as proteínas de FMDV não estruturais porque as formulações de vacina contêm apenas epítopos da proteína estrutural VP1. Desta maneira, apenas amostras de soro obtidas de animais infectados reagem com proteínas de FMDV não estruturais.

c. Sistema de Diagnóstico de Diferenciação de Animais Infectados de Vacinados (DIVA) (Differentiation of Infected from Vaccinated Animals)

[00100] Uso de ELISAs baseados em peptídeo de 3B NS de FMDV combinados com ELISAs baseados em peptídeo de VP1 de FMDV específico de sorotipo provê uma ferramenta valiosa e conveniente para (1) distinguir animais infectados de vacinados e (2) identificar o soroti- po particular de FMDV que o animal está infectado com ou vacinado contra. Desta maneira, esta combinação de ensaios ELISA provê uma avaliação conveniente e valiosa de eficácia de vacina para FMDV quando das provocações virais através de meios sorológicos.

d. Avaliação de Imunogenicidade

[00101] Os animais foram imunizados de acordo com métodos descritos nos Exemplos abaixo. Seguindo a administração das formulações de vacina, amostras de sangue foram obtidas e a imunogenici- dade foi avaliada.

[00102] Especificamente, amostras de animais imunizados foram obtidas em 0, 3 e 5 semanas pós-imunização inicial (wpi) (Weeks Post-Initial Immunization) para gado e em 0, 4 e 6 wpi para porcos. As amostras foram aquecidas a 56° C por 30 minutos para inativar fatores de complemento de soro. Imunogenicidade das formulações contendo os peptídeos sintéticos foi avaliada através de ELISAs baseados em peptídeo usando peptídeos antigênicos de VP1 de FMDV como o antí- geno de fase sólida conforme acima descrito. Soros de animal experimentais serialmente diluídos foram testados e títulos positivos foram expressos como Log10 da diluição recíproca.

[00103] Amostras soropositivas foram agrupadas por grupo e a atividade de neutralização foi determinada para vários isolados de FMDV conforme descrito abaixo.

e. Vírus de FMDV

[00104] Os animais foram submetidos a estudos de provocação (discutido nos Exemplos abaixo) usando várias cepas de FMDV, incluindo FMDV A12 e A24 de sorotipo A; O1, O2, OTaiwan, OOzk, Omyanmar, de sorotipo O; Cepa Asia 1XJ; etc. As cepas de FMDV usadas nesses experimentos foram cultivadas em monocamadas de células de rim de hamster bebê (BHK) (Baby Hamster Kidney) e purificadas sob limitação no Plum Island Animal Disease Center, USDA (Greenport, NY) e/ou National Institute of Animal Health, Taiwan (NIAHT). Vírus foi também obtido para uso industrial da PRC’s Ministry of Agriculture reference laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute of the Chi- nese Academy of Agriculture Sciences, essencialmente conforme descrito anteriormente (Brown, 1963), com um tratamento do pelete ou com SDS 1% ou Nonidet P-40 1% antes da centrifugação através de um gradiente de sacarose 15-45%.

[00105] Picos de vírus purificado foram identificados e isolados através de bombeamento dos conteúdos de cada tubo de centrifuga através da célula de fluxo de um espectrofotômetro ajustado a 260 nm. f. Avaliação Sorológica de Atividade de Neutralização de FMDV como Índice de Neutralização

[00106] Amostras de soro foram processadas a partir de sangue obtido de animais e mantidas a -20° C até serem testadas. Enumeração dos vírus neutralizados por uma diluição 1:100 de amostras de soro foi realizada através de determinações de neutralização em uma série de cargas virais de entrada crescentes, usando alíquotas (10.000 MPD50) dos vários sorotipos preparados conforme acima descrito.

[00107] Amostras de soro foram avaliadas usando métodos anteriormente descritos (Morgan, 1990). Amostras que exibiram uma redução Log10 2,5 de microplacas de FMDV em diluição 1:100 foram consideradas ser altamente previsivas de imunidade protetora contra infecção por FMDV.

g. Ensaio de Anticorpo de Neutralização Específico de FMDV: Um Teste de Neutralização Beta Padrão

[00108] Teste de neutralização beta padrão foi realizado em placas de 96 cavidades através de incubação de diluições de duas vezes seriais de cada soro com 100 ou 200 TCID50 (50% de Dose Infecciosa de Cultura de Tecido (50% Tissue Culture Infectious Dose) de FMDV por 30 min a 37° C. Atividade viral remanescente foi determinada em placas de 96 cavidades contendo monocamadas frescas de células BHK- 21. Títulos de neutralização em soro foram determinados como a diluição em soro log10 neutralizando 50% do inóculo de vírus.

[00109] Por exemplo, o ensaio quantitativo para anticorpos que neutralizam FMDV O1 Taiwan foi realizado contra células BHK-21 em placas de microtitulação de fundo plano usando volumes iguais de 200 μl. Cinquenta microlitros (50 μl) de soro diluído de pré- e pós- imunização foram coletados dos animais experimentais individuais. Esses soros foram separadamente misturados com uma alíquota de 50 μl contendo 200 TCID50 de FMDV O 1 Taiwan e incubados por uma hora a 37° C. Cem microlitros (100 μl) de meio de cultura (MEM (Gibco) suplementado com soro bovino fetal 10,0%) contendo 2,5 x 105 células BHK-21 foram então adicionados a cada ensaio. As culturas foram examinadas microscopicamente após 48 horas quanto ao efeito cito- pático (CE) (Cytopathic Effect). Os títulos foram expressos como a recíproca da diluição final de soro fornecendo 50% de inibição do CE induzido por vírus 200 TCID50.

h. Animais usados nos estudos de imunogenicidade

[00110] Porquinhos-da-índia: Estudos de imunogenicidade foram conduzidos em Porquinhos-da-índia Duncan-Hartley machos e fêmeas adultos, puros, maduros (300-350 g/PC). Os experimentos utilizaram 3 porquinhos-da-índia por grupo.

[00111] Porcos de aproximadamente 4 a 12 semanas de vida de uma fazenda livre de patógeno específico (SPF) (Specific Pathogen- Free) foram marcados na orelha para estudos de imunogenicidade e divididos em grupos contendo 3 a 6 leitões/grupo de acordo com protocolo de estudo.

[00112] Gado: Estudos de imunogenicidade foram conduzidos em bezerros saudáveis entre 2 a 6 meses de vida que foram obtidos de fornecedores locais e divididos em grupos contendo 3 a 5 vacas/grupo de acordo com protocolo de estudo. Os animais usados em um estudo de provocação viral foram alojados em uma instalação de contenção de agricultura de nível de biossegurança 3 e foram deixados aclimatar por 1 semana antes do início do estudo.

[00113] Cabras: Estudos de imunogenicidade foram conduzidos em cabras saudáveis obtidas de fornecedores locais.

[00114] Antes da imunização, amostras de soro de animais individuais foram testadas quanto à presença de anticorpos de neutralização específicos para FMDV para confirmar que os animais não tinham sido anteriormente vacinados ou infectados com FMDV. Soros desses animais foram também avaliados usando os ensaio ELISA para 3B NS e VP1 de FMDV descritas acima para assegurar mais que os animais estavam livres de anticorpos para essas proteínas também.

[00115] Cada animal foi imunizado com 25 a 300 μg por dose da vacina, dependendo da espécie e do protocolo.

i. Composições

[00116] As composições farmacêuticas e formulações de vacina usadas em cada experimento são descritas em mais detalhes nos Exemplos descritos abaixo. Em suma, as formulações especificadas em cada um dos grupos de estudo geralmente continham: (1) um imunógeno de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B de VP1 único selecionado de SEQ ID NOs: 1-23, 25-32; (2) uma mistura de imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B de VP1 incluindo homólogos selecionados de SEQ ID NOs: 1-23 e 25-32; ou (3) uma mistura de imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B de VP1 selecionados de SEQ ID NOs: 1-23 e 2532 suplementados com uma mistura de peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógenos de FMDV selecionados de SEQ ID NOs: 3392. Os peptídeos foram emulsificados em uma formulação adjuvante específica. As vacinas foram geralmente preparadas dissolvendo os imunógenos de peptídeo de FMDV sintético em água em cerca de 25 a 300 μg/mL e formuladas com Seppic Montanide ISA 50V2 em emulsões água-em-óleo (a/o) (1:1 em volume). As formulações de vacina foram mantidas em temperatura ambiente por cerca de 30 min e vorte- xadas por cerca de 10 a 15 segundos antes da imunização.

[00117] Alguns animais foram imunizados com 2 doses de uma formulação de vacina específica, que foram administradas no tempo 0 (primeira) e 3 wpi (reforço) intramuscularmente (IMO). Esses animais imunizados foram então testados para avaliar a imunogenicidade dos imunógenos de epítopo de FMDV sintético presentes na formulação de vacina. Os animais restantes foram imunizados com uma dose única de uma formulação de vacina específica para avaliar se os peptídeos usados na formulação eram capazes de montar eficientemente uma resposta de anticorpo de neutralização respeitável para qualificar como uma vacina de emergência para FMDV.

EXEMPLO 3 ENSAIOS FUNCIONAIS DE CÉLULA T PARA AVALIAÇÃO E IDEN-TIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS DE AGRUPAMENTO DE EPÍTOPO DE TH ENDÓGENOS DE FMDV

[00118] Os procedimentos para experimentos funcionais de célula T são descritos em detalhes como segue.

a. Isolamento, congelamento e descongelamento de Células Mo- nonucleares de Sangue Periférico (PBMCs)

[00119] Sangue heparinizado foi coletado e PBMCs foram isoladas através de centrifugação de gradiente de densidade usando Ficoll- Hypaque. Após duas lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS), PBMCs foram ressuspensas em meio de cultura celular consistindo em RPMI 1640 suplementado com FCS 10%. Para alguns experimentos, PBMCs isoladas foram congeladas, armazenadas em N2 líquido e descongeladas para subsequente cultivo in vitro.

b. Quantificação de IFN-Y no soro

[00120] Um ELISA sanduíche foi usado para quantificar IFN-Y em amostras de soro coletadas de porcos ou gado. IFN-Y foi quantificado antes da vacinação e no dia 21 ou 28 antes dos animais terem sido provocados com FMDV. O ensaio foi realizado primeiro revestindo cavidades individuais das placas de ELISA Maxisorb (Nunc) com o anticorpo de captura (comprado da PBL Biomedical Laboratories, USA) a 0,5 μg por cavidade. Sítios não ocupados pelos anticorpos imobilizados foram bloqueados adicionando 200 μl de tampão de bloqueio de ELISA em cada cavidade de ensaio. Após lavagem das placas 4 vezes cada vez com 200 μl de PBS contendo Tween 20 0,025% (PBS-T20), amostras de soro individualmente diluídas em tampão de diluição de ELISA (em 1 e 10, 25 e 75) foram adicionadas às cavidades de ensaio. As placas foram incubadas por 1 h a 37° C para permitir ligação da ci- tocina ao anticorpo de captura anti-IFN-Y de fase sólida. As placas foram então lavadas 4 vezes com PBS, e a detecção de anticorpo anti- IFN—Y foi adicionada às cavidades de ensaio a 0,25 μg por cavidade. Seguindo incubação por 1 h a 37° C, as placas foram lavadas e 100 μl de conjugado de proteína A foram adicionados a cada cavidade de teste. Conjugado em excesso foi retirado (6 vezes com PBS) após o período de incubação de 1 h e 100 μl da solução de substrato recomendada foram então adicionados para detecção de reação. Desenvolvimento de cor na cavidade de ensaio individual foi parado 30 minutos depois através da adição de 50 μl de H2SO4 1N a ela, e a intensidade da cor foi registrada através da medição da absorbância a 450 nm. Os resultados foram calculados primeiro comparando os valores de A450 medidos obtidos de um soro individual contra um gráfico de calibragem que foi construído através de diluições de ensaio de um IFN-Y recombinante padrão (PBL Biomedical Laboratories, USA) sob as mesmas condições de teste. A resposta de IFN-Y no soro de cada animal em 28 dias pós-vacinação foi representada pela subtração do valor medido para o animal antes da imunização. Os resultados finais foram expressos como pg/ml de soro.

c. Ensaio de IFN-Y produzido por PBMC

[00121] PBMCs de animais vacinados foram culturadas a 2,5 x 106 células/mL em cavidades individuais de uma placa de cultura de 24 cavidades (Nunc) na presença de 10,0 μg da composição de imunó- geno de vacina selecionado. Culturas de controle negativo contendo PBMC sozinha sem antígeno de estimulação foram também incluídas. Todas as culturas foram mantidas a 37° C por 3 dias em uma incubadora de CO2 5,0%. Sobrenadantes foram coletados 3 dias após início da cultura, e os teores de IFN-Y foram medidos usando o ensaio quantitativo descrito acima. EXEMPLO 4 PROCEDIMENTOS DE PROVOCAÇÃO COM FMDV EM ANIMAIS SUÍNO E GADO

[00122] O procedimento de provocação foi, em geral, baseado no protocolo descrito no capítulo da doença do pé-e-boca do OIE Manual of Standards. As cepas de FMDV usadas nos procedimentos de provocação incluíam: O-1Taiwan(99), O-1Myanmar(02), O-1Ozk(China, 93), O-1 Campos, and Asia 1(XJ or Jiansu, China, 05). O procedimento para estudos de provocação de suíno conduzidos na China foi modificado pela administração do vírus FMDV através de via intramuscular de acordo com as orientações do Ministério da Agricultura.

a. Suíno

[00123] A dose infecciosa de proteção padronizada (PD50) (isto é, a dosagem quando 50% dos animais testados foram protegidos) foi medida em animais. A PD50 em suíno foi determinada usando 15 porcos pesando em torno de 40 kg (aleatoriamente divididos em três grupos cada um contendo 5 porcos) em testes de potência. Os três grupos foram administrados com 1 dose, 1/3 dose e 1/9 dose das formulações de vacina de teste, respectivamente. Modificações da dosagem foram também usadas para avaliação da potência de uma formulação parti- cular, tais como dosagens contendo dose 2X, 1X, 0,5X e 0,25X. Ainda, avaliação rápida de formulações usando uma dose 1X foi também fre-quentemente usada.

[00124] Para avaliação de eficácia de formulação de vacina, os porcos foram divididos em grupos contendo 3 (ao invés de 5) porcos por grupo dependendo do projeto experimental e da disponibilidade de animais no momento para o estudo particular. Cada porco nesses três grupos foi inoculado atrás das orelhas com vacina através de uma via intramuscular (IM). 28 dias após uma única vacinação, 15 porcos vacinados, junto com 2 porcos controle, foram, cada um, provocados através de inoculação dos animais com 1.000 ID50 de vírus virulento da cepa tipo O de FMD de suíno conforme indicado.

[00125] Em um experimento ideal, lesões vesiculares devem ter sido encontradas em pelo menos uma pata de porcos controle após 10 dias de monitoramento. Ainda, quaisquer sintomas ou sinais de FMD devem ser observados em porcos vacinados, se não a proteção de vacina falha. PD50 do produto de vacina foi calculada usando o Método Reed-Muench com base nos resultados de testes de provocação. Doses alvo da vacina devem conter minimamente 3 PD50 a fim de passar no teste de liberação de qualidade.

[00126] Em Taiwan, provocação viral foi conduzida através de inoculação com 1 x 105 TCID50, previamente titulado em cultura de tecido, de vírus FMDV O1 Taiwan (cerca de pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade de vírus administrada de acordo com as orientações PRC) nos bulbos do calcanhar das pernas dianteiras dos porcos dentro da instalação P3 no National Institute for Animal Health, Tamsui, Taiwan, de acordo com as orientações do Conselho de Agricultura. Animais experimentais foram monitorados quanto a sinais clínicos de FMD durante um período de observação de 14 dias. Essas observações incluíam (1) registro diário de temperatura corporal, (2) monitoramento de qualquer desenvolvimento de claudicação nas pernas dos animais e (3) monitoramento de quaisquer lesões vesiculares adquiridas nas faixas coronárias das pernas e focinhos dos animais. A PD50 do produto de vacina foi calculada usando o Método Reed-Muench com base nos resultados de testes de provocação. Doses alvo da vacina devem conter minimamente 3 PD50 para permitir liberação da vacina.

b. Gado

[00127] Em bovino, a provocação viral foi introduzida através de inoculação intradermolingual (IDL) de 1 mL (100 μL em cada um dos 10 sítios na língua) de macerado, titulados e ajustados para conter um total de 1 x 104 TCID50 de FMDV (Unidade Infecciosa Bovina ou BIU (Bovine Infectious Unit)). Os animais foram examinados diariamente monitorando as temperaturas retais e um score de proteção baseado no momento de aparecimento e no número e severidade de lesões foi determinado.

[00128] A proteção total foi definida como ausência completa de lesões (score 0) e valores de score abaixo de 8 foram considerados como proteção parcial. Score clínico foi calculado como segue i) uma temperatura corporal elevada de 40° C (score de 1), < 40,5 (score de 2) ou >41 (score 3); ii) apetite reduzido (1 ponto) ou nenhuma ingestão de alimento ou alimento deixado do dia anterior (2 pontos); iii) claudicação (1 ponto) ou relutância em ficar de pé (2 pontos); iv) presença de calor e dor após apalpamento nas bandas coronárias (1 ponto) ou não ficando de pé sobre o pé afetado (2 pontos); v) vesículas nos pés, dependente do número de pés afetados, com um máximo de 4 pontos; e vi) lesões visíveis na língua (1 ponto), gengivas ou lábios (1 ponto) ou focinho (1 ponto), com um máximo de 3 pontos.

[00129] Todos os experimentos com animais vivos foram realizados sob as orientações do OIE Manual of Standards, Ministério da Agricultura, PRC ou Conselho de Agricultura, Taiwan. Modificações para a dosagem foram também feitas para avaliação da potência de uma formulação particular, tais como dosagens contendo dose de 2X, 1X, 0,5X e 0,25X. Também, avaliação rápida de formulações usando uma dose 1X foi também frequentemente usada.

EXEMPLO 5 ANÁLISE COMPARATIVA DAS SEQUÊNCIAS DE GENOMA COMPLETAS DE ISOLADOS DE FMDV USANDO SEQUÊNCIA DE ISOLADO DE FMDV OTAIWAN99 COMO A ESTRUTURA PRINCIPAL DE AMINOÁCIDO E LOCALIZAÇÃO DOS EPÍTOPOS DE B E TH ENDÓGENOS DE FMDV PARA PROJETO DE IMUNÓGENO DE PEPTÍDEO

[00130] Após revisão completa da organização de genoma de FMDV, sequência de aminoácido de poliproteína do sorotipo Otaiwan 99 de FMDV foi empregada como a base para a identificação e projeto de peptídeos antigênicos de FMDV. Tais peptídeos, uma vez com a estrutura principal estabelecida, podem ser ajustados para representar sequências para sorotipos múltiplos para aplicações regionais. Alinhamento da sequência de FMDV Otaiwan 99 com as sequências de genoma completas de 103 isolados de FMDV representando todos os sete so- rotipos, avaliado através dos números de acesso GenBank correspondentes conforme descrito anteriormente (Carrillo, 2005), identificou regiões de proteína de FMDV altamente conservadas indicando limitações funcionais para variabilidade bem como novos motivos virais com relevância biológica potencial. Especificamente, as sequências ao redor do sítio de ligação ao receptor “RGD” de proteína VP1 de FMDV e suas sequências de consenso relacionadas a sorotipo (isto é, o ami- noácido que apareceu com mais frequência para cada posição com base em comparação de sequências de isolados de FMDV de um so- rotipo específico sendo projetado) foram o modelo para o projeto de imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B, enquanto as regiões de proteína de FMDV altamente conservadas foram os sítios alvo para projeto dos imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV. Após avaliação através de ambos os ensaios sorológico e celular com procedimentos descritos em detalhes no Exemplo 3, uma série de peptídeos de agrupamento de epítopo de células B e T auxiliar (SEQ ID NOs: 1 a 102) foi identificada para aplicação em formulações de vacina para FMDV represen-tando cepas e sorotipos diferentes conforme mostrado na Figura 1 e Tabelas 1 a 8.

EXEMPLO 6 ANÁLISE DE IMUNÓGENOS DE PEPTÍDEO DE AGRUPAMENTO DE EPÍTOPO DE CÉLULA B DE FMDV COMO COMPONENTES- CHAVE PARA VACINAS BASEADAS EM PEPTÍDEO DE FMDV a. História do Projeto

[00131] Cada vacina e produto imunoterapêutico requer seu próprio foco e abordagem de projeto com base no mecanismo de doença específico e na(s) proteína(s) alvo requeridas para intervenção. Os alvos nos quais os projetos são modelados podem incluir proteínas celulares envolvidas em um curso de doença ou um agente infeccioso onde várias proteínas podem estar envolvidas.

[00132] Conhecimento anterior da identificação e distribuição de epítopo de células B e T é também benéfico para o processo de projeto molecular. Um processo extensivo de validação sorológica é requerido uma vez a(s) molécula(s) alvo tendo sido selecionada(s). Subsequentemente, estudos de imunogenicidade piloto consecutivos em animais pequenos são conduzidos para avaliar as propriedades funci- onais de anticorpos elicitados pelas formulações de vacina dos peptí- deos de projeto. Tal aplicação sorológica é então realizada em animais da espécie alvo para validação adicional da imunogenicidade da vacina e propriedades funcionais dos anticorpos elicitados. Todos os estudos são conduzidos em grupos paralelos múltiplos com soros coletados dos hospedeiros imunizados para avaliação. Estudos de provocação iniciais na espécie alvo são também realizados para validar mais a direção do projeto. Peptídeos alvo são então preparados em misturas variáveis para avaliar a diferença sutil em propriedade funcional relacionada às respectivas interações dentre construtos de peptídeo quando usados em combinação para preparar os respectivos projetos de for-mulação. Após avaliações adicionais, os construtos de peptídeo finais, composições e peptídeos e formulações dos mesmos, junto com os respectivos parâmetros físicos das formulações, são estabelecidos levando ao processo de desenvolvimento de produto final.

[00133] Vasta experiência de projeto permite o desenvolvimento dos produtos de vacina de próxima geração do encontro até comercialização conforme mostrado na Figura 2 em um andamento acelerado.

[00134] Durante o desenvolvimento de peptídeos de FMDV específicos e composições, os objetivos de desenvolvimento que seguem foram considerados 1) identificação de um sítio alvo de domínio de alça de VP1 suficiente para elicitar anticorpos de neutralização ampla, 2) projeto do sítio alvo de peptídeo para apresentação ótima ao sistema imune, 3) seleção de sítios de UBITh® para imunopotência nas espécies alvo porco e ruminante, 4) incorporação desses componentes essenciais em um projeto de imunógeno de peptídeo que poderia ser produzido com custo eficaz e 5) desenvolvimento de formulações de vacina, tamanho de dose e protocolo de imunização para imunidade protetora. O objetivo geral de análise e avaliação de imunógenos de peptídeo de FMDV necessitou investigação empírica intensa do banco de dados de sequência de FMDV e modelos moleculares seguido pela síntese de um grande número de imunógenos candidatos para formulações de vacina para imunizar animais. Um total de 831 porcos e 860 gados estava em estudos de título de anticorpo de imunogenicidade e neutralização para encontrar composições e formulações capazes de proteger eficazmente animais suíno e gado quando da provocação viral após apenas administração única. No total, 25 estudos em suíno e 32 estudos em gado, em adição a estudos iniciais em porquinhos-da- índia e cabras que estavam envolvidos no desenvolvimento da presente invenção.

b. Identificação dos Alvos de Domínio de Alça de VP1 Mais Potentes

[00135] O elemento crítico para uma vacina de peptídeo eficaz para FMDV é a seleção de uma sequência precisa do domínio de alça G-H de VP1 que seja ideal para apresentação de epítopos de célula B que elicitam a produção de anticorpos de neutralização. A estrutura para a apresentação ideal de um domínio por um imunógeno de peptídeo pode ser afetada por uma mudança tão pequena quanto a posição de um único aminoácido. Modelo molecular disponível para a estrutura con- formacional da proteína do capsídeo VP1 foi examinado e comparações de sequência dentro desta região hipervariável foram avaliadas na determinação que imunógenos sintéticos com boas reatividades cruzadas para VP1 devem incluir um segmento prolongado do domínio de alça.

[00136] Imunógenos de peptídeo tendo sítios alvo de VP1 foram produzidos compreendendo aa134-159 ou aa134-169 com base na sequência de FMDV A12 e sorotipo A conforme mostrado na Tabela 8. A imunogenicidade dos peptídeos foi determinada em composições contendo os peptídeos sozinhos ou em composições que também incluíam epítopos de Th endógenos de FMDV ou epítopos de Th extrín- secos para auxílio de célula T suplementar. Ensaios de imunogenici- dade foram também conduzidos em peptídeos que tinham e não tinham limitações cíclicas para estabilizar a estrutura da alça. Ciclização de peptídeos foi facilitada substituindo resíduos de aminoácido em posições específicas com resíduos cisteína para criar uma ligação dissul- feto (por exemplo, posições de VP1 134 (N->C) e 158(Q->C).

[00137] Composições contendo vários peptídeos foram avaliadas quanto à imunopotência em porquinhos-da-índia. A Tabela 9 provê os resultados experimentais obtidos de uma avaliação de vários peptí- deos. A Tabela 9 mostra: i. Construtos de peptídeo mais longos proveram respostas de neutralização melhores. Por exemplo, a SEQ ID NO: 97 provê respostas de neutralização melhores comparado com SEQ ID NO: 96. Ainda, extensões adicionais dos sítios alvo para resíduo 129 (SEQ ID NO: 99) também provaram ser valiosas para certas aplicações. ii. Peptídeos ciclizados proveram atividades de neutralização maiores comparado com peptídeos que não continham essa estrutura. Por exemplo, peptídeo cíclico SEQ ID NO: 98 proveu atividades de neutralização maiores comparado com SEQ ID NO: 97. iii. Th extrínseca provida por um sítio de Th de um epítopo de Th artificial UBITh® (SEQ ID NO: 24) ligado ao domínio de VP1 de FMDV aumentou a eficácia de neutralização naqueles construtos que não continham este epítopo. Por exemplo, a SEQ ID NO: 100 proveu melhor atividade de neutralização comparado com SEQ ID NOs: 99, 98, 97 e 96. iv. imunogenicidade foi aumentada mais pela adição de epí- topos de Th extrínsecos nas composições.

[00138] Em vista desses resultados, um peptídeo cíclico contendo o sítio alvo de VP1 prolongado dos aminoácidos 129 a 169 foi determinado ser o mais imunopotente (por exemplo, SEQ ID NO: 99).

c. Projeto de Sítios Alvo de VP1 Específicos para Sorotipo

[00139] O banco de dados de sequência de FMDV para FMDV global, provido pelo lab de referência mundial em Pirbright, RU, foi pesquisado para obter os domínios de alça de VP1 variáveis (aminoácidos 129-169) para subtipos de sorotipos O, A, Asia, C e outros. Aminoáci- dos de consenso para cada posição foram então projetados conforme mostrado na Tabela 2. Sequências alvo de biblioteca combinatorial conforme mostrado na Tabela 8 (SEQ ID NOs: 101 e 102) tendo ami- noácidos múltiplos em uma única posição foram também feitas para compreender ainda mais amplamente a variabilidade antigênica do domínio de alça de VP1.

[00140] Uma comparação do teste de imunogenicidade usando uma sequência de consenso única (Tabela 11, SEQ ID NO: 25) com o teste de imunogenicidade usando os alvos de biblioteca combinatorial (Tabela 10, SEQ ID NOs: 98 e 99) mostra que a sequência de consenso proveu eficácia equivalente na amplitude de cobertura de sorotipo conforme julgado pelos títulos de ELISA baseados em VP1 para imu- nogenicidade e por índices de neutralização para cepas de FMDV dos respectivos sorotipos para essas duas abordagens (Tabelas 10 e 11). Desta maneira, para facilidade de fabricação e QC, os sítios de VP1 alvo ciclizados com sequência de consenso única e algumas sequências de VP1 específicas escolhidas de sorotipos específicos com base em necessidades regionais foram selecionados conforme mostrado em SEQ ID NOs: 2-23 e 25-33.

d. Seleção de epítopo de Th potente para potencializar a imuno- genicidade de VP1

[00141] Investigadores anteriores identificaram sítios de Th dentro de antígenos de FMDV, tal como o epítopo de VP1 21-40, e os incorporaram em seu projeto de imunógenos de VP1 sintéticos. No entanto, estudos de imunogenicidade em porcos e gado mostraram que esses sítios de Th endógenos de FMDV não são completamente eficazes para aumentar a imunogenicidade de VP1 nas espécies alvo devido à sua promiscuidade limitada e restrição genética. Desta maneira, o epí- topo de Th de FMDV parcialmente eficaz não foi usado, mas substituído com o epítopo de Th artificial UBITh® mais potente para potencializar o imunógeno de peptídeo na alça em VP1 de FMDV. Os sítios de UBITh® artificiais incorporam motivos de Th, incluindo posições de Th de biblioteca combinatorial, que foram projetados para acomodar as responsividade de célula T variável de populações geneticamente diversas. Esta mudança em epítopos de Th resultou em uma perda de uma resposta de memória anti-FMDV homóloga potencial (em caso de exposição), mas proveu responsividade imune mais ampla e mais potente. A sequência de UBITh® artificial (SEQ ID NO: 24) provou imuno- potência em espécies múltiplas, incluindo suíno.

[00142] Construtos usados no experimento sumarizado pela Tabela 10 incluíam o sítio de UBITh® artificial (SEQ ID NO: 24), épsilon lisina como o espaçador e sítios alvo de VP1 cíclicos de posições de amino- ácido 134 a 169 ou para o sorotipo O ou sorotipo Asia projetados como bibliotecas combinatoriais (SEQ ID NOs: 101 e 102). Ambos os construtos eram imunogênicos conforme mostrado por respostas de anticorpo e neutralização (expressas como índice de neutralização) de porquinhos-da-índia imunizados.

[00143] A Tabela 11 mostra a responsividade de porquinhos-da- índia a um imunógeno de sorotipo O similar tendo o sítio UBITh® (SEQ ID NO: 24) ligado através de um espaçador épsilon Lisina a um sítio alvo de VP1 cíclico das posições de aminoácido 129 a 169 com uma sequência de consenso O (SEQ ID NO: 25). Este construto de VP1 contendo sequência de consenso O também mostrou imunogenicidade forte conforme evidenciado pela resposta de anticorpo de neutralização ampla potente logo nas 3 semanas pós-imunização inicial (Tabela 11) .

e. Amplitude Inesperada de Resposta de Neutralização

[00144] Os soros imunes de porquinho-da-índia analisados quanto a atividades de neutralização nas Tabelas 10 e 11 mostraram neutralizações inesperadamente amplas. Especificamente, os imunógenos de sorotipo O de SEQ ID NOs: 101 e 25 elicitaram anticorpos de neutralização contra dois subtipos I, e também proveram neutralização de subtipos de sorotipos A e Asia. Esses resultados sugerem um potencial dos imunógenos de FMDV UBITh® para eficácia ampla contra so- rotipos múltiplos por imunógenos individuais.

[00145] Tal amplitude em neutralizações de sorotipo pode ser também provida por combinação de vários imunógenos conforme mostrado na Tabela 12 (vacina de UBI FMDV O que continha uma mistura de três peptídeos de SEQ ID NOs: 25, 27 e 28) em uma vacina única quando soros de porcos imunizados e provocados demonstraram amplitude em índices de neutralização contra OTaiwan, OManisa, OCampos e OMyanmar.

f. Testes de Imunização/Provocação em Suíno

[00146] Em três testes de imunização/provocação separados em suíno, a espécie alvo, a primeira vacina de peptídeo sintético Untied Biomedical, Inc. (UBI) para FMDV, a UBITh® FMDV-O Vaccine, foi provada ser protetora contra provocação infecciosa com cepa FMDV O1Taiwan. Os testes foram feitos em 3 instituições separadas incluindo o National Institute of Animal Health Taiwan (NIAHT) e o USDA Plum Island Animal Disease Center (PIADC).

[00147] Os resultados desses experimentos são sumarizados na Tabela 13. Os grupos 1-4 receberam 2 doses de UBITh® FMDV- OConsensus (SEQ ID NO: 25, peptídeo 2570) Vaccine. As doses variaram de 25, 50, 100 a 300 μg (Grupos 1 a 4). Os grupos 5-7 eram controles de placebo.

[00148] Todos os porcos foram provocados por injeção no bulbo do calcanhar com 104,5 TCID50 de FMDV O1Taiwan (vírus foi cultivado ou em células de rim de hamster bebê ou em porcos). Os porcos foram provocados em intervalos de 2 a 10 semanas seguindo suas últimas imunizações. Todos os porcos imunizados foram protegidos incluindo os 15 porcos imunizados com UBITh®. Imunidade protetora persistiu nos porcos imunizados com UBITh®, até a semana 10. Evidência de imunidade protetora até 20 semanas seguindo a última imunização, conforme mostrado por título de anticorpo de neutralização em porcos experimentalmente imunizados, mas não provocados, foi também obtida.

[00149] Os animais vacinados tinham todos níveis no soro signifi- cantes de anticorpos de neutralização e foram protegidos de provocação. As infectividades dos estoques de provocação de vírus usados nos 3 testes separados foram estabelecidas pela taxa de infecção de 100% dos porcos imunizados com placebo. Desta maneira, os resultados de todos os 3 testes foram validados. Em vista dos resultados obtidos, a vacina UBITh® FMDV-OConsensus (SEQ ID NO: 25, peptídeo 2570) proveu imunidade protetora integral com um mínimo de 2 imunizações de tamanho de dose de 25 μg (Grupo 1).

g. Amplitude de Imunidade Protetora em Suíno Provocado

[00150] Outro estudo de provocação foi conduzido com vacina UBITh® FMDV O contendo uma quantidade igual de três construtos de VP1 O (contendo sequências de cepas 2570a de consenso, OOzk/93, OMyanmar representadas por SEQ ID NOs: 25, 27 e 28, respectivamente) em uma dose de 25 μg por dose e imunizados nas semanas 0 e 3 em um regime de duas doses. Todos os seis porcos foram provocados similarmente por FMDV O1Taiwan e foram todos protegidos. Soros foram coletados dos seis porcos imunizados para o teste de provocação e anticorpos de neutralização foram determinados para subtipos O de FMDV altamente prevalentes, O1Taiwan, OManisa, OMyanmar e OCampos (Tabela 12). Todos os porcos produziram níveis de anticorpos de neutralização O1Taiwan compatíveis com imunidade sólida, que também continham respostas de neutralização mais fortes contra OManisa, OMyanmar e OCampos, indicativo de imunidade protetora mais dependente em subti- pos de sorotipo O.

h. Imunogenicidade em Ruminantes

[00151] A imunogenicidade da UBITh® FMDV-O OConsensus (SEQ ID NO: 25, peptídeo 2570) Vaccine foi mostrada em uma espécie de ruminante em um teste de imunogenicidade de 12 cabras. As cabras foram imunizadas ou com duas doses nas semanas 0 e 8 ou três doses nas semanas 0, 4 e 8. As doses foram 30 μg, 100 μg ou 300 μg. A eficácia foi avaliada através da determinação de níveis no soro de anticorpos de neutralização contra FMDV O1Taiwan. Níveis de anticorpo de neutralização previsivos de proteção foram obtidos 12 semanas seguindo a última imunização na semana 8 (isto é, durante a duração de 20 semanas do estudo). Ambos os programas de duas doses e três doses foram igualmente eficazes, e a dose de 30 μg foi tão eficaz quanto a dose de 300 μg. Desta maneira imunogenicidade foi mostrada para a UBITh® FMDV-O Vaccine em uma espécie ruminante alvo, em um tamanho de dose e formulação de vacina equivalentes àquelas usadas para imunidade protetora em suíno quando administrada em 2 ou 3 doses.

i. Conclusões e Interpretações das Constatações

[00152] Os resultados dos experimentos descritos acima podem ser sumarizados como segue: O Vaccine baseada em UBITh® FMDV VP1 (SEQ ID NO: 25) protegeu eficazmente todos os porcos vacinados (15/15) de provocação com FMDV OTaiwan em estudos conduzidos em quatro grupos experimentais em três institutos internacionais, após duas imunizações em doses de 25, 50, 100 e 300 μg por dose. Todos os animais controle (10/10) foram infectados por volta do dia 2 de provocação viral.

[00153] UBITh® FMDV O Vaccine contendo uma mistura de cons- trutos O de VP1 (SEQ ID NOs: 25, 27 e 28 em razão igual, 25 μg por dose para duas doses dadas em 0 e 3 semanas pós-imunização inicial) elicitou anticorpos de neutralização amplamente protetores contra isolados de FMDV O múltiplos incluindo OTaiwan, OCampos, OMyanmar e OManisa em suíno.

[00154] UBITh® FMDV O Vaccine exibiu imunogenicidade equivalente em uma espécie ruminante, cabra, àquela vista em porcos. Esse resultado é previsivo que a presente formulação UBI será eficaz em gado em uma faixa de dose comparável com a faixa de dose imuno- gênica para porcos.

[00155] Imunógenos de FMDV sintéticos UBITh® individuais elicita- ram anticorpos de neutralização simultaneamente contra sorotipos A< O e Asia 1 em porquinhos-da-índia, mostrando potencial para eficácia inesperadamente ampla em sorotipos múltiplos.

[00156] Peptídeo O de FMDV UBITh® empregando sequência de sorotipo OConsensus pode elicitar anticorpos de neutralização, medidos através de índice de neutralização, contra sorotipos múltiplos incluindo subtipos de sorotipos A, Asia 1 e O.

[00157] Imunógenos de vacina para FMDV UBITh® são direcionados a “sítio funcional” e sintéticos em natureza. As vacinas formuladas são seguras, potentes, de neutralização ampla, reproduzíveis e estáveis, desta maneira superando as dificuldades e desvantagens relacionadas à produção e controle de qualidade associadas com vacinas de vírus morto convencionais.

[00158] A disponibilidade de uma vacina quimicamente definida completamente segura pode acelerar a erradicação de FMDV ao encorajar a vacinação mesmo em regiões que se aproximam do estado li- vre de FMD.

EXEMPLO 7 HOMÓLOGOS DE PEPTÍDEO DE IMUNÓGENOS DE PEPTÍDEO DE FMDV SINTÉTICO COMO COMPONENTES-CHAVE PARA VACINAS MULTIVALENTES BASEADAS EM PEPTÍDEO DE FMDV PRODUZIDAS ESPECIALMENTE PARA NECESSIDADES REGIONAIS

[00159] Vacinas para a doença do pé-e-boca representam tradicionalmente a maior parcela do mercado de vacina veterinária em todo o mundo em termos de venda, com 26,4% de todo o negócio biológico de pecuária. Devido à alta variabilidade de sorotipos e subtipos de FMDV, a composição de antígeno das vacinas para FMD baseadas em lisado viral clássicas é feita especialmente para regiões específicas no mundo e, em muitos casos, para países ou regiões específicos dentro delas. O uso atual da vacina em regiões endêmicas para FMD requere uma investigação aprofundada da epidemiologia de doença e estudos de harmonização de vacina para (1) determinar se a vacina será eficaz contra a(s) cepa(s) em circulação na área alvo e (2) assegurar que o perfil real da vacina seja adequado para controle e erradicação.

[00160] Com o advento de virologia molecular, uma grande parte da sequência de VP1 da proteína do capsídeo de vírus da doença do pé- e-boca poderia ser facilmente amplificada por reação em cadeia da polimerase dependente de transcrição reversa (RT-PCR) (ReverseTranscription-Dependent Polymerase Chain Reaction) de isolados de vírus obtidos de amostras de tecido de casos de FMD apresentados de acordo com a prática de vigilância nacional, bem como amostras de tecido e probang múltiplas coletadas de surtos de FMDV. As sequências de VP1 identificadas poderiam ser alinhadas. O alinhamento compreende sequências dos sorotipos com a relação genética com outros isolados indicados. As sequências de VP1 da(s) cepa(s) circulando na área alvo podem ser facilmente obtidas com base na estrutura de aminoácido (VPI 129-168) estabelecida na presente invenção e homólogos de peptídeo para esta estrutura principal (Tabela 2, SEQ ID NOs: 2-23) representando a sequência de VP1 identificada para surtos de FMDV regionalmente identificados e para tais homólogos de peptí- deo de VP1 projetados (Tabela 3, SEQ ID NOs: 25-33) a serem incluídos nas formulações de vacina para assegurar sua adequabilidade para controle e erradicação, produzida especialmente para as necessidades regionais específicas.

[00161] Formulações específicas contendo homólogos de peptídeo derivados de imunógenos de peptídeo de FMDV sintético (tendo aa129 a aa168 de VP1) como um ingrediente-chave quando administradas em duas ou mais doses incluem os exemplos mostrados na Tabela 14: (a) Vacina de sorotipo O de FMDV de suíno monovalente com homólogo de peptídeo (SEQ ID NO: 25); (b) Vacina de sorotipo O de FMDV de suíno bivalente com uma mistura de dois homólogos de peptídeo (SEQ ID NOs: 25 e 28) em razão igual em peso; (c) Vacina de sorotipo O de FMDV de suíno trivalente com uma mistura de três homólogos de peptídeo (SEQ ID NOs: 25, 27 e 28) em razão em peso igual; (d) Vacina de sorotipos O e Asia 1 de FMDV de ga- do/ruminante bivalente com uma mistura de dois homólogos de peptí- deo (SEQ ID NOs: 25 e 29) em razão igual para uso em Asia; (e) Vacina para sorotipos O, Asia IJiansu e AGansu de FMDV de gado/ruminante trivalente (SEQ ID NOs: 25, 29 e 31) em razão igual para uso na China; (f) Vacina para sorotipos OCampo, A24 e CIndaial de FMDV para gado/ruminante trivalente (SEQ ID NOs: 26, 30 e 32) em razão igual para uso no Brasil; (g) Vacina para sorotipos OCampos, A24/Argentina 2001 e CIndaial de FMDV para gado/ruminante trivalente (SEQ ID NOs: 26, 30, 33 e 32) em razão igual para uso na Argentina.

[00162] A adequabilidade dos homólogos de peptídeo projetados para uso na formulação de vacina final poderia ser avaliada através de detecção de imunogenicidade relativa e reatividade cruzada com os antígenos de VP1 de FMDV de isolados diferentes através de ELISAs de peptídeo baseado em sequência de VP1 de FMDV conforme descrito no Exemplo 1.

[00163] Conforme mostrado nas Tabelas 15 a 17, as formulações de vacina baseadas em homólogo de VP1 (a) a (g) (contendo homólogos de SEQ ID NOs: 25-33) satisfazem necessidades regionais específicas (por exemplo, China, Sudeste Asiático, Brasil e Argentina). Especificamente, essas formulações proveem a imunogenicidade desejada para as sequências de VP1 dos sorotipos alvo (por exemplo, OTai- wan, OCampos, OOzk, OMyanmar, Asia 1, AGansu, A24, AArgentina 2001, CIndaial). Ainda, imunogenicidade funcional foi também observada para essas formulações de vacina de FMDV conforme demonstrado por sua habilidade em elicitar anticorpos de neutralização com relação aos sorotipos alvo incluindo, mas não limitado a, sorotipo OTaiwan99 (conforme descrito no Exemplo 6, Tabela 12). Os componentes de célula B baseados em VP1 de indução de anticorpo de neutralização de FMDV totais empregados nas formulações de vacina podem ser um mínimo de 25 μg por dose quando administrados em 2 doses dentro de um programa de imunização.

EXEMPLO 8 FORMULAÇÕES DE VACINA PARA FMDV CONTENDO APENAS PEPTÍDEOS DE AGRUPAMENTO DE EPÍTOPO DE CÉLULA B DE- RIVADOS DE PROTEÍNA VP1 FALHARAM COMO VACINA DE EMERGÊNCIA CONTRA PROVOCAÇÕES VIRAIS DE FMDV QUANDO DE ADMINISTRAÇÃO ÚNICA

[00164] Formulações específicas incorporando homólogos de pep- tídeo de FMD sintético foram preparadas conforme descrito no Exemplo 7. Essas formulações foram capazes de elicitar respostas imunes de neutralização de FMDV em ambas as vacinas para FMDV para ga- do/ruminante após administração de duas ou mais doses. No entanto, essas formulações foram incapazes de proteger consistentemente suíno e gado de provocação viral com FMDV com uma administração única da formulação, conforme requerido pelo procedimento de provocação viral OIE. A incapacidade dessas formulações em oferecer aos animais proteção integral contra provocação por FMDV usando uma administração única apresenta um sério obstáculo para a comercialização das formulações de vacina para FMDV baseadas em homólogo de peptídeo de VP1.

[00165] Uma revisão de perto da cinética para desenvolvimento de anticorpo de neutralização para todas as formulações de vacina baseadas em homólogo de VP1 revelou que os títulos de anticorpo de neutralização permaneceram baixos ou próximos dos títulos de base (<=3) até quatro semanas após a administração única (Figuras 3A e 3B). Os títulos de anticorpo de neutralização em ambos porcos e gado aumentaram para níveis significantemente altos na semana 6 apenas após a segunda administração em 4 semanas pós-administração inicial (Figuras 3A e 3B; e Tabelas 15-17). Tal retardo na geração de anticorpos de neutralização de título alto sugere uma falta de (ou nível reduzido de) certos elementos de resposta imune na vacina de peptídeo baseada em VP1. Esses elementos faltantes/reduzidos parecem estar presentes na vacina baseada em lisado viral de FMDV, que é capaz de montar proteção como uma vacina de emergência.

[00166] Uma primeira resposta e de recall rápida que causa redução significante de replicação viral quando da exposição poderia ser o elemento faltante da formulação de vacina baseada em homólogo de VP1 requerida em uma resposta imune integralmente protetora quando de administração única. Respostas de T auxiliar potentes são geradas após duas ou mais doses quanto o epítopo UBITh® estranho é ligado aos homólogos de peptídeo de VP1, conforme evidenciado pelo aumento significante em títulos de anticorpo de neutralização mostrados nas Figuras 3A e 3B; e Tabelas 15 a 17. No entanto, uma vacina de emergência deve rapidamente e suficientemente inicializar o sistema imune de um animal com uma administração única da formulação de vacina para ser eficaz na provisão de uma resposta de recall rápida quando da infecção viral.

[00167] Os Exemplos que seguem descrevem experimentos que avaliam a resposta de célula T de ação rápida ao empregar formulações de vacina contendo epítopos de B e T derivados de FMDV multi- componentes.

EXEMPLO 9 FUNDAMENTOS, AVALIAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE VACINA PARA FMDV BASEADAS EM EPÍTOPO DE B E T MULTICOMPONENTES PARA UMA VACINA DE EMERGÊNCIA DE ADMINISTRAÇÃO ÚNICA

[00168] Conforme descrito no Exemplo 8, tentativas repetidas no desenvolvimento de uma formulação de vacina para FMD de emergência usando uma combinação de peptídeos de agrupamento de epí- topo de célula B derivado de VP1 de FMDV sozinhos foram incapazes de gerar consistentemente anticorpos de neutralização de título alto em 3 a 4 semanas pós-imunização inicial com uma única administração. Desta maneira, essas formulações foram incapazes de proteger animais quando da provocação com FMDV. Esforços extensivos foram feitos para identificar os elementos imunológicos requeridos para o de-senvolvimento de uma vacina para FMD de Emergência de alta potência.

[00169] A vacina de emergência baseada em lisado viral de FMD comercial induz proliferação de célula T Yδ em porcos puros e esses células T Yδ de porco puro expressam vários mRNA de citoci- na/quimiocina após exposição a antígenos virais de vacina de FMD. Uma das mudanças notáveis observadas em animais recebendo vacina para FMD de emergência de alta potência é o nível alto de produção sistêmica de citocinas incluindo IFN-Y (Cox, 2003). Quando PBL de porcos imunes a FMD (animais vacinados e provocados com vírus) foram estimuladas in vitro com antígenos para FMDV imediatamente após provocação e recuperação com vírus de FMD, células T Yδ foram a principal subpopulação em proliferação encontrada indicando que tal proliferação de célula T Yδ pode ser uma característica de certas infecções virais. Interações célula para célula direta entre células T Yδ e células T CD4+ Classe II+ MHC foram observadas como agrupamentos de células mostrando formação de sinapse clara e tais interações exibidas como proliferação de célula T podem ser bloqueadas por anticorpos monoclonais contra Classe II MHC e CD4 indicando capacidade de apresentação de antígeno por células T Yδ através de Classe II MHC (Takamatsu, 2002). O envolvimento de células T Yδ em indução de inflamação e produção de citocina diferencial revelou um papel importante para células T Yδ em imunorregulagem, controlando ambas as respostas imunes inatas e adaptativas. Essas células podem possuir características associadas com Células Apresentando Antígeno (APC) (Antigen Presenting Cells) profissionais. A importância de envolvimento de células T Yδ em geração de respostas imunes rápidas contra antígenos para FMDV na vacina para FMD de emergência de alta potência baseada em lisado viral levou a requerente a avaliar ex- tensivamente o projeto, avaliação e seleção para inclusão de um ou mais peptídeos de agrupamento de epítopo T endógenos de FMDV nas vacinas para FMD de emergência de alta potência baseadas em peptídeo sintético da requerente através de medição in vitro de produção de IFN-Y como indicadores para o início de ativação de célula T mediada por peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV.

[00170] Ensaios funcionais de célula T específicos conforme descrito em detalhes no Exemplo 3 foram usados para avaliar e identificar peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV derivados de segmentos antigênicos de proteínas de FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B e 3D que são reconhecidos por células T de suíno e gado de hospedeiros imunizados com (a) vacinas de lisado viral de FMDV e (b) formulações de peptídeo contendo peptídeos de Th candidatos para FMDV.

a. Identificação de peptídeos de agrupamento de Th endógenos de FMDV em animais suíno e gado através de medição in vitro de produção de IFN-Y como um indicador para o início de ativação de célula T imune

[00171] Quando da estimulação in vitro, células T inicializadas de animais imunizados com as formulações incorporando peptídeos de epítopo de Th endógenos de FMDV liberaram IFN-y e aumentaram consistentemente a produção de anticorpos de neutralização de FMDV. Tal ensaio é muito mais fácil de reproduzir e então tem sido usado como um ensaio de avaliação robusto para avaliação da potência e para identificação do agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV para inclusão nas formulações de vacina para FMDV finais.

[00172] O projeto para imunógeno de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula T foi realizado primeiro testando peptídeos tendo sequências mostrando agrupamentos de motivos de ligação de MHC Classe I quanto à sua habilidade em induzir resposta de IFN-Y em cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMCSs) obtidas de porcos e vacas imunizados com vacina de lisado viral de FMDV OTaiwan99 , provocados mais tarde e recuperados. A partir desta avaliação, peptídeos que eram capazes de disparar produção de IFN-Y baixa, média e alta foram agrupados para avaliação e projeto adicionais para incorporação às formulações de vacina. A Figura 1 mostra a dis- tribuição/localização de epítopos de célula B e T endógenos nas proteínas VP4, VP2, VP3, VP1, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C e 3D de FMDV que foram identificadas através de métodos descritos nos Exemplos 1 e 3 e usados em aplicações de formulação de vacina subsequentes.

[00173] As sequências para cada um dos peptídeos de agrupamento de epítopo de célula T derivados da cepa FMDV OTaiwan99 são identificadas na Tabela 4 (SEQ ID NOs: 34-63). Os peptídeos de Th de FMDV foram alinhados com sequências de epítopo de T auxiliar de FMDV de outras cepas de FMDV conforme mostrado na Tabela 5 (SEQ ID NOs: 64-78). Para melhorar a solubilidade desses antígenos de peptídeo um tanto hidrofóbicos, três resíduos lisina (KKK) foram adicionados ao terminal N dos imunógenos de peptídeo de T auxiliar individuais. Um grupo desses peptídeos de agrupamento de célula T contendo alguns ou todos os imunógenos de peptídeo de Th identificados em razão igual em peso (SEQ ID NOs: 34-87) foi usado como um suplemento para a mistura de homólogos de peptídeo de VP1 em formulações de vacina para potencializar mais a imunogenicidade dos imunógenos de peptídeo de agrupamento de célula B de FMDV em ambos suínos e gado. Essas formulações de vacina foram usadas em experimentos extensivos onde títulos de anticorpo de neutralização nas semanas 0 e 3 foram medidos/avaliados in vitro como indicações para eficácia protetora in vivo quando da administração única (Tabelas 18, 19). Esses peptídeos de Th de FMDV agrupados podem também agir como imunógenos de peptídeo de célula T de FMDV para imunidade mediada por célula.

[00174] Para ampliar a cobertura de epítopo de célula T para animais tendo uma base genética diversa, peptídeos combinatoriais, com base nas respectivas nove sequências homólogas específicas de epí- topo T (Tabela 19, Grupo 7, SEQ ID NOs: 79-87), foram também projetados. Similarmente, três resíduos lisina (KKK) foram adicionados ao terminal N dos respectivos imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo T combinatoriais para melhorar sua solubilidade em água para uso em formulação adicional. Um grupo desses imunógenos de peptídeo combinatoriais de agrupamento de epítopo de T foi também usado como um suplemento em formulações de vacina para potencializar mais a imunogenicidade dos imunógenos de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B de VP1 de FMDV e sozinho como imunógenos de peptídeo de célula T de FMDV para imunidade mediada por célula (Tabela 19).

[00175] Através de teste extensivo, uma lista de peptídeos de agrupamento de Th endógenos de FMDV para suíno são SEQ ID NOs: 61 a 63; e para gado são SEQ ID NOs: 34 a 60. Esses peptídeos curtos podem ser tornados solúveis através da adição de resíduos Lisina (por exemplo, KKK) ao terminal N dos peptídeos de agrupamento de epíto- po de Th. A imunogenicidade desses peptídeos pode ser potencializada fazendo uma sequência de peptídeo combinatorial usando cada epítopo de Th baseado em sorotipo(s) empregado(s) para o projeto de sequência de biblioteca combinatorial (por exemplo, O, Asia1, A, C, etc) e ligando ainda os peptídeos de agrupamento de Th de FMDV individuais selecionados (como uma sequência única ou como uma sequência combinatorial) em uma forma de cassete ao epítopo de UBITh® (SEQ ID NO: 24) como construtos de Th de FMDV combo. Sequências exemplares contendo essas características são mostrados na Tabela 7 como SEQ ID NOs: 88 a 95.

[00176] Devido à base genética particularmente diversa de gado, várias combinações de peptídeos de Th endógenos de FMDV pré- selecionados derivados de um grupo grande de peptídeos capazes de disparar o início de reação de célula T específica de antígeno em animais recebendo formulações de vacina já contendo os peptídeos de VP1 de agrupamento de epítopo de B de FMDV otimizados foram testadas quanto à imunogenicidade universal nos animais (Tabela 19). A habilidade em disparar o início de reação de célula T específica de an- tígeno por animais recebendo apenas administração única de tais formulações de vacina é exemplificada pelos títulos significantes de anti-corpos de neutralização que as vacinas era capazes de montar em ambos porcos e gado (Tabelas 18 e 19). Na ausência desses peptí- deos de agrupamento de epítopo de Th de FMDV, as vacinas foram apenas capazes de montar título insignificante (isto é, <=3) de anticorpos de neutralização após recebimento de administração única das vacinas (Figuras 3A e 3B) para as semanas 0 e 3 pós-imunização inicial para cada uma das formulações contendo apenas homólogos de imunógeno de peptídeo de VP1.

[00177] Uma formulação de vacina para FMDV simples foi preparada contendo (1) o imunógeno de B de VP1 de FMDV de sorotipo O (SEQ ID NO: 25); (2) 10% (em peso) de um construto de peptídeo de epítopo de Th de FMDV projetado (SEQ ID NO: 90) e (3) três epítopos de Th de FMDV de suíno em uma forma de cassete ligada por UBITh® (SEQ ID NO: 24). Esta formulação foi dada a porcos em uma administração única e o nível de IFN-Y foi medido ambos in vitro a partir de PBMCs e in vivo através de ensaio ELISA quantitativo de soro (conforme descrito no Exemplo 3) durante um período de quatro semanas. Um nível de produção crescente de IFN-y com o tempo após imunização foi observado neste estudo, como mostrado nas Figuras 4A e 4B.

[00178] Esta constatação confirmou mais que os peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV selecionados poderiam inicializar as células do hospedeiro imunizado imediatamente após neutralização. Quando da exposição a FMDV ou através de infecção natural ou através de um estudo de provocação, os antígenos virais expostos dão partida no início de reações de célula T específica de antígeno através das células T de memória inicializadas por antíge- no de peptídeo T auxiliar de vacina para FMDV. Esses epítopos de Th imunodominantes cuidadosamente selecionados presentes em proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B e 3D de FMDV proveem inicialização prévia das células de Th relacionadas a FMDV e permitem disparo de respostas proliferativas de linfócito significantes em hospedeiros imunizados quando da exposição a FMDV levando à produção de citocinas, incluindo IFN-Y, mesmo após administração única das respectivas formulações de vacina. As citocinas eram conhecidas desempenhar um papel-chave em respostas imunes mediadas por célula contra uma variedade de infecções virais citopáticas em animais.

b. Identificação das Formulações de Vacina Ideais para Uso como uma Vacina de Emergência em Ambos Suíno e Gado conforme Determinado por Ensaios de Neutralização

[00179] A resposta linfoproliferativa para FMDV em animais vacinados e provocados foi geralmente verificada ser significantemente maior para formulações incorporando peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV do que aquelas sem. Inclusão do epítopo de célula T específico na formulação de peptídeo permite inicialização das células T que podem reconhecer mais eficientemente os epítopos virais apresentados no contexto de um encontro de vírus subsequente.

[00180] IFN-y é um ativador principal de macrófagos, potencializando sua atividade antimicrobiana e sua capacidade para processamento e apresentação de antígenos para linfócitos T. Foi relatado que IFN-y estimula expressão de MHC em células apresentando antígeno e inibe eficientemente replicação de FMDV. Desta maneira, ativação desses mecanismos iniciais é relevante para a indução de respostas imunes protetoras contra FMDV requeridas de uma vacina de emergência quando de administração única. Na presença de peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV, as células B reativas à VP1 de FMDV seriam ativadas, levando a uma proliferação de célula B rápida e produção de anticorpos. Esses peptídeos de agrupamento de epítopo de Th endógeno de FMDV também ativariam células T auxiliares, levando à secreção de citocina resultando em um ambiente adequado para geração de memória de célula B. Essas constatações sugerem que a proteção clínica melhor conferida pelos peptídeos de B e Th endógenos de VP1 de FMDV comparado com peptídeos de B de VP1 sozinhos, é principalmente devido à indução de uma resposta lin- foproliferativa mais eficiente e liberação de IFN-Y que também leva à melhor indução, desta maneira títulos maiores de anticorpos de neutralização como parte do evento inicial.

[00181] Ensaios de neutralização padrão foram empregados para avaliação de formulações de vacina que disparariam melhor tais respostas imunoprotetoras iniciais in vivo requeridas por uma vacina de emergência. Soros coletados três semanas a partir da imunização inicial foram avaliados no suíno (Tabela 18) e no gado (Tabla 19) vacinado. Uma vez que o ensaio de anticorpo de neutralização tem sido usado como um ensaio substituto para substituir o teste de provocação física caro e dificultoso por certas agências nacionais como parte dos critérios de liberação para uma vacina para FMDV de emergência, estudos sistemáticos com as muitas formulações de vacina para FMDV utilizando várias combinações e razões de peptídeos de agrupamento de epítopo de B e Th endógeno derivado de VP1 de FMDV foram conduzidos e avaliados quanto à sua respectiva eficácia protetora por este ensaio de anticorpo de neutralização substituto que foi rapidamente descrito no Exemplo 2.

[00182] Especificamente, três a cinco animais livres de FMDV por grupo para suíno e gado na idade de 8-12 semanas e 6-12 meses, respectivamente, foram imunizados na semana 0 por várias combinações de formulações de vacina para FMDV baseada em peptídeo de B e T multicomponentes após administração única com soros coletados para teste de título de anticorpo de neutralização.

1. Suíno

[00183] Dados de 13 grupos de animais do estudo de suíno são mostrados na Tabela 18. Formulações usadas nesses experimentos foram preparadas conforme descrito abaixo. Todos os porcos foram imunizados com 1 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00184] Grupo 1 - continha apenas o protótipo do peptídeo de consenso O de VP1 de FMDV (SEQ ID NO: 25).

[00185] Grupos 2 a 4 - foram preparados com o protótipo do peptí- deo de consenso O de VP1 de FMDV (SEQ ID NO: 25) em combinação com uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos (por exemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 ou SEQ ID NO: 90) em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 25+2,5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%.

[00186] Grupos 5 a 7 - foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25) e OOzk (SEQ ID NO: 28) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 25 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos (por exemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 ou SEQ ID NO: 90) em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 25+2,5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%.

[00187] Os Grupos 8 a 10 foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25) e OOzk (SEQ ID NO: 28) e Myanmar (SEQ ID NO: 27) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina de FMDV, em razão igual em peso a 25 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV com SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 e SEQ ID NO: 90 em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 25+2,5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%.

[00188] Os Grupos 11 a 13 foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25) e OOzk (SEQ ID NO: 28), Myanmar (SEQ ID NO: 27) e Asia 1Jiangsu (SEQ ID NO: 29) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina de FMDV, em razão igual em peso a 25 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos (por exemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 e SEQ ID NO: 90) em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 25+25 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%.

[00189] Em suma, todos os porcos eram livres de anticorpos para FMDV na semana 0 quando os respectivos estudos foram iniciados nos vários pontos de tempo. Administração única das formulações de vacina para FMDV multicomponentes contendo os vários peptídeos de agrupamento de epítopo de B e Th endógeno derivados de VP1 de FMDV elicitou a geração de anticorpos significantes direcionados contra o (ou um dos) peptídeo alvo OConsensus (SEQ ID NO: 25) através de ELISA com um Título Log10 entre 2 e 3 (isto é, 10E2 a 10E3).

2. Gado

[00190] Dados de um total de 32 grupos de animais com três ani- mais por grupo do estudo de gado são mostrados na Tabela 19. Formulações usadas nesses experimentos foram preparadas conforme descrito abaixo. Todos os gados foram imunizados com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00191] Os Grupos 1 a 8 foram preparados a partir do peptídeo OConsensus de VP1 de FMDV (SEQ ID NO: 25) em combinação com, respectivamente, uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos incluindo SEQ ID NOs: 34-63 (30Ths); SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51, 53-63 (24Ths); SEQ ID NO: 34-39, 44, 4651, 53-60 (21 Ths); SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 6063 (15Ths); SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 48, 50, 53 (6 Ths); SEQ ID NOs: 62-78 (17 homólogos de Th); SEQ ID NOs: 79-87 (9 bibliotecas curtas de T); and SEQ ID NO: 88, 89 (2 UBITh® cassetes de Th potencializados), respectivamente, todos em razão igual em peso em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V1 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%.

[00192] Os Grupos 9 a 11 foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25), OOzk (SEQ ID NO: 28) e Myanmar (SEQ ID NO: 27) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 88, 89 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes de Th potencializados UBITh®) e SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 6063 (15Ths) em uma razão igual em peso e uma razão B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vaci- na.

[00193] Os Grupos 12 a 16 foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25), OOzk (SEQ ID NO: 28) e Myanmar (SEQ ID NO: 27) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th para FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15Ths) todos em uma razão igual em peso e uma razão B:Th de 1:1, 5:1, 10:1, 50:1 e 100:1 em peso em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00194] Os Grupos 17 a 19 foram imunizados com OConsensus (SEQ ID NO: 25), OOzk (SEQ ID NO: 28), Myanmar (SEQ ID NO: 27) e Asia 1Jiangsu (SEQ ID NO: 29) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15Ths); SEQ ID NOs: 88, 89 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes de Th potencializados de UBITh®) todos em razão igual em peso e em uma razão de B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00195] Os Grupos 25 e 26 foram imunizados com OCampos (SEQ ID NO: 26), A24 (SEQ ID NO:30) e CIndaial (SEQ ID NO: 32) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente su- plementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th para FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados de UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes de Th potencializados de UBITh®) todos em razão igual em peso e em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em- óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00196] Os Grupos 27 e 28 foram imunizados com OCampos (SEQ ID NO: 26), A24 (SEQ ID NO: 30) e CIndaial (SEQ ID NO: 32) de VP1 de FMDV como o componente de célula B e vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th de FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados de UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes para Th potencializados UBITh®) todos em razão igual em peso e em uma razão B:th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em- óleo usando Emulsigen D (12%) como o adjuvante. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00197] Os Grupos 29 e 30 foram imunizados com OCampos (SEQ ID NO: 26), AArgentina2001 (SEQ ID NO:33) e CIndaial (SEQ ID NO: 32) de VPI FMDV como o componente de célula B de vacina para FDMV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th para FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes de Th potencializados UBITh®) todos em razão igual em peso e uma razão B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em-óleo usando ISA50V2 como o adjuvante (Seppics, França) contendo Tween 80 0,1%. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00198] Os Grupos 31 e 32 foram imunizados com OCampos (SEQ ID NO: 26), AArgentina (SEQ ID NO: 33) e CIndaial (SEQ ID NO: 32) de VP1 de FMDV como o componente de célula B de vacina para FMDV, em razão igual em peso a 50 μg/mL no total, que foram respectivamente suplementados por uma mistura de razão igual em peso de peptídeos de Th para FMDV endógenos com SEQ ID NOs: 91,92 (2 cassetes de Th potencializados UBITh®); SEQ ID NOs: 91, 93-95 (4 cassetes de Th potencializados UBITh®) todos em razão igual em peso e em uma razão B:Th de 10:1 em peso a 50+5 μg/mL em uma emulsão água-em- óleo usando Emulsigen D (12%) como o adjuvante. Todo o gado foi imunizado com 2 mL de emulsão como a formulação de vacina.

[00199] Em suma, todos os animais gado estavam livres de anticorpos para FMDV na semana 0 quando os respectivos estudos foram iniciados nos vários pontos de tempo. Administração única das formulações de vacina para FMDV multicomponentes contendo os vários peptídeos de agrupamento de epítopo de B e Th endógenos derivados de VP1 de FMDV permitiu geração de anticorpos significantes direcionados contra o (ou um do) peptídeo alvo OConsensus (SEQ ID NO: 25), mesmo quando o imunógeno de peptídeo alvo estava em uma fração dos componentes B devido à presença de outro imunógeno de B de VP1 relacionado de sorotipos diferentes (principalmente devido à rea- tividade cruzada dentre esses imunógenos de peptídeo de VP1) geralmente com um título na faixa de Título de Log10 entre 2 a 3.

[00200] Inesperadamente, formulações tendo amplas faixas nas razões de peptídeo B:Th foram eficazes na elicitação de uma resposta imune nos animais testados. Isto é, a faixa % para inclusão de tais peptídeos de agrupamento de Th endógenos para FMDV que pode variar de um mínimo de 1% (isto é, razão de Th para B de 1:1000) até um máximo de 50% (isto é, razão de Th para B em 1:1) (vide Grupos 12 a 16 no estudo de imunização de gado) foram formulações eficazes para elicitar em animais aumento significante em anticorpos de neutralização em seus soros coletados em 3 semanas pós-imunização inicial.

[00201] Em geral, 10% a 20% de peptídeos de agrupamento de Th de FMDV para peptídeos de agrupamento de epítopo de B de VP1 de FMDV (isto é, uma razão 1:5 ou 1:10) foram selecionados e usados nas formulações de vacina para FMDV baseadas em peptídeo finais para montar respostas imunes de B e T equilibradas em animais recebendo administração única via injeção intramuscular da formulação de vacina para FMDV. EXEMPLO 10 PROTEÇÃO DE ANIMAIS PORCOS E GADO DE PROVOCAÇÕES VIRAIS POR FMDV APÓS RECEBEREM FORMULAÇÕES DE VACINA PARA FMDV BASEADAS EM EPÍTOPO DE B E T MULTI- COMPONENTES COMO UMA VACINA DE EMERGÊNCIA DE ADMINISTRAÇÃO ÚNICA

a. Estudos de provocação conduzidos nos porcos:

[00202] Com as formulações de vacina para FMDV baseadas em epítopo de B e T multicomponentes otimizadas projetadas para uma vacina de emergência de administração única dando origem a títulos de anticorpo de neutralização significantes em soros coletados em 3 semanas pós-imunização inicial, seis estudos de provocação adicionais foram conduzidos em Tamsui, Taiwan para avaliar e validar a eficácia protetora para formulações representativas selecionadas previamente testadas no Exemplo 9.

[00203] Em particular, estudos de provocação por FMDV usando a cepa OTaiwan de FMDV foram realizados em animais vacinados. Os estudos de provocação foram realizados de acordo com protoco- los/métodos similares. Um estudo de provocação representati- vo/exemplar é descrito em detalhes neste Exemplo (abaixo). Especificamente, o estudo de provocação conforme mostrado na Tabela 20 (corresponde a Grupos 5, 6 e 7 de Estudo II; Grupos 12, 13 e 14 de Estudo IV; e Grupos 15, 16, 17, 18 e 19 de Estudo V conforme mostrado na Tabela 25) é descrito/avaliado em detalhes nas Tabelas 20 a 24. Os outros grupos envolvidos em tais estudos de provocação conduzidos em suíno e gado foram apresentados em uma forma sumari- zada nas Tabelas 25 e 26, respectivamente.

[00204] Animais: Trinta e dois (32) porcos híbridos SPF de idade de 8 semanas (em 0 wpi) foram utilizados nos estudos de provocação. Os porcos eram livres de FMD e não foram previamente imunizados com uma vacina para FMD (isto é, puros). Os porcos foram alojados no Animal Health Research Institute (AHRI), Council of Agriculture, Executive Yuan. O estudo foi conduzido em AHRI da imunização inicial até o término do estudo de provocação.

[00205] Condições de Cuidado Especiais: Os grupos diferentes foram alojados em gaiolas comuns dependendo da situação realística. O grupo controle foi alojado em uma sala individual. Os animais mostrando sinais de infecção foram removidos para uma sala separada.

[00206] Vírus: Cepa FMDV OTAW/97 K

[00207] Estojos: Estojo de ELISA de Proteína Não estrutural de FMDV e estojo de titulação de EIA de peptídeo 2570A de FMD foram usados como descrito no Exemplo 1.

[00208] Agrupamento: Os 32 porcos foram divididos em 11 grupos aleatoriamente. O número de ID do animal, volume de dose, via de injeção e sítio de injeção foram sumarizados na Tabela 20.

[00209] Programa de Sangria: Em 0, 2, 4 semana(s) pós-vacinação (WPV) e 14 dias pós-provocação (DPC) (Days Post-Challenge).

[00210] Vacinação: A vacinação foi dada em 0 WPV nas respectivas doses designadas.

[00211] Programa de provocação: Em 4 semanas após imunização, os porcos vacinados e controle foram provocados com FMDV OTaiwan (vírus de passagem de porco) nos bulbos do calcanhar da perna dianteira direita via SC. A quantidade de vírus foi 0,5 ml (105 TCID50).

[00212] Ensaio(s) de Monitoramento: Após provocação viral, o de-senvolvimento de sinais clínicos e síndromes de FMD em porcos foi monitorado por 14 dias com temperatura do corpo registrada diariamente.

[00213] As temperaturas do corpo de porcos após provocação viral foram registradas na Tabela 21. As temperaturas dos porcos estavam ligeiramente elevadas, mas principalmente abaixo de 40° C durante os 14 dias pós-provocação (DPC) monitorada.

[00214] Títulos de neutralização: Os porcos sofreram sangria em 0, 2 e 4 semanas pós-vacinação (WPV) e 14 DPC. Soros de cada animal foram coletados de amostras coaguladas através de centrifugação e submetidos a ensaio de neutralização de vírus. Títulos de neutralização e as médias geométricas foram calculados e mostrados na Tabela 22. Títulos de anticorpo de neutralização (NA) significantes foram observados para todas as formulações de uma maneira dependente da dose. Embora a média geométrica de títulos de NA fosse menor do que 16 em 4 WPV para certos grupos, todos os animais foram protegidos em todos os grupos experimentais (100%) em 14 DPC enquanto dois de dois animais em grupo de Placebo controle ou controle negativo foram ambos infectados com sinais clínicos detectados logo no dia 2. O Grupo 19 de Estudo V usou Vacina de Sorotipo O baseada em lisado viral de FMDV (da Rússia) como controle positivo onde todos os três animais foram protegidos quando de administração única.

[00215] ELISA DE NS de FMDV: As amostras de soro foram ensaiadas com ELISA de Proteína Não estrutural de FMDV em AHRI com resultados mostrados na Tabela 23. Antes da provocação, os grupos inteiros testados eram puros, não mostrando nenhuma reatividade com proteína NS de FMDV. Apenas animais no grupo controle negativo de Placebo mostraram reatividade positiva para proteína NS em 14 DPC indicando sua natureza infectiva.

[00216] Titulação de ELISA Anti-VP1 (peptídeo 2570a): Os resultados de títulos de anticorpo anti-VP1 foram testados por ELISA baseado em peptídeo 2570a de VP1 conforme descrito no Exemplo 1 com resultados mostrados na Tabela 24. A maioria dos porcos desenvolveu respostas imunes significantes em até duas semanas após imunização.

[00217] Todos os animais dos grupos experimentais, exceto aqueles no grupo controle de Placebo negativo, foram protegidos de provocação por FMDV, sem importar seus títulos de NA quando formulações de vacina de peptídeo para FMDV incluíam peptídeos de Th para FMDV conforme mostrado em suas respectivas formulações.

[00218] Embora algumas das médias geométricas dos títulos de anticorpo de neutralização em 4 WPV estivessem abaixo de 16, os porcos estavam todos protegidos. Isso deu uma indicação clara que em adição a anticorpos de neutralização, há outros fatores envolvidos na proteção de animais quando de provocações virais. A inclusão de peptídeos de Th para FDMV em formato de cassete curto ou longo demonstrou seu papel crítico em elicitação de imunidade celular quando da administração única das formulações de vacina de peptídeo. Poderia haver até 30 Ths de FMDV (SEQ ID NOs: 34-63) ou no mínimo 3 Ths previamente refinados e selecionados (SEQ ID NOs: 61-63) para oferecer tal imunidade celular em suíno que fornece tal proteção quando em combinação com o(s) peptídeo(s) na alça em VP1. Vacinas de combinação incorporando sequências de homólogos de O de VP1 de FMDV forneceram proteção igualmente eficaz, se não maior, dos porcos de provocação com FMDV pela cepa OTaiwan. Não havia nenhum anticorpo contra proteína NS de FMDV detectada nos grupos experimentais recebendo as respectivas formulações de vacina durante o período monitorado que ilustrou a proteção completa desses animais de infecção por FMDV mesmo em face de provocação viral com FMDV de dose alta (10X dosagem viral requerida pela OIE). Em todas as formulações testadas, aqueles porcos que receberam apenas 0,5 mL por dose foram igualmente protegidos quando comparado com aqueles recebendo 2 mL por dose.

[00219] Treze (13) dos Grupos (Grupos 1-3, 5-7, 8-10, 12-15) usaram FMDV OConsensus (SEQ ID NO: 25) como o imunógeno de epítopo de B derivado de VP1 de FMDV. O Grupo 16 usou FMDV OConsensus, OOzk, O Myanmar (SEQ ID NOs: 25, 28 e 27) e o Grupo 17 usou FMDV OConsensus, OOzk, O Myanmar e Asia 1 Jiangsu (SEQ ID NOs: 25, 28, 27 e 29) como os imunógenos de epítopo de B derivados de VP1 de FMDV (em razão igual em peso) respectivamente). Os Grupos restantes usaram controle de Placebo.

[00220] Em todas essas formulações, exceto grupos controle de placebo, peptídeos de agrupamento de epítopo de Th de FMDV endógenos foram adicionados aos componentes de epítopo de B de VP1 de FMDV em todos os grupos conforme indicado em detalhes conforme mostrado na Tabela 25. Estudos II e IV foram conduzidos com os grupos em cada um dos estudos administrados com 2 mL, 1 mL, 0,5 mL por dose para testar a potência (PD50) das respectivas formulações de vacina. Todos os animais experimentais foram monitorados quanto a sinais clínicos de FMD durante um período de observação de 14 dias. Razões variadas de FMDV VP1 OConsensus (SEQ ID NO: 25) e pep- tídeo de cassete de Th de FMDV potencializado UBITh® (SEQ ID NO: 90) de 1:1, 5:1 e 10:1 foram também testadas para os Grupos 8 a 10 no Estudo III. Um estudo similar de razões variadas foi também conduzido para Estudo V com imunógenos de peptídeo combo de VP1 de FMDV e peptídeo de cassete de Th de FMDV potencializado UBITh® (SEQ ID NO: 90) para 5:1 e 10:1 para Grupos 15 e 16, respectivamente.

[00221] Em suma, todos os animais nos grupos controle de placebo ou negativo (sem injeção) foram infectados pela cepa FMDV OTaiwan logo no dia 2 quando da provocação, indicando a validez de todos os testes de provocação. Proteção integral de todos os porcos em todos os grupos experimentais foi observada, conforme demonstrado por sinais clínicos negativos durante o período monitorado e sinais negativos por ELISA de NS de FMDV, apesar da aplicação de dose 10X maior de isolado viral de FMDV do que a quantidade requerida por OIE nesses estudos de provocação. Cálculo de PD50 através de estudo de dosagem indica pelo menos PD50 de >11,23 em ambos os Grupos II e IV.

[00222] Dos 30 peptídeos de epítopo de Th de FMDV (SEQ ID NO: 34-63), três peptídeos de Th de FMDV foram selecionados (SEQ ID NOs: 61-63) para proteção eficaz de porcos de provocação viral com FMDV. A apresentação desses três peptídeos de epítopo de Th de suíno de FMDV foi potencializada usando um projeto tipo cassete ligando esses três peptídeos através de um espaçador de lisina que foi ligado ainda ao UBITh® (SEQ ID NO: 24) em seu terminal N conforme mostrado na SEQ ID NO: 90. Tais peptídeos de epítopo de Th de FMDV poderiam ser suplementados para imunógeno de peptídeo de epítopo de B derivado de VP1 de FMDV em razões variáveis para o imunóge- no de peptídeo de B para oferecer proteção contra provocação viral por FMDV. No Estudo V do teste de provocação, proteção integral foi obtida na presença de 10% de peptídeos de epítopo de Th endógeno quando a composição de peptídeo de epítopo de B é apresentada ou como um resíduo de sorotipo O monovalente (SEQ ID NO: 25, 2570 kb) ou como uma formulação combo de sorotipo O (SEQ ID NOs: 25, 28 e 27), ou como uma formulação de combinação de sorotipos O e Asia 1 multivalente (SEQ ID NOs: 25, 28, 27 e 29) indicando a adaptabilidade em imunogenicidade dos peptídeos de epítopo de B de VP1.

b. Estudos de provocação conduzidos em gado:

[00223] Em bovino, a provocação viral foi introduzida por uma injeção intramuscular modificada na parte posterior do pescoço do animal de 1 x 104 TCID50 de FMDV (Unidade Infecciosa de Bovino ou BIU). Cepa OS/99 foi usada para provocação de sorotipo O e cepa altamente virulenta Asia 1 foi usada para provocação do sorotipo Asia 1. Os animais foram examinados diariamente quando da provocação viral após receberem administração única de respectivas formulações de vacina para FMDV 28 dias, monitoramento de temperaturas retais e um score de proteção baseado no momento de aparecimento e no número e severidade de lesões foi determinado. Todos os experimentos com animais vivos foram realizados sob as orientações do Ministério da Agricultura, PRC. Modificações da dosagem tal como usando 2X, 1X e 0,5X dose da vacina de teste foram também usadas para avaliação da potência de uma formulação particular. Para avaliação rápida de formulações com eficácia protetora, 1X foi usada. Para avaliação de eficácia de formulação de vacina, os animais foram divididos em 3 a 5 animais por grupo dependendo do projeto experimental e da disponibilidade dos animais no momento do estudo.

[00224] No estudo I, animais nos Grupos 1 a 4 (conforme mostrado na Tabela 26) com formulações de vacina de peptídeo contendo o imunógeno de peptídeo de agrupamento de epítopo de célula B derivado de VP1 de FMDV otimizado (SEQ ID NO: 25) como o componente-chave da formulação de vacina na ausência de qualquer peptídeo de epítopo de Th de FMDV endógeno, ou na presença de 10% de pep- tídeos de epítopo de Th exógenos derivados de proteínas toxoides DT, TT e PT, foram incapazes de ser protegidos de provocação com cepa sorotipo OOS/99 de FMDV. Com as formulações de vacina para FMDV baseadas em epítopo de B e T multicomponentes otimizadas para uma vacina de emergência de administração única, quatro estudos de provocação adicionais foram conduzidos para avaliar a eficácia protetora para formulações representativas selecionadas previamente testadas no Exemplo 9 conforme mostrado na Tabela 26.

[00225] Oito (8) Grupos (Grupos 6-8 e 10-14 de Estudos II e III) usaram FMDV OConsensus (SEQ ID NO: 25) como o imunógeno de epí- topo de B derivado de VP1 de FMDV. O Estudo IV (Grupo 16) usou FMDV OConsensus, OOzk, OMyanmar (SEQ ID NOs: 25, 28 e 27) como o imunógeno de epítopo de B derivado de VP1 de FMDV (em razão igual em peso). O Estudo V (Grupo 18) usou FMDV OConsensus, OOzk, OMyanmar, Asia 1Jiangsu e AGansu (SEQ ID NOs: 25, 28, 27, 29 e 31) como o imunógeno de epítopo de B derivado de VP1 de FMDV (em razão igual em peso).

[00226] Em todas essas formulações, exceto pelos grupos controle de placebo e aqueles grupos experimentais no Estudo I, peptídeos de agrupamento de epítopo de Th de FMDV com SEQ ID NOs: 34-63, (30 Ths) para Grupo 10 de Estudo III; peptídeos com SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51 e 53-60 (21 Ths) para Grupo 11 de Estudo III; uma mistura de peptídeos de cassete de Th de FMDV potencializados UBITh® com SEQ ID NOs: 88 e 89 para Grupos 6 a 8 de Estudo II e uma mistura de outros quatro peptídeos de Th de FMDV de cassete com SEQ ID NOs: 91, 93, 94 e 95 para Grupo 16 de Estudo IV e Grupo 18 de Estudo V, foram adicionados aos componentes de epítopo de B de VP1 de FMDV conforme indicado em detalhes conforme mostrado na Tabela 26.

[00227] Os Grupos 6, 7 e 8 de Estudos II foram testados quanto à potência da formulação de vacina com animais nos respectivos grupos sendo administrados com 2 mL, 1 mL, 0,5 mL por dose das formula- ções de vacina quando 4 de 5; 4 de 5; e 3 de 5 animais foram protegidos nos respectivos grupos indicando potência significante da formulação de vacina.

[00228] Em suma, todos os animais em todos os grupos controle de placebo foram infectados por cepa FMDV OOS/99 ou Asia 2 empregada para o estudo de provocação logo no dia 2 quando da provocação, indicando a validez de todos os testes de provocação. Proteção signifi- cante (4 de 5; ou 3 de 5) ou proteção integral foi obtida em todos os grupos experimentais, conforme demonstrado por sinais clínicos negativos nos animais protegidos durante o período monitorado. A requerente foi também capaz de selecionar de trinta (30) peptídeos de epí- topo de Th de FMDV (SEQ ID NOs: 34-63), os vinte e um (21) (SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51, 53-60 (21 Ths) em razão igual (em peso), os quinze (15) Ths (SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63) (15 Ths) em razão igual (em peso) e finalmente os seis (6) peptídeos de Th de FMDV (SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 48, 50, 53) (6 Ths) em razão igual (em peso) para proteção eficaz em uma base genética diversa de gado. A apresentação desses quinze e até menos seis (6) peptídeos de epítopo de Th de gado de FMDV foi potencializada fazendo um projeto tipo cassete ligando três peptídeos de Th através de um espaça- dor de lisina e então ligando esses ao UBITh® (SEQ ID NO: 24) em seu terminal N como peptídeos de cassete de Th de FMDV (SEQ ID NOs: 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95). Tais peptídeos de cassete de epítopo de Th de FMDV poderiam ser suplementados para o imunógeno de peptídeo de epítopo de B derivado de VP1 de FMDV a 10 ou 20% para ajudar a montar a imunidade de célula T de FMDV necessária. Em Estudos IV e V, proteção de 4 de 5 animais para Grupos 16 e 18 por cepa de sorotipo OOS/99 de FMDV (Estudo IV) ou cepa FMDV Asia 1 altamente virulenta (Estudo V) respectivamente foi obtida na presença de 10% de peptídeos de epítopo de Th endógeno selecionados de 12 epítopos de Th de FMDV que eram apresentados em uma forma de cassete em quatro peptídeos potencializados UBITh® (SEQ ID NOs: 91, 93, 94, 95) enquanto a composição de peptídeo de epítopo de B é apresentada como uma formulação de sorotipo O Combo (SEQ ID NOs: 25, 28 e 27) ou como uma formulação de sorotipos O, Asia 1 e AGansu multivalente (SEQ ID NOs: 25, 28, 27, 29 e 31) indicando a adaptabilidade em imunogenicidade dos peptídeos de epítopo de B de VP1.

EXEMPLO 11 INSERÇÕES DE PRODUTO DE AMOSTRA PARA VACINAS MUL-TIVALENTES PARA FMDV UBITH® VACINA TRIVALENTE DE PEPTÍDEO SINTÉTICO PARA DOENÇA DO PÉ-E-BOCA (FMD) UBITH® (BRASIL) PARA PREVENIR INFECÇÃO PELO VÍRUS O/A24/VÍRUS CINDAIAL DE TIPOS BRASILEIROS DE FMD EM GADO

[00229] O que segue são inserções de produto de amostra para serem para vacinas multivalentes de FMDV UBITH®, vacinas de peptídeo sintético para doença do pé-e-boca (FMD) UBITH® no Brasil e na China. a. Brasil EMULSÃO ÁGUA-EM-ÓLEO ESTÉRIL PARA INJEÇÃO CUIDADO: apenas para uso veterinário DESCRIÇÃO: Vacina Trivalente para Peptídeo Sintético para Doença do Pé-e-Boca (FMD) (Brasil) é uma vacina trivalente de emulsão água-em-óleo contendo três construtos de peptídeo sintético de VP1 de FMD UBITh®. Cada construto de peptídeo é composto de um peptídeo sintético tendo um epítopo de VP1 imunodominante de vírus da doença do pé-e-boca (FMDV) sorotipos do Brasil O, A24 e CIndaial com base nas necessidades de regiões específicas da América do Sul que é ligado por síntese a um epítopo de UBITh®, um peptídeo de cé- lula T auxiliar (Th) artificial, como um antígeno. Quatro peptídeos de Th adicionais são incluídos para potencializar mais a imunidade mediada por célula com relação a esses três sorotipos de FMDV. Os três construtos de VP1 de FMD UBITh® são misturados em razão igual e suplementados com uma fração pequena da mistura dos quatro cons- trutos de Th. A mistura de construtos sintéticos relacionados a epítopo de B e T de FMDV é então misturada com um adjuvante de óleo para formar uma emulsão água-em-óleo. INDICAÇÕES PARA USO: Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético para Doença do Pé-e-Boca (FMD) UBITh® (Brasil) é usada para prevenção de infecção por sorotipos do Brasil O, A24 e CIndaial de vírus da doença do pé-e-boca de gado. DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO: Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético para Doença do Pé-e-boca (FMD) UBITh® (Brasil) A formulação de vacina é administrada através de injeção intramuscular na área de pescoço na frente do ombro. Manter o mais próximo possível um ângulo de 45 graus entre a agulha e a superfície da pele para evitar fluxo da vacina para fora do orifício da agulha quando a agulha é retirada. Uma dose única é recomendada para uso de emergência. Para gados sem nenhuma vacinação de FMD anterior, duas imunizações de 2 mL em 4-5 semanas de intervalo devem ser administradas para aumentar a imunidade e prolongar a resposta imune e então prover melhor proteção contra infecção por FMDV. Uma imunização adicional pode ser realizada a cada 6 meses depois idsso . Em uma área com animais infectados por FMDV, revacinação a cada 6 meses é recomendada. A dosagem administração é 2,0 mL. ORIENTAÇÕES PARA USO • Antes do uso, aquecer o produto de vacina para a temperatura ambiente. • Misturar os teores da vacina completamente antes do uso. • Remover os teores com seringas e agulhas esterilizadas. • Usar todos os teores imediatamente uma vez aberta a garrafa. • Destruir os recipientes e todos os teores que não foram usados através de um procedimento permitido pelas regulamentações governamentais. b. China Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético para a Doença do Pé-e- Boca (FMD) (China) para Prevenir Infecção pelo Vírus Tipos O/Asia 1/AGansu da China de FMD em Gado Emulsão Água-em-Óleo Estéril para Injeção CUIDADO: apenas para uso veterinário DESCRIÇÃO: Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético para Doença do Pé-e-Boca (FMD) UBITh® (China) é uma vacina trivalente de emulsão água-em-óleo contendo três construtos de peptídeo sintético de VP1 de FMD UBITh®. Cada construto de peptídeo é composto de um peptídeo sintético tendo um epítopo de VP1 imunodominante de sorotipos do vírus da doença do pé-e-boca (FMDV) do Tipo da China O, Asia 1 e AGansu com base nas necessidades de regiões da China e Ásia que é ligado por síntese a um epítopo de UBITh®, um peptídeo de célula T auxiliar (Th) artificial, como um antígeno. Quatro peptídeos de Th adicionais estão incluídos para potencializar mais a imunidade mediada por célula com relação a esses três sorotipos de FMDV. Os três construtos de VP1 de FMD de UBITh® são misturados em razão igual e suplementados com uma fração pequena da mistura dos quatro construtos de Th. A mistura de construtos sintéticos relacionados a epítopo de B e T de FMDV é então misturada com um adjuvante de óleo para formar uma emulsão água-em-óleo. INDICAÇÕES PARA USO: Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético da Doença do Pé-e-Boca (FMD) UBITh® (China) é usada para prevenção de infecção pelo vírus da doença do pé-e-boca sorotipos da China Tipo O/Asia 1/AGansu de gado. DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO: Vacina Trivalente de Peptídeo Sintético da Doença do Pé-e-Boca (FMD) UBITh® (China) é administrada através de injeção intramuscular na área de pescoço na frente do ombro. Manter o mais próximo possível um ângulo de 45 graus entre a agulha e a superfície da pele para evitar fluxo da vacina para fora do orifício da agulha quando a agulha é retirada. Uma dose única é recomendada para uso de emergência. Para gado sem nenhuma vacinação de FMD anterior, duas imunizações de 2 mL em 4-5 semanas de intervalo devem ser administradas para aumentar a imunidade e prolongar a resposta imune e então prover melhor proteção contra infecção por FMDV. Uma imunização adicional pode ser realizada a cada 6 meses depois disso. Em uma área com animais infectados por FMDV, revacinação a cada 6 meses é recomendada. A dosagem administração é 2,0 mL. ORIENTAÇÕES PARA USO • Antes do uso, aquecer o produto de vacina para a temperatura ambiente. • Misturar os teores da vacina completamente antes do uso. • Remover os teores com seringas e agulhas esterilizadas. • Usar todos os teores imediatamente uma vez aberta a garrafa. • Destruir os recipientes e todos os teores que não foram usados através de um procedimento permitido pelas regulamentações governamentais. Tabela 1 Sequências de VP1 de FMDV otimizadas para incorporação a vacinas para FMD UBITh® de projeto para apre-sentação de epitopo de B

Tabela 2 Alinhamentos para Sequências Imunogênicas de VP1 Consensus e Homólogas de várias cepas de FMDV de Sorotipos diversos (O, Ásia 1, A e C)

Tabela 3 Exemplos de Imunógenos de Peptídeo de FMDV Derivados de Sequências de VP1 de FMDV de Sorotipos Di versos (O, Ásia 1, A e C) da Mesma Estrutura Principal de Sequência de Aminoácido

Tabela 4 Peptídeos de Th Endógenos de FMDV Derivados de FMDV O, cepa TA/2/99 (No. Acesso GenBank AJ539137)

Tabela 5 Homólogos Exemplares de Peptídeos de Th Endógenos de FMDV Derivados da Mesma Estrutura Principal de Sequên-cia de Aminoácido

Tabela 6 Exemplos de Análogos Funcionais de Peptídeos de Th Endógenos de FMDV

Tabela 7 (1 de 3) Biblioteca de peptídeo de Th Endógeno de FMDV

Tabela 7 (2 de 3) Biblioteca de peptídeo de Th Endógeno de FMDV

Tabela 7 (3 de 3) Biblioteca de peptídeo de Th Endógeno de FMDV

UBITh® 3= SEQ ID NO. 24 Tabela 8 Exemplos de Imunógenos de Peptídeo de FMDV Derivados de Sequências de VP1 de FMDV de Sorotipos A, O e Ásia como uma Sequência Única ou como uma Sequência de Biblioteca Combinatorial

a N134 da sequência nativa é substituído por C. b Q158 da sequência de VP1 nativa é substituída por C. c T134 da sequência nativa é substituído por C. d R158 da sequência nativa é substituído por C. e UBITh = SEQ ID NO: 24. Tabela 9 Otimização de Peptídeo Antigênico Alvo para FMDV através de Conformação de Sequência e Elementos Imu- noestimuladores

a N134 da sequência nativa é substituído por C. b Q158 da sequência de VP1 nativa é substituído por C. c. No. de animal respondendo do grupo de 3 em 5 semanas pós-imunização inicial. d Resultados de teste para soros agrupados de animais reativos a ELISA. e Soro de ensaio de Índice de neutralização diluído 1:10. Tabela 10 Biblioteca de Peptídeo de VP1 imunogênica para Imunogenicidade Aperfeiçoada e Ampliação de Neutralização de FMD

a T158 da sequência nativa é substituído por C. b T134 da sequência nativa é substituído por C. c R158 da sequência nativa é substituído por C. d Semanas pós-imunização inicial e Reatividades para soros agrupados de animais reativos a ELISA. f Soro para ensaio de índice de neutralização diluído 1:100. Imunógenos para FMDV sintéticos otimizados da UBI elicitados em anticorpos de neutralização de porquinhos-da- índia simultaneamente contra sorotipos múltiplos tais como A, O e Ásia1 mostrando potencial para eficácia ampla inesperada nos sorotipos. Tabela 11

a T158 da sequência nativa é substituído por C. b Semanas pós-imunização inicial. d Reatividades para soros agrupados de animais reativos a ELISA. d Soro para ensaio de índice de neutralização diluído 1:100. Vacina O FMDV sintética otimizada da UBI empregando sequência de consensus derivada de sequências de sorotipo O múltiplas pode elicitar anticorpos de neutralização potentes logo nas 3 semanas pós-imunização inicial contra soro- tipos múltiplos tais como A, Ásia 1 e O, incluindo OTaiwan. Tabela 12 Proteção de Provocação por FMDV OTaiwan por vacina de OConsensus FMDV UBI

Vacina OConsensus FMDV UBITh, após duas imunizações nas semanas 0 e 3, protegeu eficazmente todos os porcos va-cinados (15/15) de provocação por FMDV OTaiwan em estudos conduzidos em quatro grupos experimentais em três ins-titutos internacionais. Todos os animais controle negativos (10/10) foram infectados por volta do dia 2 seguindo provo-cação viral. Tabela 13 Neutralização de O FMDV Ampla por Soro de Teste de Provocação PIADC UBI-USDA em Suíno

Todos os soros foram diluídos 1/100 e testados em diluições seriais do subtipo O de FMDV indicado. Os valores de índice de neutralização mostrados são o Log10 do TCID50 de ponto final, onde 50% de vírus inicial foram inativados. Vacina de OMixture FMDV UBITh elicitou no suíno anticorpos de neutralização mais amplamente protetores contra sub- tipos O de FMDV múltiplos após duas imunizações nas semanas 0 e 3. Tabela 14 Formulações de Vacina baseadas em imunógeno de VP1 de FMDV para vacinas Mono, Bi e Trivalentes se di-recionando a sorotipos específicos feitas especialmente para necessidades regionais

Teor de Imunógeno = 25 ug/mL contendo razão igual em peso de imunógenos de peptídeo de VP1 individuais Quantidade de Imunógeno por Dose para Suíno = 25 μg/mL/dose/IM Quantidade de Imunógeno por Dose para Gado = 100 μg/2mL/dose/IM IM = (Intramuscular) Tabela 15(1 de 2) 0 wpi 6 wpi

Tabela 15 Avaliação de Imunogenicidade após Duas Injeções para Peptídeos de Imunógeno de VP1 FMDV em Porcos através de ELISAs baseados em peptídeo alvo e Títulos de Anticorpo de Neutralização

Tabela 16 Avaliação Imunogênica após Duas Injeções quanto a Peptídeos de Imunógeno de VP1 FMDV em gado através de ELISAs baseados em peptídeo alvo e Títulos de Anticorpo de Neutralização

Tabela 17 Avaliação de Imunogenicidade após Duas Injeções para Peptídeos de Imunógeno VP1 FMDV em Gado através de ELISAs baseados em peptídeo alvo e Títulos de Anticorpo de Neutralização

Tabela 18 (1 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (2 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (3 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (4 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (5 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (6 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 18 (7 de 7) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de epitopo de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Suíno através de ELISA baseado em peptídeo alvo (OConsensus 2570a) e Ensaio de Neutralização contra Cepa Taiwan O FMDV

Tabela 19 (1 de 8) Avaliação de Imunogenicidade Funcional quando da administração única de formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de agrupamento de B derivado de VP1 FMDV e Th endógeno FMDV em Gado através de ELISA baseado em peptídeo alvo (O consensus 2570a) e Ensaio do e Neutralização contra Cepa O Taiwan FMDV

Tabela 19 (2 de 8)

Tabela 19 (3 de 8)

Tabela 19 (4 de 8)

Tabela 19 (5 de 8)

Tabela 19 (6 de 8)

Tabela 19 (7 de 8)

Tabela 19 (8 de 8)

Tabela 20 Estudos de Provocação Conduzidos em Porcos

Tabela 21 (1 de 2) A temperatura do corpo de cada porco foi registrada durante 1~14 dias após provocação

Tabela 21 (2 de 2)

Nota: DPC = Dias pós-provocação. Tabela 22 (1 de 2) Títulos de Anticorpo de Neutralização para Animais de Estudo

Tabela 22 (2 de 2) Títulos de Anticorpo de Neutralização para Animais de Estudo

a: Semana(s) pós-vacinação b: Dia(s) pós-provocação c: Média geométrica Tabela 23 (1 de 2) Os resultados de ELISA NS anti-FMDV

Tabela 23 (2 de 2) Os resultados de ELISA NS anti-FMDV

Tabela 24 (1 de 3) Os resultados de titulação de ELISA de anticorpo anti-VP1

Tabela 24 (1 de 3) Os resultados de titulação de ELISA de anticorpo anti-VP1

Tabela 24 (3 de 3) Os resultados de titulação de ELISA de anticorpo anti-VP1

Tabela 25 (1 de 5) Avaliação da eficácia da vacina para FMDV através de provocações de porcos recebendo administração única para formulações de vacina para FMDV contendo ambos os peptídeos de epitopo de B derivada de VP1 FMDV e Th endógeno de FMDV com isolados de FMDV de sorotipos relevantes

Tabela 25 (2 de 5)

Tabela 25 (3 de 5)

Tabela 25 (4 de 5)

Tabela 25 (5 de 5)

Tabela 26 (1 de 4)

Tabela 26 (2 de 4 )

Tabela 26 (3 de 4)

Tabela 26 (4 de 4)

Claims (21)

1. Composição de vacina para a doença do pé-e-boca (FMD), caracterizada por compreender: (a) um peptídeo imunogênico sintético compreendendo uma sequência de epítopo de célula B na alça em VP1 de FMDV representada pelas SEQ ID NOs: 1 a 12 e 16 a 22 e um epítopo Th; (b) um peptídeo separado consistindo em: (i) uma sequência de epítopo T auxiliar de FMDV sin-tético endógeno selecionada do grupo consistindo em qualquer uma das SEQ ID NOs: 34 a 87; (ii) uma sequência de epítopo T auxiliar de FMDV sin-tético endógeno de (i) ligada covalentemente a uma sequência de epí- topo T auxiliar artificial opcional representada pela SEQ ID NO: 24; (iii) SEQ ID NOs: 94 ou 95; e (iv) qualquer combinação de (i) a (iii), em que as sequências de epítopo T auxiliar em (i) e/ou (ii) estão ligadas covalentemente uma à outra através de um espaçador opcional; e (c) um veículo ou adjuvante de administração veterinaria- mente aceitável.

2. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 1, caracterizada pelo fato de que o epítopo de célula B do peptídeo imunogênico sintético em (a) é selecionado dentre o grupo consistindo em: (i) a sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3 a 11 e qualquer combinação das mes-mas; e (ii) a sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 17 a 21 e qualquer combinação das mesmas.

3. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o epítopo Th do peptídeo imunogênico sintético em (a) compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.

4. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético de (a) compreende o epítopo de célula B covalentemente ligado no terminal carboxila do epítopo Th.

5. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético de (a) compreende o epítopo de célula B covalentemente ligado ao epítopo Th através de um espaçador compreendendo um resíduo épsilon de lisina.

6. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) tem uma sequência de aminoá- cidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 25 a 28, e qualquer combinação das mesmas.

7. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 34 a 95, e qualquer combinações das mesmas.

8. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o veículo ou adjuvante de administração em (c) é selecionado dentre o grupo consistindo em Montanide ISA 50V, Monooleato de polioxietile- no (20) sorbitano, Emulsigen, Emulsigen D e um oligonucleotídeo CpG.

9. Composição de vacina para FMD, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em: qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 25 a 28, e qualquer combinação das mesmas; o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 34 a 95, e qualquer combinação das mesmas; e o veículo ou adjuvante de administração em (c) é selecionado dentre o grupo consistindo em Montanide ISA 50V, Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, Emulsigen, Emulsigen D e um oligonu- cleotídeo CpG.

10. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 9, caracterizada por compreender ainda um peptídeo sele-cionado dentre o grupo consistindo em: qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 29 a 33, e qualquer combinação das mesmas.

11. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) é SEQ ID NO: 25; o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 34 a 95, e qualquer combinação das mesmas; o veículo ou adjuvante de administração veterinariamente aceitável é uma emulsão de água em óleo (a/o 50/50) ISA 50V2, a 27,5 μg/mL por dose; e em que o peptídeo imunogênico sintético em (a) está pre-sente em uma proporção de 10:1 para o peptídeo separado em (b).

12. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) é SEQ ID NO: 25, 27, 28 e/ou qualquer combinação das mesmas; o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo que consiste em: (i) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 34 a 63; (ii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 61 a 63; e (iii) um peptídeo T auxiliar sintético de FMDV de SEQ ID NO: 90.

13. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 12, caracterizada por compreender ainda um peptídeo se-lecionado dentre o grupo que consiste em: qualquer uma das SEQ ID NOs: 29 e 31 e qualquer combinação das mesmas.

14. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) compreende uma mistura de SEQ ID NOs: 25 e 28; o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo que consiste em: (i) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 34 a 63; (ii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV das SEQ ID NOs: 34 a 39, 44, 46 a 51, 53 a 63; (iii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV das SEQ ID NOs: 34 a 39, 44, 46 a 51, 53 a 60; (iv) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV das SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40 a 43, 45, 48, 52, 53, 60 a 63; (v) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV das SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 48, 50, 53; (vi) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 62 a 78; (vii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 79 a 87; (viii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 88 a 89; (ix) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 91 a 92; e (x) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 91, 93 a 95; e o veículo ou adjuvante de administração em (c) é selecionado dentre o grupo que consiste em Montanide ISA 50V, Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, Emulsigen, Emulsigen D e um oligonu- cleotídeo CpG.

15. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico sintético em (a) é SEQ ID NO: 26; o peptídeo separado em (b) é selecionado dentre o grupo que consiste em: (i) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 91 a 92; e (ii) uma mistura de peptídeos T auxiliares sintéticos de FMDV de SEQ ID NOs: 91, 93 a 95; e o veículo ou adjuvante de administração em (c) é selecionado dentre o grupo que consiste em Montanide ISA 50V, Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, Emulsigen, Emulsigen D e um oligonu- cleotídeo CpG.

16. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 15, caracterizada por compreender ainda um peptídeo se-lecionado dentre o grupo que consiste em: qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 32, 33 e qualquer combinação das mesmas.

17. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada por ser para uso para elicitação de uma resposta imune em um animal.

18. Composição de vacina para FMD, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada por ser para uso para proteção de um animal de infecção por FMD.

19. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o animal é um porco ou uma vaca.

20. Composição de vacina para FMD, de acordo com a rei-vindicação 18, caracterizado pelo fato de que o animal é um porco.

21. Uso de peptídeo imunogênico sintético, peptídeo sepa-rado e um veículo ou adjuvante veterinariamente aceitável, caracteri-zado por ser na preparação de uma composição de vacina, como de-finida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, para elicitação de uma resposta imune em um animal ou para proteção de um animal de infecção por FMD.

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