MX2015006170A - Vacuna de emergencia basada en peptidos sinteticos contra la fiebre aftosa. - Google Patents

Abstract

Se dan a conocer inmunógenos peptídicos sintéticos de FMD y composiciones que contienen los mismos. También se dan a conocer métodos para detectar, tratar y prevenir una infección por FMD en un animal, al utilizar los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMD. En una modalidad específica, se describe una vacuna de emergencia basada en péptidos, y formulaciones de la misma, contra la Fiebre Aftosa. Diversas formulaciones de vacunas contienen una mezcla de péptidos derivados de la proteína VP1 de FMDV, y cada péptido contiene una secuencia de epítopo de células B neutralizante/de unión a receptores de FMDV, enlazada a un epítopo Th artificial para potenciar la inmunogenicidad de cada péptido. Las formulaciones de vacunas dadas a conocer, que contienen inmunágenos virales, pueden complementarse opcionalmente con una mezcla de péptidos que representan los epítopos Th endógenos de FMDV derivados de proteínas de FMDV, y homólogos y análogos funcionales de los mismos. Tales composiciones peptídicas virales se preparan en un sistema de suministro aceptable como formulaciones de vacunas, y pueden proporcionar protección a porcinos y bovinos contra la infección, en un desafío con FMDV, con una sola administración.

Description

VACUNA DE EMERGENCIA BASADA EN PÉPTIDOS SINTÉTICOS CONTRA LA FIEBRE AFTOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta descripción se relaciona con una vacuna de emergencia basada en péptidos, y formulaciones de la misma, contra el Virus de la Fiebre Aftosa (FMDV, por sus siglas en inglés) para el control de la Fiebre Aftosa (FMD, por sus siglas en inglés).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Fiebre Aftosa (FMD) es la enfermedad animal más contagiosa. El agente causante, el Virus de la Fiebre Aftosa (FMDV), es un aftovirus de la familia Picornaviridae que tiene un genoma de RNA en sentido positivo que codifica cuatro proteínas de cápside (VP1-VP4) y polipéptidos no estructurales (2A-2C y 3A-3D) (revisión de Carrillo, C. et al, 2005).

El FMDV se replica rápidamente y puede diseminarse a través del aire (transmisible por aerosoles) entre animales susceptibles infectados y en contacto, incluyendo animales de pezuña hendida, tales como bovinos, cerdos, ovejas y cabras. La FMD se encuentra en la lista A de enfermedades infecciosas de animales de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) y se ha reconocido como la restricción más importante para el comercio internacional en animales y productos de origen animal. Actualmente, la FMD se controla por cuarentena y destrucción de animales infectados y expuestos y, en la mayor parte de los países, por vacunación con composiciones de virus inactivado químicamente. A causa de las consecuencias económicas perjudiciales que resultan de su presencia, los países que se encuentran libres de la enfermedad han introducido una serie de medidas para retener su estatus sin vacunación.

Se han descrito siete serotipos distintos de FMDV y cada serotipo además se divide en múltiples subtipos. Estos serotipos incluyen: A, O, C, Asia, y los tipos sudafricanos SAT-1 , 2 y 3, con A, O y Asia siendo los más comunes. Además de la complejidad y variabilidad genética del virus, el FMDV puede mutar con una tasa elevada de manera aleatoria.

Una dificultad significativa para formular vacunas para FMDV es la notable diversidad antigéníca del virus y la falta de protección cruzada entre serotipos. Es decir, los animales vacunados o recuperados de un virus de un serotipo, son susceptibles a la infección con virus de los seis serotipos restantes. Más aún, el grado de variación antigéníca dentro de un serotipo es tal que una vacuna efectiva contra un subtipo puede no ser protectora contra otro subtipo dentro de ese mismo serotipo.

Las vacunas actuales contra FMD contienen una mezcla de virus inactivados, incluyendo una cepa de referencia de cada serotipo o subtipo relevante, lo cual se determina al monitorear las cepas de virus presentes en la circulación local. Para prevenir brotes de variantes emergentes de FMD, los aislamientos de campo deben monitorearse periódicamente y compararse con la vacuna actual en producción. De esta manera, para asegurar que la vacuna es actual y efectiva, la producción de vacunas de virus de FMD inactivados requiere: (1) cultivar e inactivar varias cepas de virus para incluirse en la vacuna, (2) monitorear la potencia y eficacia de cada cepa inactivada y (3) reformular el producto de vacunación periódicamente para incluir las cepas actuales para prevenir la pérdida de eficacia protectora al emerger variantes nuevas.

Producir y mantener una vacuna de virus inactivado eficiente es laborioso y complicado en vista de la significativa variación antigénica entre todos y cada uno de los serotipos de FMDV. Los diversos problemas y desventajas conocidos, asociados con las vacunas contra FMDV inactivado incluyen: riesgos biológicos y de bioseguridad, inestabilidad y variabilidad del producto, y efectos secundarios perjudiciales involuntarios en los animales tratados.

Por ejemplo, la elaboración de vacunas de virus inactivado crea riesgos biológicos/de bioseguridad dado que el virus debe producirse en una instalación con alto nivel de contención para prevenir la contaminación del ambiente inmediato. Además, la inocuidad del producto de virus inactivado no puede asegurarse completamente. De hecho, varios casos recientes de FMDV en Europa se han atribuido a virus inactivado en forma incompleta. Estos potenciales riesgos biológicos/de bioseguridad limitan el número de proveedores calificados de vacunas a sólo unos cuantos. Tales limitaciones pueden Impedir la capacidad de una región para responder, de manera efectiva e inmediata, a un brote.

Las vacunas contra FMD actuales también adolecen de la inestabilidad del producto así como de variabilidad lote a lote. Como se discute anteriormente, las vacunas deben monitorearse y reformularse periódicamente para incluir cepas actuales y emergentes de FMDV. Más aún, cada región del mundo requerirá protección contra una cepa diferente actual/emergente de FMDV en cualquier momento determinado. De esta manera, se producen composiciones complejas e indefinidas de vacunas de virus inactivado en todo el mundo. Estas mezclas complejas de vacunas de virus inactivado deben inspeccionarse de manera continua a regular intervalos para asegurar la potencia inmunológica.

Además de los problemas anteriores, se ha mostrado que las vacunas contra FMDV actuales dan lugar a efectos secundarios perjudiciales involuntarios en los animales tratados. Por ejemplo, reacciones alérgicas, choque anafiláctico y muerte espontánea se han reportado en animales tratados con las vacunas actuales.

Las desventajas de las vacunas comerciales existentes, basadas en Usados virales inactivados, han alentado la investigación para crear productos subunitarios más seguros y mejor definidos (Brown, F. 1992). Sin embargo, para poder ser un reemplazo aceptable para el virus inactivado, tales productos subunitarios deben tener una inmunogenicidad equivalente a la de las vacunas de virus inactivado, y proporcionar un amplio espectro de protección contra las variantes antigénicas. De manera más significativa, ios productos subunitarios deben cumplir con los lineamientos de la OIE para estudios de desafío después de una sola administración de la vacuna, con el fin de calificarse como vacuna de emergencia contra FMD.

Para superar algunos de los problemas asociados con las vacunas contra FMD comerciales existentes, basadas en lisados virales, el inventor y su equipo de investigación han dado pasos significativos durante los pasados 15 años en el desarrollo de vacunas contra FMDV basadas en péptidos sintéticos para proteger a los cerdos contra el desafío con FMDV. En particular, el inventor desarrolló con éxito una efectiva vacuna contra FMDV que es capaz de suscitar una gran variedad de anticuerpos neutralizantes contra FMDV al utilizar una formulación que contiene un péptido optimizado de epítopos de células B en bucle de VP1. La inmunogenicidad de este péptido de epítopos de células B en bucle de VP1 además puede potenciarse al enlazar de manera covalente el péptido a un epítopo artificial de célula T cooperadora (Wang, CY and Shen, M, 2000; Wang, CY et al, 2001; Wang, CY, et al, 2002). Se ha mostrado que esta vacuna protege efectivamente a los cerdos del desafío con FMDV después de múltiples administraciones de una formulación (Wang, CY, et al. 2002). La formulación de péptido de epítopos de células B en bucle de VP1 ha demostrado ser una importante vacuna en la protección de animales contra cepas clásicas de virus FMDV.

Para calificarse como vacuna contra FMD de “emergencia” bajo el protocolo de la OIE, una formulación debe inducir una rápida inmunidad protectora con amplia cobertura antigénica en los serotipos de FMD después de únicamente una sola administración. Aunque múltiples administraciones de la formulación de péptido de epítopos de células B en bucle de VP1 proporcionan una protección efectiva contra las cepas clásicas de virus FMDV, las administraciones únicas de la formulación no han sido capaces de proteger a los cerdos contra el desafío con FMDV en una emergencia.

Además, no se ha demostrado que la formulación de péptido de epítopos de células B en bucle de VP1 proteja a los bovinos contra el desafío con FMDV después de una o dos administraciones (Rodríguez, LL. et al.2003).

Existe una necesidad urgente de explorar la vasta literatura en el dominio público, para identificar y validar correlaciones de las respuestas inmunes protectoras requeridas en una vacuna de emergencia de FMD, con el fin de permitir el desarrollo de una vacuna contra FMD basada en péptidos segura y eficaz, y formulaciones de la misma, para su uso protector en emergencia y general contra FMDV.

En vista de las desventajas y limitaciones de las vacunas actualmente disponibles para FMD, permanece una necesidad urgente de una formulación de vacuna de emergencia que sea capaz de proteger a los cerdos y bovinos contra el FMDV después de únicamente una sola administración.

Referencias: Blanco, E., et al., “Interspecies major histocompatibility complex-restricted Th cell epitope on foot-and-mouth disease virus capsid protein VP4.” J. Viro/., 74:4902-4907. (2000) Brown, F., et al. “The Effect of Various Inactivating Agents on the Viral and Ribonucleic Acid Infectivities of Foot-and-Mouth Disease Virus and on its Attachmentto Susceptible Celis.” J Gen Microbiol., 31:179-186. (1963) Brown F., “New approaches to vaccination against foot-and-mouth disease.” Vaccine, 10:1022-6. (1992) Carrillo, C., et al., “Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus.” J. Virol., 79:6487-6504. (2005) Collen, T., et al., “A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle.” J. Immunoi, 146:749-755. (1991) Collen, T., et al., “Heterotypic recognition of recombinant FMDV proteins by bovine T-cells: the polymerase (P3Dpol) as an immunodominant T-cell immunogen.” Virus Res., 56:125-133. (1998) Cox SJ, et al., “Longevity of antibody and cytokine responses following vaccination with high potency emergency FMD vaccines.” Vaccine. 21(13-14), 1336-1347 (2003J Filgueira, MP, et al., “Detection and characterization of functional T cell epitopes on the structural proteins VP2, VP3 and VP4 of Foot and Mouth Disease Virus 01 Campos.” Virology, 271: 234-2. (2000) Garcia-Briones, M. et al., “Association of bovine DRB3 alíeles with immune response to FMDV peptides and protection against viral challenge.” Vaccine, 19:1167-1171. (2001) Garcia-Briones, M, et al. , “Immunogenicity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D.” Virology, 322:264-27. (2004) Gerner, W., et al., “Identification of novel foot-and -mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine.” Virus Res., 121:223-228. (2006) Gerner, W., et al., “Identification of a novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitope with immunodominant characteristics in cattle with MHC serotype A31” Vet. Res., 38:565-572. (2007) Gerner W., et al., “Identification of Major histocompatibility Complex Restriction and Anchor Residues of Foot-and-Mouth Disease Virus-Derived Bovine T-cell epitopes.” J. Viro/., 83:4039-4050. (2009) Guzman, E., et al., “An MHC-restricted CD8+ T-cell response is induced in cattle by foot-and-mouth disease virus (FMDV) infection and also following vaccination with inactivated FMDV.” J. Gen. Viro!., 89:667-675. (2008) Haghparast, A., et al., “Selection of T-cell epitopes from foot-and-mouth disease virus reflects the binding affinity to different cattle MHC class II molecules.” Immunogenetics, 51:733-742. (2000) Hohlich, BJ, et al., “Induction of an antigen-speclflc Immune response and partial protection of cattle against challenge infection with foot-and-mouth disease virus (FMDV) after lipopeptide vaccination with FMDV-specific B cell epitopes.” J. of Gen. Virology, 84:3315-3324. (2003) Masón, PW, et al., “Comparisons of the complete genomes of Asian, African and European isolates of a recent foot-and-mouth disease virus type O pandemic strain (PanAsia).” J. Gen. Viroi, 84:1583-1593. (2003) Moore V, Chapter 2. In: Synthetic Peptides: A Users Guide. Grant GA, ed. New York: WH Freeman and Company: 63-7. (1992) Morgan DO and Moore DM. “Protection of cattle and swine against foot-and-mouth disease, using biosynthetic peptide vaccines.” Am J Vet Res. 51(1):40-5. (1990) Rodríguez A, et al., “Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and-mouth disease virus structural proteins: Identification of T helper epitopes in VP1.” Vi rol., 205:24-33. (1994) Rodríguez, LL, et al., “Synthetic peptide containing the consensus sequence of the G-H Loop región of FMDV Type O VP1 Combined with a promiscuous T-helper epitope induces peptide specific AB but fails to protect cattle against viral challenge.” Vaccine, 21:3751-3756. (2003) Takamatsu HH, “A sub-population of circulating porcine gammadelta T cells can act as professional antigen presenting cells.” Vet Immunol Immunopathol. , 87(3-4):223-4 (2002) Van Lierop, MJ, et al., “T cell-stimulatory fragments of foot-and-mouth disease virus released by mild treatment with cathepsin D.” J. Gen.

Virol., 75:2937-2946. (1994) Van Lierop, MJ, et al., “Sequences derived from the highly antigenic VP1 región 140 to 160 of foot-and-mouth disease virus do not prime for a bovine T-cell response against intact virus.” J. Virol., 69:4511-4514. (1995a) Van Lierop MJ, et al., “The influence of MHC polymorphism on the selection of T-cell determinants of FMDV in cattle.” Immunology, 84:79-85. (1995b) Wang CY, Shen M., “Synthetic peptide vaccines for foot-and-mouth disease.” U.S. Patent No. 6,107,021. (2000) Wang, CY, et al., “Synthetic Peptide-based Vaccine and Diagnostic System for Effective Control of FMD.” Biologicals, 29:221-228. (2001) Wang, CY, et al., “Effective Synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine.” Vaccine, 20:2603-2610. (2002) SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se dirige a péptidos sintéticos que son útiles para la detección, tratamiento y/o prevención de la fiebre aftosa (FMD) en un animal. Los péptidos sintéticos de la descripción incluyen antígenos peptídicos que pueden utilizarse para detectar, sensible y específicamente, la infección por FMD en un animal. Los péptidos sintéticos también incluyen inmunógenos peptídicos que tienen epítopos de células B (B) y células T cooperadoras (Th) que actúan en conjunto para estimular la generación de respuestas inmunes protectoras a la infección por FMD. En ciertas modalidades, los péptidos sintéticos son tanto antígenos peptídicos como inmunógenos peptídicos. En algunas modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos para el virus de FMD (FMDV) en un animal. En otras modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para tratar animales con prueba positiva para la presencia de FMDV y/o en animales que se han expuesto a animales con prueba positiva a FMDV. Incluso en otras modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para prevenir la infección por FMD en un animal.

La presente descripción también se dirige a composiciones que contienen péptidos sintéticos. Tales composiciones pueden utilizarse para la detección, tratamiento y/o prevención de la FMD en un animal. En ciertas modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos para FMDV en una muestra. En otras modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos son composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir la infección por FMD en un animal. En una modalidad particular, la composición farmacéutica se utiliza para suscitar una respuesta inmune para FMDV en un animal. En una modalidad específica, la composición farmacéutica es una composición de vacuna que puede prevenir la infección por FMD en un animal expuesto al virus.

La presente descripción también incluye métodos para detectar, tratar y/o prevenir la infección por FMD en un animal. Los métodos dados a conocer utilizan los péptidos sintéticos y las composiciones que contienen los péptidos sintéticos, dados a conocer también en este documento.

En ciertas modalidades, la presente descripción se dirige a una composición farmacéutica basada en péptidos que se califica como vacuna de emergencia, de acuerdo con los lineamientos de la OIE, dado que la composición ofrece a los animales una protección suficiente y adecuada contra la infección por FMD después de una sola administración. En estas modalidades, la composición farmacéutica que puede utilizarse como vacuna de emergencia contiene inmunógenos peptídicos que imitan los sitios antigénicos en las proteínas de FMD nativas, así como proteínas patógenas derivadas de epítopos endógenos de células T. Las formulaciones descritas suscitan eficientemente anticuerpos funcionales contra proteínas de FMD objetivo, para ofrecer a los animales protección contra el desafío con FMD.

En diversas modalidades, los inmunógenos peptídicos sintéticos pueden contener péptidos en bucle de VP1 que tienen un sitio antigénico de células B capaz de suscitar anticuerpos neutralizantes contra FMDV (SEQ ID NOs: 1 y 2), homólogos de los mismos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 3-23, 96-99) y combinaciones de los mismos.

Los péptidos en bucle de VP1 dados a conocer también pueden contener un epítopo de célula T cooperadora (SEQ ID NO: 24) que se enlaza de manera covalente al extremo amino o carboxilo terminal del antígeno peptídico para potenciar la ¡nmunogenicidad del péptido antigénico de célula B (por ejemplo, SEQ ID NOs: 25-33, 100-102). En ciertas variaciones, los inmunógenos peptídicos se complementan con una mezcla de péptidos que representan los epítopos de célula T cooperadora para proporcionar inmunidad mediada por células del hospedador. Tales péptidos incluyen epítopos de célula T cooperadora derivados de las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B y 3D de (por ejemplo, SEQ ID NOs: 34-63), homólogos y análogos funcionales de los mismos, así como péptidos de bibliotecas derivadas de secuencias combinatorias (por ejemplo, SEQ ID NOs: 64-87) y péptidos de epítopos Th de FMDV diseñados en forma de casete mejorado UBITh® (por ejemplo, SEQ ID NOs: 88-95).

La presente descripción también proporciona métodos para suscitar respuestas inmunes mediadas tanto por anticuerpos como por células contra FMDV en un animal. Tales métodos proporcionan protección cruzada contra FMD a animales que se encuentran libres de anticuerpos contra FMDV en el desafío viral con FMDV. En modalidades específicas, los métodos dados a conocer incluyen una etapa de administrar una composición farmacéutica que contiene un grupo de péptidos de epítopos combinados de célula B y T cooperadora de FMDV a un animal.

La presente descripción también proporciona un método para la elaboración y control de calidad a bajo costo de péptidos inmunogénicos de FMD, una formulación de vacuna de emergencia que contiene los mismos, así como un sistema de suministro capaz de proteger animales contra el desafío con FMDV en una emergencia, con únicamente una sola administración de la formulación de vacuna.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un esquema que ilustra la distribución y ubicación de epítopos de células B y Th en proteínas de FMDV, de acuerdo con una modalidad particular dada a conocer en este documento. Las posiciones de aminoácidos identificadas en el dibujo para las proteínas se basan en la secuencia de la secuencia genómica de FMDV 0Ta¡wan99· El nombre de cada uno de los productos génicos (VP4, VP2, VP3, VP1+2A, 2B+2C, 3A+3B1+B2, B3, 3C y 3D) se identifica seguido por barras vacías de diferentes longitudes con base en los tamaños de las proteínas codificadas respectivas. Los epítopos de células B y T también se identifican con base en sus tamaños respectivos (número de aminoácidos) y ubicación (número de aminoácido dentro de la proteína de donde se deriva el epítopo) de los epítopos, con cada epítopo marcado por su primer y último aminoácido y su numeración dentro de esa proteína (por ejemplo, para VP4: S221-M235 significa que el epítopo de célula T es de 15 aminoácidos de longitud, comenzando con Serina en la posición del aminoácido 221 y terminando en Metionina en la posición del aminoácido 235 dentro de la proteína VP4).

La Figura 2 es un diagrama de flujo que identifica el proceso de desarrollo, del descubrimiento a la comercialización, de una formulación de vacuna, de acuerdo con una modalidad particular dada a conocer en este documento.

La Figura 3A es una gráfica que muestra títulos de anticuerpos neutralizantes (NA) de bovinos que recibieron dos administraciones de la vacuna UBITh® VP1 (SEQ ID NO: 25). Quince bovinos libres de FMDV, con edades de 6-12 meses, se inmunizaron a las 0 y 3 semanas. Se recolectaron sueros semanalmente entre 0 y 6 semanas y se analizaron en sus títulos de NA después de cada inmunización.

La Figura 3B es una gráfica que muestra títulos de anticuerpos neutralizantes (NA) de cerdos que recibieron dos administraciones de la vacuna UBITh® VP1 (SEQ ID NO: 25). Quince cerdos libres de FMDV, con edades de 3 a 5 semanas, se inmunizaron a las 0 y 3 semanas. Se recolectaron sueros semanalmente entre 0 y 6 semanas y se analizaron en sus títulos de NA después de cada inmunización.

La Figura 4A es una gráfica que ilustra la respuesta inmune celular (producción de IFN-g) inducida por PBMC en cerdos que recibieron una sola administración de una formulación de vacuna UBITh® FMD que contenía un epítopo de célula B derivado de VP1 (Oconsensus SEQ ID NO: 25) y péptido de grupos de casetes de Th de FMDV endógeno potenciado UBITh® (SEQ ID NO: 90) en una relación 10:1 en peso en emulsión agua en aceite (ag/ac 50/50) ISA50V2 a 27.5 mg/ml por dosis. Los animales se sangraron semanalmente y la capacidad de sus PBMC para responder in vitro a antígenos peptídicos de vacunación de memoria con respuesta de IFN-g se determinó como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 4B es una gráfica que ilustra la respuesta inmune celular (producción de IFN-g) inducida por PBMC en cerdos que recibieron una sola administración de una formulación de vacuna UBITh® FMD que contenía un epítopo de célula B derivado de VP1 (Oconsensus SEQ ID NO: 25) y péptido de grupos de casetes de Th de FMDV endógeno potenciado UBITh® (SEQ ID NO: 90) en una relación 10:1 en peso en emulsión agua en aceite (ag/ac 50/50) ISA50V2 a 27.5 pg/ml por dosis (cuadro lleno¦) en comparación con animales control negativo sin vacunar (círculos vacíos O). Los animales se sangraron en el día 28 antes del desafío y los valores finales se corrigieron al restar de los valores básales del día 0.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente descripción se dirige a péptidos sintéticos que son útiles para la detección, tratamiento y/o prevención de la fiebre aftosa (FMD) en un animal. Los péptidos sintéticos de la descripción incluyen antígenos peptídicos que pueden utilizarse para detectar, sensible y específicamente, anticuerpos para el virus de FMD en un animal. Los péptidos sintéticos también incluyen inmunógenos peptídicos que tienen epítopos de células B (B) y células T cooperadoras (Th) que actúan en conjunto para estimular la generación de respuestas inmunes protectoras a la infección por FMD. En ciertas modalidades, los péptidos sintéticos son tanto antígenos peptídicos como inmunógenos peptídicos. En algunas modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos para el virus de FMD (FMDV) en un animal. En otras modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para tratar animales con prueba positiva para la presencia de FMDV y/o en animales que se han expuesto a animales con prueba positiva a FMDV. Incluso en otras modalidades, los péptidos sintéticos se utilizan para prevenir la infección por FMD en un animal.

La presente descripción también se dirige a composiciones que contienen péptidos sintéticos. Tales composiciones pueden utilizarse para la detección, tratamiento y/o prevención de la FMD en un animal. En ciertas modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos se utilizan para detectar la presencia de FMDV en una muestra. En otras modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos son composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir la infección por FMD en un animal. En una modalidad particular, la composición farmacéutica se utiliza para suscitar una respuesta inmune para FMDV en un animal. En una modalidad específica, la composición farmacéutica es una composición de vacuna que puede prevenir la infección por FMD en un animal expuesto al virus.

La presente descripción también incluye métodos para detectar, tratar y/o prevenir la infección por FMD en un animal. Los métodos dados a conocer utilizan péptidos sintéticos y las composiciones que contienen péptidos sintéticos, dados a conocer en este documento. a. Epítopos de células B - Inmunóqenos peptídicos sintéticos de FMDV Las secuencias de aminoácidos para los inmunógenos peptídicos sintéticos se obtuvieron al alinear y evaluar sitios antigénicos de células B en proteínas estructurales VP1 a partir de múltiples cepas homologas de FMDV serotipo O. Con base en el alineamiento mostrado en la Tabla 2, se obfuvo una secuencia antigénica de consenso de 25 aminoácidos, que corresponde a los residuos de aminoácidos 134 a 158 de la proteína estructural VP1 de FMDV de longitud completa (SEQ ID NO: 1). (Un ejemplo de numeración de aminoácidos, para una secuencia de VP1 de longitud completa, puede encontrarse en la Entrada del Genbank No. NP_740460). Los aminoácidos correspondientes a las posiciones 134 y 158 se sustituyeron con residuos de cisterna para permitir que el péptido formara una estructura de bucle intradisulfuro. Un péptido antigénico de consenso de FMDV más largo, que contenía 41 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), también se obtuvo a partir de este alineamiento. La segunda secuencia de consenso abarca la SEQ ID NO: 1 e incluye secuencias de flanqueo adicionales en los extremos N y C terminales. La segunda secuencia de consenso corresponde a los residuos de aminoácidos 129 a 168 de una proteína estructural VP1 de FMDV de longitud completa, con los aminoácidos correspondientes a las posiciones 134 y 158 sustituidos con residuos de cisterna. Las dos secuencias de consenso se identifican como se muestra en la Tabla 1.

Las secuencias de consenso para epítopos de células B de VP1, a partir de los serotipos O, Asia 1 y A, también se obtuvieron a través de alineamientos homólogos similares y se muestran como SEQ ID NOs: 2, 12, y 16 en la Tabla 2. Los aminoácidos para las posiciones variables dentro de cada secuencia de consenso se asignaron con base en el aminoácido que apareció más frecuentemente dentro de la cepa de serotipo respectivo en esas posiciones.

Las variaciones efectivas y aceptables de los inmunógenos peptídicos sintéticos de SEQ ID NO: 1 y 2 incluyen homólogos inmunológicamente funcionales que tienen secuencias y elementos de conformación correspondientes de cepas mutantes y variantes de FMDV. Los péptidos antigénicos homólogos de FMDV tienen residuos de aminoácidos que correlacionan estrechamente con las posiciones de proteínas estructurales VP1 129 a 168 de la variante de origen FMDV cepa Ora¡Wan, y la secuencia de consenso derivada de múltiples cepas de FMDV serotipo O (Masón, PW et al, 2003). Tales homólogos pueden identificarse fácilmente a través de programas de alineamiento de secuencias tales como ClustalW (producido por Julie D. Thompson, Toby Gibson del European Molecular Biology Laboratory, Alemania y Desmond Higgins del European Bioinformatics Institute, Cambridge, RU. Algorítmico). La Tabla 2 muestra la secuencia de FMDV Oconsensus (2570a, SEQ ID NO: 2) así como un alineamiento por ClustalW de veintidós secuencias antigénicas en la proteína estructural VP1 de FMDV tomadas a partir de múltiples serotipos y diversas cepas, incluyendo. Ocampos> OTa¡wan> OMyanmari Oozki O|_anzou AS¡3 l Yunnan> Asía 1 Jiansui A24, AG ansui Ax¡njiang> C|ndaial> C3Belgium C3Argent¡na> 6tC. (SEQ ID NOS. 3 3. 23).

Los homólogos adicionales de VP1 que se incluyen en la presente invención incluyen péptidos y proteínas que contienen la característica secuencia de unión a receptores celulares “RGD” (Arg-Gly-Asp), encontrada invariablemente en la estructura en bucle de las secuencias de VP1 de todas las cepas de FMDV. Esta secuencia RGD corresponde a las posiciones de aminoácidos 145 a 147 de la proteína VP1.

Como se muestra en la Tabla 2, el número de aminoácidos encontrados corriente abajo (hacia el extremo C terminal) de la secuencia “RGD” es el mismo entre las diversas secuencias de VP1. Sin embargo, el número de aminoácidos corriente arriba (hacia el extremo N terminal) de la secuencia RGD varía, lo que depende del serotipo particular (por ejemplo, O, Asia 1 , A o C). Dentro de cada serotipo, las secuencias del extremo N terminal tienen por lo menos 75% de identidad con la secuencia de consenso para ese serotipo particular (por ejemplo, SEQ ID NOs: 13 a 15 en comparación con la SEQ ID NO: 12 para el serotipo Asia 1 ; y SEQ ID NOs: 17 a 19 en comparación con la SEQ ID NO: 16 para el serotipo A). En una modalidad, el homólogo de la cepa OMyanmar/7/02 variante (SEQ ID NO: 7) tiene más de 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2 (con los residuos diferentes a aquellos en la secuencia de consenso que se muestra sombreada). En otra modalidad, el homólogo de la cepa Oozk/93 variante (SEQ ID NO: 8) tiene aproximadamente 90% de identidad con la SEQ ID NO: 2 (con los residuos diferentes a aquellos en la secuencia de consenso que se muestra sombreada).

Los péptidos homólogos de VP1 , mostrados en la Tabla 2 y descritos de otra manera, pueden combinarse en una composición en una proporción apropiada, y administrarse a un animal para suscitar efectivamente anticuerpos neutralizantes que se orientan a cepas específicas de FMDV. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas que contienen péptidos homólogos de VP1 son vacunas efectivas para prevenir la infección por FMD. Por ejemplo, las formulaciones que contienen el o los péptidos homólogos de VP1, preparadas como emulsión agua en aceite (ag/ac) (por ejemplo, con ISA50V2) o como emulsión agua en aceite en agua (ag/ac/ag) (por ejemplo, con Emulsigen), son efectivas en la prevención de la infección por FMD.

A continuación se proporcionan diversas modalidades y ejemplos que discuten el uso de los efectos de las composiciones que contienen múltiples péptidos de secuencias de VP1. Por ejemplo, los Ejemplos 6, 7, 9 y 10 describen una composición de vacuna porcina y/o bovina multivalente de FMDV, que contiene una combinación de tres péptidos VP1 de FMDV serotipo O, que corresponden a las secuencias de Oconsensus, Oswine/cattie/o/Mya/7/02 (abreviado como Oyiyanmar) Y Oozk/93 (abreviado como Oozk)· La composición que contiene esta mezcla de péptidos puede producir una potente vacuna porcina trivalente para contrarrestar la infección impuesta por las múltiples cepas O divergentes. De manera similar, una vacuna de serotipos múltiples al utilizar una combinación de péptidos VP1 con Oconsensus (2570a), Asia 1 JiangSu/China/2005 (abreviado como Asia IjiangSu), y Acansu/China/60Y (abreviado como Acansu) puede mezclarse para formar una vacuna bovina de serotipos trivalentes para contrarrestar la infección impuesta por cepas de múltiples serotipos de FMDV en China. Adicionalmente, una vacuna bovina efectiva de serotipos múltiples, adaptada para Sudamérica, que contiene una combinación de péptidos de secuencias VP1 de Ocampos/Braz¡i/58Y (abreviado COmO Ocampos) A24 Cruzeiro California ( breviado COITIO A24) y C|ndaial/Brazil/84Y (abreviado como Cinda¡ai)> es efectiva en contrarrestar las infecciones por FMD impuestas por cepas de los múltiples serotipos más prevalentes en Sudamérica.

La ubicación del epítopo de célula B en la proteína VP1 de FMDV que se seleccionó para incluirse en los péptidos sintéticos de la presente invención, en relación con otras regiones y proteínas de FMDV, se muestra en la Figura 1. Las secuencias de proteínas se basan en la secuencia del genoma de FMDV 0Ta¡wan 99/secuencia de aminoácidos codificados) (Entrada GenBank No. AJ539137).

Los análogos inmunológicamente funcionales de los inmunógenos peptídicos sintéticos también son efectivos en suscitar una respuesta inmune en un animal y se incluyen como parte de la presente invención. Los análogos inmunológicamente funcionales incluyen variantes de las secuencias de consenso de las SEQ ID NOs: 1 , 2, 12 y 16 y/u homólogos de las SEQ ID NOs: 3-11 , 13-15 y 17-23 que retienen sustancialmente la misma antigenicidad e inmunogenicidad que el péptido original. Por ejemplo, las variantes que son análogos funcionales pueden tener una sustitución conservativa en una posición de aminoácido, un cambio en la carga global, una unión covalente a otra fracción, o adiciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos, y/o cualquier combinación de los mismos.

Las sustituciones conservativas son cuando un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido con propiedades químicas similares. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (alcalinos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En una modalidad, el análogo inmunológicamente funcional de un péptido particular contiene la misma secuencia de aminoácidos que el péptido original, y además incluye tres lisinas (Lys-Lys-Lys) agregadas al extremo amino terminal del péptido. En esta modalidad, la inclusión de tres lisinas a la secuencia peptídica original cambia la carga global del péptido original, pero no altera la función del péptido original.

En una modalidad particular, el análogo funcional tiene por lo menos 50% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. En otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. Incluso en otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. Aún en otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. b. Epítopos endógenos de célula T cooperadora (Th) de FMDV Las composiciones que contienen péptidos ¡nmunógenos sintéticos pueden incluir péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV. La presencia de epítopos Th en formulaciones farmacéuticas/de vacunas sensibilizan la respuesta inmune en animales tratados al iniciar la activación de células T específicas de antígenos, una correlación crítica para la protección contra FMDV. Adicionalmente, las formulaciones que incluyen epítopos Th inmunodominantes cuidadosamente seleccionados, presentes en proteínas de FMDV, pueden producir una amplia inmunidad mediada por células, lo que hace a las formulaciones efectivas para tratar y proteger animales que tienen diversas constituciones genéticas, tales como los bovinos.

Los animales inmunizados con una sola administración de formulaciones que contienen péptidos de inmunógenos con epítopos de células B en combinación con péptidos de epítopos de célula T cooperadora, de proteínas de FMDV, son capaces de activar respuestas proliferativas de linfocitos con la exposición subsecuente a FMDV de una infección natural o una prueba de desafío con FMDV. Las respuestas proliferativas conducen a la producción de citocinas, incluyendo producción de IFN-g, que potencia las respuestas inmunes mediadas por células, para una diversidad de infecciones virales citopáticas en animales.

Los péptidos de epítopos Th de las SEQ ID NOs: 34-63 se identificaron al utilizar ensayos de proliferación de células T in vitro y al evaluar, in vivo e in vitro, la producción de citocina IFN-g en animales hospedadores inmunizados con formulaciones/vacunas contra FMD que contienen los epítopos Th. Adicionalmente, las formulaciones que contienen (a) péptidos VP1 de grupos de epítopos de células B de FMDV y (b) grandes combinaciones de depósito de los péptidos Th endógenos de FMDV se analizaron para determinar la composición farmacéutica apropiada capaz de producir, efectiva y consistentemente, la inmunidad celular necesaria en una diversidad de animales hospedadores que tienen un antecedente genético diverso, tales como los bovinos. Además de monitorear la producción de IFN-y in vitro en hospedadores inmunizados/vacunados, los títulos de anticuerpos neutralizantes también se evaluaron para determinar si estos hospedadores eran capaces de montar anticuerpos neutralizantes contra FMDV with únicamente una sola administración de la formulación.

En diversas modalidades, los péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV se derivan de segmentos antigénicos de las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B y 3D de FMDV. La Tabla 4 identifica péptidos Th endógenos de FMDV específicos (SEQ ID NOs: 34-63) que se encontraron particularmente útiles cuando se utilizaron en las formulaciones de la presente invención. Específicamente, los epítopos Th endógenos de FMDV listados en la Tabla 4 se reconocen por células T porcinas y bovinas obtenidas de hospedadores inmunizados con (a) formulaciones/vacunas de lisados virales de FMDV y (b) formulaciones peptídicas que contienen péptidos Th candidatos de FMDV. La distribución y ubicación de los epítopos Th en las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B y 3D de FMDV (listadas en la Tabla 4), en relación con otras regiones y proteínas de FMDV, se muestran en la Figura 1. Las secuencias de proteínas se basan en la secuencia del genoma de FMDV 0Ta¡wan 99/secuencia de aminoácidos codificados) (Entrada GenBank No. AJ539137).

Los homólogos de los epítopos Th identificados en la Tabla 4 también son efectivos y se incluyen en la presente invención. Por ejemplo, las SEQ ID NOs: 64-78 son secuencias homologas de epítopos Th de FMDV OTAW/2/99 (Entrada GenBank No. AJ539137). La Tabla 5 proporciona alineamientos de secuencias para comparar los epítopos Th de FMDV O aiwan/99 con epítopos Th homólogos de FMDV OTAW/2/99- Específicamente, la Tabla 5 alinea epítopos Th homólogos de la proteína 3D de FMDV (SEQ ID NOs: 61 vs 64; 62 vs 65; 63 vs 66; 60 vs 71 y 72); proteína 2B de FMDV (SEQ ID NOs: 48 vs 67 y 68), proteína 3A de FMDV (SEQ ID NOs: 53 vs 69 y 70), proteína VP4 de FMDV (SEQ ID NOs: 34 vs 73 y 74), proteína VP2 de FMDV (SEQ ID NOs: 36 vs 75 y 76) y proteína VP3 de FMDV (SEQ ID NOs: 37 vs 77 y 78).

Los análogos inmunológicamente funcionales de los péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV también son efectivos y se incluyen como parte de la presente invención. Los análogos inmunológicamente funcionales incluyen variantes de las SEQ ID NOs: 34-63 y/u homólogos de las SEQ ID NOs: 64-78 que retienen sustancialmente el misma inmunogenicidad que el péptido original. Por ejemplo, las variantes que son análogos funcionales pueden tener una sustitución conservativa en una posición de aminoácido, un cambio en la carga global, una unión covalente a otra fracción, o adiciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos, y/o cualquier combinación de los mismos.

Las sustituciones conservativas son cuando un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido con propiedades químicas similares. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (alcalinos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En una modalidad particular, el análogo funcional tiene por lo menos 50% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. En otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. Incluso en otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos original. Aún en otra modalidad, el análogo funcional tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos original.

En una modalidad, el análogo inmunológicamente funcional de un péptido particular contiene la misma secuencia de aminoácidos que el péptido original, y además incluye tres lisinas (Lys-Lys-Lys) agregadas al extremo amino terminal del péptido. En esta modalidad, la inclusión de tres lisinas a la secuencia peptídica original cambia la carga global del péptido original, pero no altera la función del péptido original.

La Tabla 6 identifica otra variación de un análogo funcional para el péptido de epítopos Th. En particular, las SEQ ID NOs: 39 y 40 son análogos funcionales uno de otro dado que difieren solamente por la eliminación (SEQ ID NO: 39) o la inclusión (SEQ ID NO: 40) de cuatro aminoácidos en el extremo C terminal. Las diferencias entre estas dos secuencias análogas podría no afectar la función de los epítopos Th contenidos dentro de estas secuencias.

En otras variaciones, los péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV pueden presentarse como secuencia combinatoria, la cual contiene una mezcla de residuos de aminoácidos representados en posiciones específicas dentro del armazón peptídico con base en los residuos variables de homólogos para ese péptido particular. Un ensamble de péptidos combinatorios puede sintetizarse en un proceso al agregar una mezcla de los aminoácidos protegidos designados, en lugar de un aminoácido particular, en una posición especificada durante el proceso de síntesis. Tales ensambles combinatorios de péptidos Th endógenos de FMDV pueden permitir una amplia cobertura de epítopos Th para animales que tienen un antecedente genético diverso. Secuencias combinatorias representativas de péptidos Th endógenos de FMDV incluyen las SEQ ID NOs: 79-87, que se muestran en la Tabla 7. Estas secuencias combinatorias se derivan de las SEQ ID NOs: 34-63 (mostradas en la Tabla 4) para los epítopos Th endógenos de FMDV representativos.

En diversas modalidades, la inmunogenicidad de células T puede potenciarse al enlazar múltiples secuencias de epítopos Th endógenos de FMDV en conjunto en un solo péptido. Las secuencias de epítopos Th que se enlazan en conjunto pueden ser la misma secuencia de epítopo Th (para crear un péptido que tiene una secuencia de epítopo Th repetida), diferentes secuencias de epítopos Th (para crear un péptido que tiene una diversidad de secuencias de epítopos Th) o combinaciones de las mismas. Adicionalmente, las secuencias de epítopos Th pueden enlazarse en conjunto con un espaciador o sin un espaciador. En ciertas modalidades, un espaciador se utiliza para facilitar la escisión intracelular de un péptido que contiene múltiples epítopos Th de FMDV como secuencia única en la ubicación apropiada. En algunas modalidades, el espaciador contiene un aminoácido. En una modalidad preferida, el espaciador es lisina.

Los péptidos de epítopos Th de la presente invención proporcionan amplia reactividad e inmunogenicidad a animales de poblaciones genéticamente diversas de especies animales objetivo. Los péptidos encontrados como particularmente útiles en las formulaciones de la presente invención incluyen péptidos que contienen un grupo de múltiples epítopos Th de FMDV, tales como las SEQ ID NOs: 34-78, y péptidos que contienen una secuencia combinatoria de secuencias de epítopos Th, tales como las SEQ ID NOs: 79-87. En ciertas modalidades, los péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV además pueden potenciar la inmunogenicidad de células T al enlazar los epítopos Th a un Th artificial (UBITh®) (SEQ ID NO: 24) como se muestra en la Tabla 7 (SEQ ID NOs: 88 - 95). c. Espaciador Los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, incluyendo homólogos y análogos de los mismos, pueden enlazarse de manera covalente, con o sin un espaciador, a un péptido que contiene una secuencia conocida que contiene un epítopo Th. Los péptidos enlazados pueden ofrecer una inmunogenicidad potenciada sobre los inmunógenos equivalentes que no se enlazan de manera covalente a los péptidos de epítopos Th.

En algunas modalidades, un péptido que contiene un epítopo Th artificial se enlaza de manera covalente al extremo N terminal de un ¡nmunógeno peptídico sintético de FMDV. En algunas variaciones, se presenta un espaciador entre las dos secuencias. Preferiblemente, el espaciador es el único aminoácido sNLys. En una modalidad específica, el péptido de epítopo Th artificial de la SEQ ID NO: 24 se enlaza de manera covalente al extremo N terminal del inmunógeno peptídico sintético de FMDV de la SEQ ID NO: 2 a través de un espaciador sNLys (también mostrado en la Tabla 3 como SEQ ID NO: 25). Péptidos ejemplares adicionales, que contienen una secuencia de epítopo Th enlazada de manera covalente al extremo amino terminal de un ¡nmunógeno peptídico sintético de FMD, se muestran en la Tabla 3. En particular, el péptido de epítopo Th de la SEQ ID NO: 24 se enlaza al extremo amino terminal de diversos inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV a través de un espaciador -sNLys (SEQ ID NOs: 25 a 33). d. Composiciones La presente descripción también se dirige a composiciones que contienen péptidos sintéticos. Las composiciones pueden utilizarse para la detección, tratamiento y/o prevención de la FMD en un animal. En ciertas modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos que tienen epítopos de células B de FMDV se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos para FMDV en una muestra. En otras modalidades, las composiciones que contienen los péptidos sintéticos que tienen epítopos de células B de FMDV son composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir la infección por FMD en un animal. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica que contiene péptidos sintéticos que tienen epítopos de células B de FMDV se utiliza para suscitar una respuesta inmune a FMDV en un animal. La composición farmacéutica que contiene péptidos sintéticos que tienen epítopos de células B de FMDV pueden utilizarse como vacuna para FMDV.

Las composiciones farmacéuticas que contienen inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV suscitan eficientemente anticuerpos funcionales contra proteínas de FMD objetivo, para ofrecer a los animales protección contra el desafío con FMD. De hecho, los animales que reciben únicamente una sola administración de estas composiciones farmacéuticas se protegen suficiente y adecuadamente contra la infección por FMD. De esta manera, no se requieren múltiples administraciones o dosis de refuerzo para ofrecer a los animales una protección completa contra la infección por FMD. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas que contienen inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV califican como vacunas de emergencia de acuerdo con los lineamientos de la OIE.

Las composiciones de la presente descripción pueden contener uno o más inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV. Por ejemplo, las composiciones pueden contener inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV que tienen la secuencia de consenso (SEQ ID NOs: 1 o 2) mostrada en la Tabla 1 , y/u homólogos o análogos de la misma, como se muestra en la Tabla 2, y/o combinaciones de los mismos. Adicionalmente, los inmunógenos peptídicos de FMDV, utilizados en las composiciones, pueden enlazarse a un epítopo de célula T cooperadora combinatorio artificial para potenciar la inmunogenicidad de células B de las composiciones. En una modalidad preferida, los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV se enlazan a un epítopo de célula T cooperadora combinatorio artificial de la SEQ ID NO: 24. Inmunógenos peptídicos de VP1 de FMDV representativos, de diversos serotipos, se identifican en la Tabla 3.

Las composiciones que contienen inmunógenos peptídicos de FMDV también pueden contener uno o más péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir péptidos de epítopos Th derivados de las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B y 3D de FMDV. Los péptidos de epítopos Th encontrados como particularmente útiles en las composiciones incluyen los péptidos mostrados en las Tablas 4, 5, 6 y 7 (SEQ ID NOs: 34-95) y en las Tablas 18, 19, 25 y 26, descritos en los Ejemplos 9 y 10). Las composiciones farmacéuticas, incluyendo formulaciones de vacunas, pueden suscitar respuestas de anticuerpos específicas de FMDV y activar el inicio de la reacción de células T específicas de antígenos peptídicos que protegen a cerdos y bovinos contra la infección por FMDV con tan sólo una administración única.

Adicionalmente, las composiciones pueden contener portadores y/u otros aditivos en un sistema de suministro farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, una composición que contiene los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV puede formularse como formulación de vacuna farmacéutica al utilizar adyuvantes, portadores farmacéuticamente aceptables u otros ingredientes proporcionados de manera rutinaria en las formulaciones de vacunas. Entre los ingredientes que pueden utilizarse en esta invención están adyuvantes o emulsionantes, incluyendo alumbre, adyuvante incompleto de Freund, liposina, saponina, escualeno, L121, Emulsigen, monofosforilo lípido A (MPL), QS21 , ISA 35, ISA 206, ISA50V2 e ISA 720, así como los otros adyuvantes y emulsionantes eficaces. En una modalidad particular, el vehículo de suministro y adyuvante es Montanide™ ISA 50V2 (una composición adyuvante de vacuna oleosa comprendida de aceite vegetal y oleato de manida para la producción de emulsiones agua en aceite), Tween® 80 (también conocido como Polisorbato 80 o Polioxietileno (20) monooleato de sorbitán), un oligonucleótido CpG, y/o cualquier combinación de los mismos En otra modalidad, la composición farmacéutica es una emulsión agua en aceite en agua (es decir, ag/ac/ag) con Emulsigen o Emulsigen D como el adyuvante (como se describe en el Ejemplo 9, Tabla 19 para los grupos 27, 28, 31 y 32). También se proporcionan otros ingredientes incorporados de manera rutinaria con formulaciones de vacunas, e instrucciones para dosificación (Ejemplos 9 y 10) de tal modo que una respuesta inmune equilibrada de células B y T puede montarse con la única administración y ofrecer protección ante los desafíos virales.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación inmediata o para liberación sostenida.

Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden formularse para inducción de inmunidad sistémica o de mucosas localizada, a través del entrampado de ¡nmunógeno y coadministración con micropartículas. Tales sistemas de suministro se determinan fácilmente por un experto en la téenica.

Diversas formulaciones de vacunas que contienen los péptidos de la presente descripción son efectivas para proteger a animales ungulados contra FMDV. Por ejemplo, una composición farmacéutica que es útil como formulación de vacuna contra FMDV, contiene un ¡nmunógeno peptídico sintético de FMDV y un vehículo de suministro o adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, en donde el ¡nmunógeno peptídico sintético de FMDV tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a) SEQ ID NOs: 1-2; b) un homólogo de (a); c) un análogo antigénica e ¡nmunológicamente funcional de (a) o (b), d) (a), (b) o (c) con por lo menos una sustitución de aminoácido conservativa, adición de aminoácido, y/o eliminación de aminoácido; y e) cualquier combinación de (a)-(d).

En un formulación específica, el ¡nmunógeno peptídico sintético de FMD se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 7 y 8.

En otra formulación, la composición contiene un ¡nmunógeno peptídico sintético de FMDV enlazado a un péptido Th combinatorio artificial a través de un espaciador, y tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 25.

Otras formulaciones además contienen una proporción igual en peso de treinta péptidos de epítopos Th de FMDV de las SEQ ID NOs: 34 a 63 presentes en una cantidad entre aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 1 mg por dosis. En una formulación específica, la cantidad de la proporción igual en peso de las SEQ ID NOs: 34 a 63 se encuentra entre aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 pg por dosis.

Incluso en otra formulación, la composición comprende una mezcla de antígenos peptídicos sintéticos de FMDV de las SEQ ID NOs: 25, 27 y 28 y un depósito con igual proporción en peso de péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV de las SEQ ID NOs: 34 a 63, en un vehículo de suministro o adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, en donde la cantidad de antígeno peptídico se encuentra entre aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg por dosis. e. Administración Las composiciones farmacéuticas y formulaciones de vacunas pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, incluyendo subcutánea, oral, intramuscular u otras rutas parenterales o entérales. De manera similar, las vacunas pueden administrarse como una sola dosis o dosis múltiples. Los esquemas de inmunización se determinan fácilmente por el experto.

Las composiciones farmacéuticas se formulan para contener una cantidad efectiva de inmunógenos peptídicos sintéticos y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas también se formulan en una forma unitaria de dosificación adecuada que generalmente contiene de aproximadamente 0.5 pg a aproximadamente 1 mg del inmunógeno por kg de peso corporal. Cuando se suministran en dosis múltiples, las composiciones farmacéuticas pueden dividirse de manera conveniente en una cantidad apropiada por forma unitaria de dosificación. La dosificación administrada dependerá de la edad, peso y salud general del sujeto, como se reconoce en las artes de vacunación y terapéutica.

Las composiciones farmacéuticas que contienen inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, tales como formulaciones de vacunas, pueden producir una respuesta efectiva aún cuando se proporcionan en una sola administración. Una sola administración de estas composiciones farmacéuticas es suficiente para sensibilizar animales que tienen una población diversa de células T cooperadoras, incluyendo cerdos, bovinos, ovejas, cabras y otras especies silvestres susceptibles. En particular, las composiciones farmacéuticas que contienen los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, en combinación con péptidos de epítopos Th, pueden suscitar respuestas inmunes equilibradas de células B (anticuerpos neutralizantes) y células T (liberación de citocinas, etc.) para proteger a los animales de los desafíos virales subsecuentes.

Las inmunizaciones de una sola administración al utilizar formulaciones que contienen inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, en combinación con péptidos de epítopos Th, se evaluaron ampliamente de acuerdo con los lineamientos de OIE, Taiwán y PRC (discutido además en los Ejemplos 9 y 10). Los resultados que se obtuvieron a partir de estas pruebas demostraron, de manera repetida y reproducible, la eficacia de estas formulaciones en la protección de hospedadores inmunizados contra la infección por FMD. Por consiguiente, estas pruebas validaron el diseño de la formulación de FMDV, así como la capacidad para utilizar la formulación de FMDV como vacuna de emergencia contra FMDV en animales. f. Metodos para elaboración La presente descripción también se dirige a métodos para elaborar los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, péptidos de epítopos Th, composiciones y formulaciones farmacéuticas/vacunas para suscitar respuestas inmunes y proteger animales contra la infección por FMDV.

El uso de los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV proporciona una serie de ventajas significativas sobre las vacunas tradicionales de virus inactivado. Por ejemplo, las vacunas tradicionales de virus inactivado pueden requerir equipo costoso de contención biológica que plantea serios riesgos biológicos a los individuos que trabajan directamente en el laboratorio, así como al público en caso de que el equipo/protocolos de contención fallen. En contraste, no se utilizan materiales biopeligrosos en la elaboración de antígenos peptídicos, lo cual reduce drásticamente los riesgos de saludo y seguridad, y elimina la necesidad de equipo costoso de contención biológica. También, los inmunógenos específicos de sitio presentan altas concentraciones molares de epítopos seleccionados, lo cual ayuda a asegurar la seguridad y potencia inmunológica de la vacuna que emplea el péptido antigénico de FMDV.

Adicionalmente, el uso de péptidos sintéticos definidos, que tienen epítopos conocidos de células B y Th como inmunógenos, elimina respuestas inmunes indeseables no específicas de FMDV, ocasionadas por la presencia de materiales antigénicos que se originan de células hospedadoras infectadas con FMDV o virus recombinante, o de sistemas de expresión de proteínas recombinantes que pueden copurificarse con FMDV y/o proteínas recombinantes, cuando estos reactivos se utilizan como los ingredientes inmunogénicos de una vacuna. Por ejemplo, los sueros de cerdos pueden tener anticuerpos para las células hospedadoras, o para Escheríchia coli, levadura o baculovirus recombinante, los cuales pueden tener reactividad cruzada con los materiales antigénicos utilizados en pruebas de diagnóstico con base en los antígenos derivados biológicamente.

Tales respuestas inmunes, generadas por las vacunas que tienen estos inmunógenos extraños como ingredientes, no serán protectoras. En contraste, los cerdos o bovinos que reciben la vacuna peptídica sintética de FMDV, actualmente descrita, generarán respuestas inmunes enfocadas, desprovistas de anticuerpos perjudiciales u otras respuestas inmunes a proteínas que se originan de las células hospedadoras o vectores de expresión.

Adicionalmente, una inconsistencia o error que pueda introducirse durante la producción de virus inactivados, puede prevenir una respuesta inmune apropiada y/o deseada en un animal tratado. Sin embargo, las inconsistencias y/o errores que pueden introducirse durante la síntesis de largos inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV, en la mayor parte de los casos, no impiden o previenen una respuesta inmune deseada en un animal tratado. De hecho, las inconsistencias/errores que pueden introducirse durante la síntesis peptídica generan múltiples análogos de péptidos en conjunto con las síntesis de péptidos orientados. Estos análogos pueden incluir inserción, eliminación, sustitución de aminoácidos y terminación prematura. Como se describe anteriormente, tales análogos de péptidos son adecuados en las preparaciones de péptidos como contribuyentes a la antigenicidad e inmunogenicidad cuando se utilizan en aplicaciones inmunológicas, ya sea como antígeno en fase sólida para el propósito de inmunodiagnóstico o como inmunógenos para el propósito de vacunación.

Durante 25 años de experiencia en aplicaciones inmunológicas de péptidos sintéticos, el solicitante ha encontrado que el intervalo en la variabilidad estructural que hace posible la retención de una actividad inmunológica pretendida es mucho más flexible que el intervalo en variabilidad estructural permitido para la retención de una actividad farmacológica específica por un fármaco de molécula pequeña, o las actividades deseadas y toxicidades indeseables encontradas en las grandes moléculas que se coproducen con los fármacos derivados biológicamente. De esta manera, los análogos de péptidos, ya sea intencionalmente diseñados o inevitablemente producidos por errores del proceso sintético, como mezcla de subproductos de secuencias de eliminación que tienen propiedades cromatográficas e inmunológicas similares a las del péptido pretendido, son frecuentemente tan efectivos como una preparación purificada del péptido deseado. Los análogos diseñados y mezclas de análogos imprevistos son efectivos siempre y cuando se desarrolle un procedimiento QC de discernimiento para monitorear tanto el proceso de elaboración como el proceso de evaluación del producto con el fin de garantizar la reproducibilidad y eficacia de los productos finales empleando estos péptidos.

En vista de las ventajas descritas anteriormente, los péptidos descritos en la presente descripción pueden sintetizarse fácilmente al utilizar téenicas estándar, tales como el método de síntesis en fase sólida y el gran número de mejoras disponibles en ese proceso (Moore, V, 1992). Los péptidos también pueden elaborarse al utilizar tecnología de DNA recombinante, incluyendo moléculas de ácido nucleico, vectores y/o células hospedadoras. Como tales, las moléculas de ácido nucleico que codifican el péptido antigénico de grupos de epítopos de células B y células T de FMDV, y análogos inmunológicamente funcionales del péptido antigénico de grupos de epítopos de células B de FMDV, y complementos de los mismos, también se abarcan por la presente descripción como parte de la presente invención. De manera similar, los vectores, incluyendo vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico, así como células hospedadoras que contienen los vectores, también se abarcan por la presente descripción como parte de la presente invención.

Diversas modalidades ejemplares también abarcan métodos para producir los péptidos antigénicos de FMDV, y análogos inmunológicamente funcionales de los péptidos antigénicos de FMDV. Por ejemplo, los métodos pueden incluir una etapa de incubación de una célula hospedadora que contiene un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido antigénico de FMDV, y/o análogo inmunológicamente funcional del mismo, bajo condiciones tales donde el péptido y/o análogo se expresa.

Adiclonalmente, pueden producirse péptidos por síntesis en fase sólida. La calidad de los péptidos producidos por este proceso químico puede controlarse y definirse y, como resultado, la reproducibilidad de la antigenicidad, la inmunogenicidad y el rendimiento pueden asegurarse. q. Modalidades específicas Las modalidades específicas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: (1) Una composición de vacuna contra fiebre aftosa (FMD), que comprende a) un antígeno peptídico sintético de VP1 de FMDV; b) un péptido sintético de epítopo de célula T cooperadora de FMDV; y c) un vehículo de suministro o adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, en donde el antígeno peptídico de VP1 de FMDV en (a) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i) SEQ ID NOs: 1 o 2; ii) un homólogo de (a); y ¡ii) cualquier combinación de (a) o (b), y en donde el péptido sintético de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) no se enlaza de manera covalente al antígeno peptídico en (a). (2) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1 , en donde el antígeno peptídico en (a) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. (3) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1, en donde el antígeno peptídico en (a) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (4) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1, en donde el homólogo en (b) es un homólogo de la SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3 a 23. (5) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1, en donde el antígeno peptídico en (a) se enlaza de manera covalente en el extremo amino o carboxilo terminal a un péptido que comprende una secuencia de epítopo Th. (6) La vacuna contra FMD de acuerdo con 5, en donde la secuencia de epítopo Th es la SEQ ID NO: 24. (7) La vacuna contra FMD de acuerdo con 5, en donde el epítopo de célula T cooperadora se enlaza de manera covalente al antígeno peptídico a través de un espaciador que comprende un residuo de Usina épsilon. (8) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1 , en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 34 a 95 y combinaciones de las mismas. (9) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1, en donde la cantidad total de antígeno peptídico en (a) se encuentra entre aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg por dosis. (10) La vacuna contra FMD de acuerdo con 1, en donde el vehículo de suministro o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en Montanide ISA 50V, Polioxietileno (20) monooleato de sorbitán, Emulsigen, Emulsigen D y un oligonucleótido de CpG. (11) Una composición de vacuna contra fiebre aftosa (FMD), que comprende a) un antígeno peptídico sintético de VP1 de FMDV seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 25-33 y combinaciones de las mismas; b) un péptido sintético de epítopo de célula T cooperadora de FMDV seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 34-95; y c) un vehículo de suministro o adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario. (12) La vacuna contra FMD de 11 , en donde el antígeno peptídico en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29 y/o combinaciones de las mismas. (13) La vacuna contra FMD de 11 , en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 34-63, 90 y combinaciones de las mismas. (14) La vacuna contra FMD de 11 , en donde el antígeno peptídico en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29 y/o combinaciones de las mismas, y en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 34-63, 90 y combinaciones de las mismas. (15) Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 14 al animal. (16) El método de 15, en donde el animal es un cerdo. (17) Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 14 al animal. (18) El método de 17, en donde el animal es un cerdo. (19) La vacuna contra FMD de 11 , en donde el antígeno peptídico en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29, 31 y/o combinaciones de las mismas. (20) Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 19 al animal. (21 ) El método de 20, en donde el animal es una vaca. (22) Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 19 al animal. (23) El método de 22, en donde el animal es una vaca. (24) La vacuna contra FMD de 11, en donde el antígeno peptídico en (a) es las SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 y/o combinaciones de las mismas. (25) La vacuna contra FMD de 11 , en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 91-95 y combinaciones de las mismas. (26) La vacuna contra FMD de 11, en donde el antígeno peptídico en (a) es las SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 y/o combinaciones de las mismas, y en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 91-95 y combinaciones de las mismas. (27) Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 26 al animal. (28) El método de 27, en donde el animal es una vaca. (29) Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna en 26 al animal. (30) El método de 29, en donde el animal es una vaca.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no deben utilizarse para limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 SÍNTESIS DE PÉPTIDOS DE FMDV Se describen métodos para sintetizar péptidos de FMDV que se incluyeron en las composiciones farmacéuticas. Los péptidos pueden sintetizarse en cantidades a pequeña escala, lo cual es útil para estudios piloto de laboratorio y de campo, así como en cantidades a gran escala (kilogramo), lo cual es útil para la producción industrial/comercial de formulaciones de vacunas y de ensayo.

Se diseñó un gran repertorio de péptidos antigénicos de FMDV, que representan sitios de grupos de epítopos de células B y T de FMDV de las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B y 3D de FMDV que tienen secuencias con longitudes de aproximadamente 10 a 70 aminoácidos. Para algunos péptidos, se hizo una sustitución de aminoácido en un sitio adecuado para permitir la formación de un péptido cíclico para ejercer restricción para la conservación de estructura local, con el fin de maximizar la reacción cruzada con la proteína nativa correspondiente (por ejemplo, sustitución para un residuo de cisterna). Los péptidos antigénicos de FMDV representativos se identifican en la Tabla 2 (SEQ ID NOs: 1-23).

También se sintetizaron péptidos antigénicos enlazados a un péptido Th combinatorio artificial para potenciar las respectivas inmunogenicidades de cada péptido. Los péptidos antigénicos de FMDV representativos, enlazados al péptido Th combinatorio de la SEQ ID NO: 24 (UBITh®) se identifican en la Tabla 3 (SEQ ID NOs: 24-33) y Tablas 7 y 8 (SEQ ID NOs: 89-102).

Todos los péptidos utilizados para pruebas de inmunogenicidad se sintetizaron al utilizar el Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models 430A, 431 and 433, al utilizar química de Fmoc. Cada péptido se produjo por una síntesis independiente en un soporte de fase sólida, con protección por Fmoc en los grupos protectores de extremo N terminal y cadena lateral de los aminoácidos trifuncionales. Los péptidos completados se escindieron del soporte sólido y los grupos protectores de cadena lateral se removieron por ácido trifluoroacético al 90%. Las preparaciones de péptidos sintéticos se evaluaron por Espectrometría de Masas de Desorción por Láser Asistida por Matriz-Tiempo de Vuelo (MALDTOF) para asegurar el contenido correcto de aminoácidos. Los péptidos sintéticos también se evaluaron por HPLC de Fase Inversa para confirmar el perfil de síntesis y concentración de la preparación.

A pesar del riguroso control del proceso de síntesis (incluyendo monitoreo de la eficiencia de acoplamiento), también se produjeron análogos de péptidos debido a eventos involuntarios durante los ciclos de alargamiento, incluyendo inserción, eliminación, sustitución de aminoácidos y terminación prematura. De esta manera, las preparaciones sintetizadas típicamente incluyeron múltiples análogos de péptidos en conjunto con el péptido orientado. A pesar de la inclusión de tales análogos de péptidos involuntarios, las preparaciones peptídicas sintetizadas resultantes no obstante fueron adecuadas para utilizarse en aplicaciones inmunológicas, incluyendo inmunodiagnóstico (como antígenos de captura de anticuerpos) y vacunación (como inmunógenos peptídicos). Típicamente, tales análogos de péptidos, ya sea diseñados intencionalmente o generados a través de un proceso sintético como mezcla de subproductos, frecuentemente son tan efectivos como una preparación purificada del péptido deseado, siempre y cuando se desarrolle un procedimiento QC de discernimiento para monitorear tanto el proceso de elaboración como el proceso de evaluación del producto, para garantizar la reproducibilidad y eficacia del producto final empleando estos péptidos.

Todos los péptidos se sometieron a procesos de selección laboriosos y apremiantes, serológicos o de producción de IFN-g in vitro (incluyendo ciclos iterativos de síntesis peptídica, formulación de vacunas, inmunización de animales) y pruebas serológicas y de producción de IFN-g in vitro para producir péptidos candidatos para pruebas posteriores en animales objetivo para aplicaciones respectivas de diagnóstico y vacunación. Las formulaciones específicas utilizadas en diversos ejemplos se describen a continuación EJEMPLO 2 ENSAYOS Y REACTIVOS Los ensayos y reactivos para evaluar los péptidos sintéticos y formulaciones de la presente invención se desarrollan y describen a continuación. a. ELISA basados en péptidos VP1 (aa134-168) o VP1 (aa129-1681 de FMDV Los ensayos de ELISA para evaluar diversas muestras, descritos en los siguientes Ejemplos, se desarrollan y describen a continuación.

Los pozos de placas de 96 pozos se recubrieron individualmente por 1 hora a 37 °C con 100 ml de péptidos objetivo individuales, a 2 mg/ml (a menos que se indique de otra manera), en regulador de NaHCO3 10 mM, pH 9.5 (a menos que se indique de otra manera).

Los pozos recubiertos con péptido se incubaron con 250 pl de 3% en peso de gelatina en PBS a 37 °C durante 1 hora para bloquear sitios de unión inespecífica de proteínas, seguido por tres lavados con PBS que contenía 0.05% en volumen de TWEEN® 20 y se secaron. Los sueros a analizarse se diluyeron 1 :20 (a menos que se indique de otra manera) con PBS que contenía 20% en volumen de suero de cabra normal, 1% en peso de gelatina y 0.05% en volumen de TWEEN® 20. Cien microlitros (100 mI) de los especímenes diluidos se agregaron a cada uno de los pozos y se dejaron reaccionar por 60 minutos a 37 °C.

Luego los pozos se lavaron seis veces con 0.05% en volumen de TWEEN® 20 en PBS con el fin de remover anticuerpos sin unir. IgG de cabra anti-cerdo, conjugada con peroxidasa de rábano, se utilizó como trazador etiquetado para unirse con el complejo anticuerpo/antígeno peptídico formado en los pozos positivos. Cien microlitros de la IgG de cabra anti-cerdo conjugada con peroxidasa, a una dilución óptima pretitulada y en 1% en volumen de suero de cabra normal con 0.05% en volumen de TWEEN® 20 en PBS, se agregó a cada pozo y se incubó a 37 °C durante otros 30 minutos. Los pozos se lavaron seis veces con 0.05% en volumen de TWEEN® 20 en PBS para remover el anticuerpo sin unir, y se hicieron reaccionar con 100 pl de la mezcla de sustratos que contenía 0.04% en peso de 3’,3’,5’,5’-Tetrametilbencidina (TMB) y 0.12% en volumen de peróxido de hidrógeno en regulador de citrato de sodio durante otros 15 minutos. Esta mezcla de sustratos se utilizó para detectar la etiqueta de peroxidasa al formar un producto de color. Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 ml de H2SO4 1.0 M y la absorbancia se determinó a 450 nm (A450).

Se realizaron diluciones de sueros de acuerdo con el propósito para detectar anticuerpos contra FMDV en ios sueros de animales: (a) Para la identificación de la infección natural potencial, se utilizó una dilución de 1 :20, la lectura a A450 se registró, y se utilizó un control negativo intrínseco incorporado para el cálculo de la línea de corte; o (b) Para la determinación de títulos de anticuerpos de cerdos que recibieron formulaciones de vacunas contra FMDV basadas en péptidos, se probaron diluciones seriales en 10 veces de sueros de 1:10 a 1 :10,000 y el título de un suero probado, expresado como Log-i0, se calculó por análisis de regresión lineal de la A450 con la línea de corte A450 ajustada a 0.5. Se midió la detección de anticuerpos anti-FMDV específicos de isotipo (por ejemplo, IgG 1 , lgG2 e IgA) en los sueros, cuando fue necesario, al utilizar anticuerpos monoclonales específicos para estos isotipos suministrados por Serotec. Los títulos de anticuerpos se determinaron de manera similar a la que se describe anteriormente.

Los péptidos de grupos de epítopos de células B de VP1 de FMDV (SEQ ID NOs: 1-23), a 2 mg/ml, al utilizar 100 ml por pozo en 10 mi de regulador NaHCO3, pH 9.5, se utilizaron como los antígenos de recubrimiento en los ELISA de VP1 respectivos. b. ELISA basados en péptidos de proteína 3B no estructural Los ELISA para reactividad de anticuerpos séricos con proteína 3B no estructural (NS) de FMDV se realizaron como se reporta previamente (Wang, CY et al 2001) a una dilución de 1 :21. Los sueros de controles bovinos inmunizados con péptidos y negativos se incluyeron en cada prueba. Los resultados obtenidos se reportan en unidades OD después de la resta del valor OD de corte (generalmente 0.220 de OD).

Este ensayo de ELISA basado en péptidos de NS 3B de FMDV es capaz de diferenciar animales vacunados de animales infectados.

Específicamente, los animales vacunados e infectados pueden distinguirse con base en si los sueros obtenidos del animal reaccionan a las proteínas no estructurales de FMDV. En particular, los sueros obtenidos de animales inmunizados con formulaciones de vacunas de la presente descripción no reaccionan con las proteínas no estructurales de FMDV dado que las formulaciones de vacunas sólo contienen epítopos de la proteína estructural VP1. De esta manera, sólo las muestras séricas obtenidas de animales infectados reaccionan con las proteínas no estructurales de FMDV. c. Sistema de diagnóstico por diferenciación de animales infectados de vacunados (DIVA) El uso de los ELISA basados en péptidos de NS 3B de FMDV, en combinación con ELISA basados en péptidos de VP1 de FMDV específicos de serotipo, proporciona una herramienta valiosa y conveniente para (1) distinguir animales infectados de vacunados y (2) identificar el serotipo particular de FMDV con el que el animal está infectado o contra el que está vacunado. Por consiguiente, esta combinación de ensayos de ELISA proporciona una valoración conveniente y valiosa de la eficacia de vacunación contra FMDV en desafíos virales a través de medios serológicos. d. Evaluación de ¡nmunoqenicidad Los animales se inmunizaron de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos a continuación. Después de la administración de las formulaciones de vacunas, se obtuvieron muestras de sangre y se evaluó la inmunogenicidad.

Específicamente, muestras de animales inmunizados se obtuvieron a 0, 3 y 5 semanas postinmunización inicial (spii) para bovinos y a 0, 4 y 6 spii para cerdos. Las muestras se calentaron a 56 °C durante 30 minutos para inactivar los factores del complemento del suero. La ¡nmunogenicidad de las formulaciones que contenían los péptidos sintéticos se evaluó por ELISA basados en péptidos, al utilizar péptidos antigénicos de VP1 de FMDV correspondientes como el antígeno en fase sólida, como se describe anteriormente. Se probaron sueros de animales experimentales diluidos en serie y los títulos positivos se expresaron como Log10 de la dilución recíproca.

Las muestras seropositivas se combinaron por grupo y la actividad de neutralización se determinó para diversos aislamientos de FMDV, como se describe posteriormente. e. Virus FMDV Los animales se sometieron a estudios de desafío (discutidos en los Ejemplos a continuación) al utilizar diversas cepas de FMDV, incluyendo FMDV A12 y A24 del serotipo A; Oí, 02, O aiwan, 00zk, 0Myanmar, del serotipo O; cepa Asia 1XJ; etc. Las cepas de FMDV utilizadas en estos experimentos se hicieron crecer en monocapas de células renales de hámster sirio (BHK), y se purificaron bajo contención en el Centro para Enfermedades Animales de Plum Island, USDA (Greenport, NY) y/o Instituto Nacional de Salud Animal, Taiwán (NIAHT). El virus también se obtuvo para uso industrial del laboratorio de referencia del Ministerio de Agricultura de PRC, Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou de la Academia China de Ciencias Agrícolas, esencialmente como se describe previamente (Brown 1963), con un tratamiento del comprimido por SDS al 1% o Nonidet P-40 al 1% antes de la centrifugación a través de un gradiente de sacarosa de 15-45%.

Picos de virus purificado se identificaron y se aislaron al bombear los contenidos de cada tubo de centrífuga a través de la celda de flujo de un espectrofotómetro ajustado a 260 nm. f. Evaluación serolóqica de actividad de neutralización de FMDV como índice de neutralización Las muestras séricas se procesaron a partir de la sangre obtenida de los animales y se conservaron a -20 °C hasta probarse. La enumeración de los virus neutralizados por una dilución 1 :100 de las muestras séricas se consiguió por determinaciones de neutralización en una serie de cargas virales crecientes de entrada, al utilizar alícuotas (10,000 MPD50) de los diversos serotipos preparados como se describe anteriormente.

Las muestras séricas se evaluaron al utilizar los métodos descritos previamente (Morgan 1990). Las muestras que mostraron una reducción de 2.5 Log-io de microplacas de FMDV a dilución 1:100 se consideraron altamente predictivas de inmunidad protectora contra la infección por FMDV. q. Ensayo de anticuerpos neutralizantes específicos de FMDV: Una prueba de neutralización beta estándar Una prueba de neutralización beta estándar se realizó en placas de 96 pozos al incubar diluciones dos veces en serie de cada suero con 100 o 200 TCID50 (50% de Dosis Infecciosa en Cultivo de Tejidos) de FMDV por 30 min a 37 °C. La actividad viral restante se determinó en placas de 96 pozos que contenían monocapas recientes de células BHK-21. Los títulos de neutralización sérica se determinaron como la dilución de suero log10 que neutraliza 50% del inoculo viral.

Por ejemplo, el ensayo cuantitativo para anticuerpos que neutralizan FMDV Oí Taiwan se realizó contra células BHK-21 en placas de microtitulación de fondo plano al utilizar volúmenes iguales de 200 mI. Cincuenta microlitros (50 pl) de suero diluido pre y postinmunización se recolectaron de los animales experimentales individuales. Estos sueros se mezclaron por separado con una alícuota de 50 mI que contenía 200 TCID50 de FMDV 01 Taiwan y se incubaron por una hora a 37 °C. Cien microlitros (100 mI) de medio de cultivo (MEM (Gibco) complementado con 10.0% de suero bovino fetal) que contenía 2.5 x 105 células BHK-21 se agregaron luego a cada ensayo. Los cultivos se examinaron microscópicamente después de 48 horas en cuanto a su efecto citopático (CE). Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución final de suero que da 50% de inhibición del CE inducido por 200 TCID50 de virus. h. Animales utilizados en los estudios de inmunoqenicidad Cobayos: Los estudios de inmunogenicidad se condujeron en Cobayos Duncan-Hartlcy maduros, sin contacto previo, adultos machos y hembras (300-350 g/Peso Corporal). En los experimentos se utilizaron 3 cobayos por grupo.

Lechones de aproximadamente 4 a 12 semanas de edad, de una granja libre de patógenos específicos (SPF), se marcaron en oreja para estudios de inmunogenicidad y se dividieron en grupos que contenían 3 a 5 lechones/grupo, de acuerdo con el protocolo de estudio.

Bovinos: Se condujeron estudios de inmunogenicidad en novillos sanos de entre 2 y 6 meses de edad, que se obtuvieron de proveedores locales, y se dividieron en grupos que contenían 3 a 5 bovinos/grupo, de acuerdo con el protocolo de estudio. Los animales utilizados en un estudio de desafío viral se alojaron en una instalación de contención pecuaria de bioseguridad nivel 3 y se dejaron aclimatar por 1 semana antes del inicio del estudio.

Cabras: Se condujeron estudios de inmunogenicidad en cabras sanas obtenidas de proveedores locales.

Antes de la inmunización, muestras séricas de animales individuales se probaron en cuanto a la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos de FMDV para confirmar que los animales no se habían vacunado o infectado previamente con FMDV. Los sueros de estos animales también se evaluaron al utilizar los ensayos de ELISA para NS 3B y VP1 de FMDV descritos anteriormente, para asegurar además que los animales estaban libres de anticuerpos para estas proteínas también.

Cada animal se inmunizó con 25 a 300 mg por dosis de la vacuna, dependiendo de la especie y protocolo. i. Composiciones Las composiciones farmacéuticas y formulaciones de vacunas utilizadas en cada experimento se describen con mayor detalle en los Ejemplos descritos a continuación. Brevemente, las formulaciones especificadas en cada uno de los grupos de estudio generalmente contenían: (1) un solo inmunógeno peptídico de grupos de epítopos de células B de VP1 seleccionados de las SEQ ID NOs: 1-23, 25-32; (2) una mezcla de inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos de células B de VP1 , incluyendo homólogos seleccionados de las SEQ ID NOs: 1-23 y 25-32; o (3) una mezcla de inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos de células B de VP1 seleccionados de las SEQ ID NOs: 1-23 y 25-32 complementada con una mezcla de péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV seleccionados de las SEQ ID NOs: 33-92. Los péptidos se emulsionaron en una formulación adyuvante específica. Las vacunas usualmente se prepararon al disolver los inmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV en agua a aproximadamente 25 a 300 mg/ml y se formularon con Seppic Montanide ISA 50V2 en emulsiones agua en aceite (ag/ac) (1:1 en volumen).

Las formulaciones de vacunas se mantuvieron a temperatura ambiente por aproximadamente 30 min y se agitaron por vórtice durante aproximadamente 10 a 15 segundos antes de la inmunización.

Algunos animales se inmunizaron con 2 dosis de una formulación de vacuna específica, que se administró en el tiempo 0 (sensibilización) y 3 spii (refuerzo) de manera intramuscular (IMO). Estos animales inmunizados entonces se probaron para evaluar la inmunogenicidad de los inmunógenos de epítopos sintéticos de FMDV presentes en la formulación de vacuna. Los animales restantes se inmunizaron con una sola dosis de una formulación de vacuna específica para valorar si los péptidos utilizados en la formulación eran capaces de montar, de manera eficiente, una respuesta de anticuerpos neutralizantes apreciable para calificarse como vacuna de emergencia para FMDV.

EJEMPLO 3 ENSAYOS FUNCIONALES DE CÉLULAS T PARA LA SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS DE GRUPOS DE EPÍTOPOS TH ENDÓGENOS DE FMDV Los procedimientos para los experimentos funcionales en células T se describen con detalle de la siguiente manera. a. Aislamiento, congelación v descongelación de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMCs) Se recolectó sangre con heparina, y se aislaron PBMC por centrifugación en gradientes de densidad al utilizar Ficoll-Hypaque. Después de dos lavados en solución salina regulada de fosfatos (PBS), las PBMC se resuspendieron en medio de cultivo celular consistente en RPMI 1640 complementado con 10% de FCS. Para algunos experimentos, las PBMC aisladas se congelaron, se almacenaron en N2 líquido y se descongelaron para su subsecuente cultivo in vitro. b. Cuantificación de IFN-v serico Un ELISA emparedado se utilizó para cuantificar el IFN-g en muestras séricas recolectadas de cerdos o bovinos. El IFN-g se cuantificó antes de la vacunación y en el día 21 o 28, antes de que los animales se desafiaran con FMDV. El ensayo se llevó a cabo al recubrir primero pozos individuales de las placas de Maxisorb ELISA (Nunc) con el anticuerpo de captura (adquirido de PBL Biomedical Laboratories, EUA) a 05 mg por pozo. Los sitios no ocupados por los anticuerpos inmovilizados se bloquearon al agregar 200 ml de regulador de bloqueo de ELISA en cada pozo de ensayo. Después de lavar las placas 4 veces cada vez con 200 pl de PBS que contenía 0.025% de Tween 20 (PBS-T20), las muestras séricas diluidas individualmente en regulador de dilución de ELISA (a 1 en 10, 25 y 75) se agregaron a los pozos de ensayo. Las placas se incubaron por 1 h a 37 °C para permitir la unión de la citocina al anticuerpo de captura de anti-IFN-g en fase sólida. Las placas entonces se lavaron 4 veces con PBS, y el anticuerpo de detección anti-IFN-g se agregó a los pozos de ensayo a 0.25 pg por pozo.

Después de la incubación por 1 h a 37 °C, las placas se lavaron y se agregaron 100 pl de conjugado de proteína A a cada pozo de prueba. El conjugado en exceso se lavó (6 veces con PBS) después del período de Incubación de 1 h, y 100 ml de la solución de sustrato recomendada entonces se agregaron para la detección de la reacción. El desarrollo de color en el pozo de ensayo individual se detuvo 30 min después al agregarle 50 pl de H2SO4 1 N, y la intensidad de color se registró al medir la absorbancia a 450 nm. Los resultados se calcularon primero al comparar los valores medidos de A450 obtenidos de un suero individual contra una gráfica de calibración que se construyó al someter a ensayo diluciones de un IFN-g recombinante estándar (PBL Biomedical Laboratories, EUA) bajo las mismas condiciones de prueba. La respuesta de IFN-g en el suero de cada animal a 28 días postvacunación se representó al restar el valor medido para el animal antes de la inmunización. Los resultados finales se expresaron como mg/ml de suero. c. Ensayo de IFN-v producido por PBMC Las PBMC de animales vacunados se cultivaron a 2.5 x 106 células/ml en pozos individuales de una placa de cultivo de 24 pozos (Nunc) en presencia de 10.0 mg de la composición inmunogénica de vacuna seleccionada. Cultivos de control negativo que contenían PBMC solas sin antígeno de estímulo también se incluyeron. Todos los cultivos se mantuvieron a 37 °C durante 3 días en una incubadora con 5.0% de CO2. Los sobrenadantes se recolectaron 3 días después del inicio del cultivo, y el contenido de IFN-g se midió al utilizar el ensayo cuantitativo descrito anteriormente.

EJEMPLO 4 PROCEDIMIENTOS DE DESAFÍO CON FMDV EN ANIMALES PORCINOS Y BOVINOS El procedimiento de desafío, en general, se basó en el protocolo descrito en el capítulo de fiebre aftosa del Manual de Estándares de la OIE. Las cepas de FMDV utilizadas en los procedimientos de desafío incluyeron: 0-1 jaiwan(99), 0-1 Myanmar(02), 0-1 Ozk(Ch¡na, 93)> 0-1 Campos )/ Asía 1 (XJ or Jiansu, China, 05)· El procedimiento para estudios de desafío porcino conducidos en China se modificó al administrar el virus FMDV a través de la ruta intramuscular, de acuerdo con los lineamientos del Ministerio de Agricultura. a. Cerdos La dosis infecciosa de protección estandarizada (PD50) (es decir, la dosificación cuando 50% de los animales probados se protegieron) se midió en los animales. La PD50 en cerdos se determinó al utilizar 15 cerdos con pesos de alrededor de 40 kg (divididos en forma aleatoria en tres grupos, cada uno con 5 cerdos) en las pruebas de potencia. A los tres grupos se les administró 1 dosis, 1/3 de dosis y 1/9 de dosis de las formulaciones de vacunas de prueba, respectivamente. También se utilizaron modificaciones a la dosificación para la valoración de la potencia de una formulación particular, tales como dosificaciones que contenían 2X, 1 X, 0.5X y 0.25X de dosis. Además, una rápida selección de formulaciones al utilizar una dosis 1X también se utilizó frecuentemente.

Para la valoración de la eficacia de formulaciones de vacuna, los cerdos se dividieron en grupos que contenían 3 cerdos (en lugar de 5) por grupo, dependiendo del diseño experimental y disponibilidad de los animales en el momento para el estudio particular. Cada cerdo en estos tres grupos se inoculó detrás de las orejas con vacuna mediante la ruta intramuscular (IM). 28 días después de una sola vacunación, 15 cerdos vacunados, en conjunto con 2 cerdos control, se desafiaron cada uno al inocular a los animales con 1 ,000 ID50 de virus virulento de cepa tipo O de FMD porcino, como se indica.

En un experimento ideal, deben encontrarse lesiones vesiculares por lo menos en una pezuña de los cerdos control después de 10 días de monitoreo. Además, no deben observarse síntomas o signos de FMD en cerdos vacunados, de otra manera, la protección de la vacuna ha fallado. La PD50 del producto de vacunación se calculó al utilizar el Método Reed-Muench, con base en los resultados de las pruebas de desafío. Las dosis objetivo de la vacuna deben contener mínimamente 3 PD50 para pasar la prueba de liberación de calidad.

En Taiwán, el desafío viral se condujo a través de la inoculación con 1 x 105 TCID50, titulada previamente en cultivo de tejidos, de virus FMDV Oí Taiwan (aproximadamente por lo menos 10 veces superior a la cantidad de virus administrados de acuerdo con los lineamientos de PRC) en los bulbos del talón de las extremidades posteriores de los cerdos en el interior de la instalación P3 en el Instituto Nacional de Saludo Animal, Tamsui, Taiwán, conforme a los lineamientos del Consejo de Agricultura. Los animales experimentales se monitorearon en sus signos clínicos de FMD durante un período de observación de 14 días. Estas observaciones incluyeron (1) registro diario de temperatura corporal, (2) monitoreo de cualquier desarrollo de renguera en los animales, y (3) monitoreo de cualquier lesión vesicular adquirida en las bandas coronarias de las patas y hocicos de los animales. La PD50 del producto de vacunación se calculó al utilizar el Método Reed-Muench, con base en los resultados de las pruebas de desafío. Las dosis objetivo de la vacuna deben contener mínimamente 3 PD5o para permitir la liberación de la vacuna. b. Bovinos En los bovinos, el desafío viral se introdujo por inoculación ¡ntradermolingual (IDL) de 1 mi (100 ml en cada uno de los 10 sitios en la lengua) del macerado, titulado y ajustado para contener un total de 1 x 104 TCID50 de FMDV (Unidad Infecciosa Bovina o BIU). Los animales se examinaron diariamente monitoreando temperaturas rectales, y una puntuación de protección con base en el tiempo de aparición y se determinó el número y severidad de las lesiones.

La protección total se definió como ausencia completa de lesiones (puntuación 0) y los valores de puntuación por debajo de 8 se consideraron como protección parcial. La puntuación clínica se calculó de la siguiente manera i) una temperatura corporal elevada de 40 °C (puntuación de 1), > 40.5 (puntuación de 2) o > 41 (puntuación 3); ¡I) apetito reducido (1 punto) o sin ingestión de alimentos y alimento sobrante desde el día anterior (2 puntos); iii) renguera (1 punto) o renuencia a incorporarse (2 puntos); iv) presencia de calor y dolor después de la palpación de las bandas coronarias (1 punto) o sin apoyarse en la pata afectada (2 puntos); v) vesículas en las patas, dependientes del número de patas afectadas, con un máximo de 4 puntos; y vi) lesiones bucales visibles en la lengua (1 puntos), encías o labios (1 punto) u hocico (1 punto), con un máximo de 3 puntos.

Todos los experimentos con animales vivos se realizaron bajo los lineamientos del Manual de Estándares de la OIE, Ministerio de Agricultura, PRC o Consejo de Agricultura, Taiwán. También se utilizaron modificaciones a la dosificación para la valoración de la potencia de una formulación particular, tales como dosificaciones que contenían 2X, 1 X, 0.5X y 0.25X de dosis. También, una rápida selección de formulaciones al utilizar una dosis 1X también se utilizó frecuentemente.

EJEMPLO 5 ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS SECUENCIAS GENÓMICAS COMPLETAS DE AISLAMIENTOS DE FMDV AL UTILIZAR LA SECUENCIA DEL AISLAMIENTO OJAIWAN 99 DE FMDV COMO LA ESTRUCTURA DE ARMAZÓN DE AMINOÁCIDOS, Y LA UBICACIÓN DE LOS EPÍTOPOS TH B Y ENDÓGENOS DE FMDV PARA DISEÑO DE INMUNÓGENOS PEPTÍDICOS Después de una revisión exhaustiva de la organización genómica de FMDV, la secuencia de aminoácidos de poliproteínas de FMDV serotipo OTa¡wan99 se empleó como la base para la identificación y diseño de péptidos antigénicos de FMDV. Tales péptidos, una vez con el armazón establecido, pueden ajustarse para representar secuencias para múltiples serotipos para aplicaciones regionales. El alineamiento de la secuencia de FMDV 0Ta¡wan 99 con las secuencias genómicas completas de 103 aislamientos de FMDV que representan los siete serotipos, con acceso a través de los números de entradas del GenBank correspondientes, como se describe previamente (Carrillo 2005), identificó regiones de proteínas de FMDV altamente conservadas, lo que indica restricciones funcionales para la variabilidad, así como novedosos motivos virales con relevancia biológica potencial.

Específicamente, las secuencias alrededor del sitio de unión de receptores “RGD” de proteína VP1 de FMDV y sus secuencias de consenso relacionadas con serotipos (es decir, el aminoácido que aparece más frecuentemente para cada posición con base en la comparación de secuencias de aislamientos de FMDV de un serotipo específico que se diseña) fueron el anteproyecto para el diseño de inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos de células B, mientras que las regiones de proteínas de FMDV altamente conservadas fueron los sitios objetivo para el diseño de los inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV. Después de seleccionar por ensayos serológicos y celulares con los procedimientos descritos con detalle en el Ejemplo 3, una serie de péptidos de grupos de epítopos referenciados de células B y T cooperadoras (SEQ ID NOs.: 1 a 102) se identificaron para su aplicación en formulaciones de vacunas contra FMDV que representan diferentes cepas y serotipos, como se muestra en la Figura 1 y Tablas 1 a 8.

EJEMPLO 6 ANÁLISIS DE INMUNÓGENOS PEPTÍDICOS DE GRUPOS DE EPÍTOPOS DE CÉLULAS B DE FMDV COMO COMPONENTES CLAVE PARA VACUNAS BASADAS EN PÉPTIDOS DE FMDV a. Historial de diseño Cada vacuna o producto inmunoterapéutico requiere su propio enfoque y estrategia de diseño con base en el mecanismo específico de enfermedad y la o las proteínas objetivo requeridas para la intervención. Los objetivos en que los diseños se modelan después pueden incluir proteínas celulares implicadas en una ruta patogénica o un agente infeccioso en el cual pueden implicarse varias proteínas.

El conocimiento previo en la identificación y distribución de epítopos de células B y T también es propicio para el proceso de diseño molecular. Un extenso proceso de validación serológica se requiere una vez que se selecciona la o las moléculas objetivo. De manera subsecuente, se conducen estudios pilotos consecutivos de inmunogenicidad en pequeños animales para evaluar las propiedades funcionales de los anticuerpos suscitados por las formulaciones de vacunas de los péptidos de diseño. Tal aplicación serológica entonces se lleva a cabo en animales de la especie objetivo para la validación posterior de la inmunogenicidad de vacuna y propiedades funcionales de los anticuerpos suscitados. Todos los estudios se conducen en grupos paralelos múltiples con sueros recolectados de los hospedadores inmunizados para su evaluación. Estudios de desafío previos en la especie objetivo también se llevan a cabo para validar además la dirección del diseño.

Los péptidos objetivo luego se preparan en mezclas diversas para evaluar sutiles diferencias en la propiedad funcional, en relación con las interacciones respectivas entre construcciones peptídicas, cuando se utilizan en combinaciones para preparar los diseños de formulaciones respectivas. Después de evaluaciones adicionales, se establecen las construcciones peptídicas finales, composiciones peptídicas y formulaciones de las mismas, en conjunto con los respectivos parámetros físicos de las formulaciones, lo que conduce al proceso de desarrollo de productos finales.

Una extensa experiencia en diseño hace posible el desarrollo de los productos de vacunación de siguiente generación, del descubrimiento a la comercialización, como se muestra en la Figura 2, a un ritmo acelerado.

Durante el desarrollo de los péptidos y composiciones de FMDV específicos, se consideraron los siguientes objetivos de desarrollo 1) identificar un sitio objetivo de dominio en bucle de VP1, suficiente para suscitar anticuerpos ampliamente neutralizantes, 2) diseñar el sitio objetivo peptídico para una presentación óptima al sistema inmune, 3) seleccionar sitios UBITh® para potencia inmunológica en las especies objetivo porcina y rumiante, 4) incorporar estos componentes esenciales en un diseño de ¡nmunógeno peptídico que puede producirse de manera rentable, y 5) desarrollar formulaciones de vacunas, un tamaño de dosis y protocolo de inmunización para una inmunidad protectora. La finalidad general de analizar y evaluar inmunógenos peptídicos de FMDV requería de una investigación empírica intensiva de la base de datos de secuencias de FMDV y modelos moleculares, seguida por la síntesis de un gran número de inmunógenos candidatos para formulaciones de vacunas para inmunizar animales. Un total de 831 cerdos y 860 bovinos se utilizaron en estudios de ¡nmunogenicidad y de títulos de anticuerpos neutralizantes para encontrar composiciones y formulaciones capaces de proteger efectivamente animales porcinos y bovinos ante el desafío viral después de únicamente una sola administración. En total, 25 estudios en cerdos y 32 estudios en bovinos, además de estudios previos en cobayos y cabras, estuvieron implicados en el desarrollo de esta invención. b. Identificación de objetivos de dominios en bucle de VP1 más potentes El elemento crítico para una vacuna peptídica efectiva para FMDV es la selección de una secuencia precisa a partir del dominio en bucle G-H de VP1 que es óptima para la presentación de epítopos de células B que suscitan la producción de anticuerpos neutralizantes. El armazón para la presentación óptima de un dominio por un ¡nmunógeno peptídico puede afectarse por un cambio tan pequeño como una sola posición de aminoácido. El modelo molecular disponible para la estructura de conformación de la proteína de cápside VP1 se examinó, y las comparaciones de secuencias dentro de esta región hipervariable se evaluaron en la determinación de que los inmunógenos sintéticos con buenas reactividades cruzadas para VP1 deben incluir un segmento extendido del dominio en bucle.

Los inmunógenos peptídicos que tienen sitios objetivo de VP1 se produjeron cubriendo aa134-159 o aa134-169 con base en la secuencia de FMDV A12 del serotipo A, como se muestra en la Tabla 8. La ¡nmunogenicidad de los péptidos se determinó en composiciones que contenían los péptidos solos, o en composiciones que también incluyeron epítopos Th endógenos de FMDV o epítopos Th extrínsecos para las células T cooperadoras complementarias. Los ensayos de ¡nmunogenicidad también se condujeron en péptidos que no tuvieron ni tienen restricciones cíclicas para estabilizar la estructura de bucle. La cielización de péptidos se facilitó al sustituir residuos de aminoácidos en posiciones específicas con residuos de cisterna para crear un enlace disulfuro (por ejemplo, posiciones de VP1 134(N->C) y 158(Q->C)).

Las composiciones que contenían diversos péptidos se evaluaron en cuanto a su potencia inmunológica en cobayos. La Tabla 9 proporciona los resultados experimentales obtenidos a partir de una evaluación de diversos péptidos. La Tabla 9 muestra: i. Las construcciones peptídicas más largas proporcionaron mejores respuestas neutralizantes. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 97 proporcionó mejores respuestas neutralizantes en comparación con la SEQ ID NO: 96. Adicionalmente, también se comprobó que extensiones adicionales de los sitios objetivo al residuo 129 (SEQ ID NO: 99) son de valor para ciertas aplicaciones. ii. Los péptidos cielados proporcionaron actividades superiores de neutralización en comparación con péptidos que no contenían esta estructura. Por ejemplo, el péptido cíclico de la SEQ ID NO: 98 proporcionó actividades superiores de neutralización en comparación con la SEQ ID NO: 97. iii. El Th extrínseco proporcionado por un sitio Th, a partir de un epítopo Th artificial UBITh® (SEQ ID NO: 24) enlazado al dominio de VP1 de FMDV, elevó la eficacia de neutralización sobre aquellas construcciones que no contienen este epítopo. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 100 proporcionó una mejor actividad de neutralización en comparación con las SEQ ID NOs: 99, 98, 97 y 96. iv. La ¡nmunogenicidad se potenció además por la adición de epítopos Th extrínsecos en las composiciones.

En vista de estos resultados, un péptido cíclico que contenía el sitio objetivo VP1 extendido de los aminoácidos 129 a 169 se determinó como el más inmunopotente (por ejemplo, SEQ ID NO: 99). c. Diseño de sitios objetivo de VP1 específicos de serotipos La base de datos de secuencias de FMDV para FMDV global, proporcionada por el laboratorio de referencia mundial en Pirbright, RU, se analizó para obtener los dominios en bucle de VP1 variables (aminoácidos 129-169) para subtipos de los serotipos O, A, Asia, C y otros. Los aminoácidos de consenso para cada posición entonces se diseñaron como se muestra en la Tabla 2. Secuencias objetivo de bibliotecas combinatorias, como se muestra en la Tabla 8 (SEQ ID NOs: 101 y 102), que tienen múltiples aminoácidos en una sola posición, también se elaboraron para abarcar incluso más ampliamente la variabilidad antigénica del dominio en bucle de VP1.

Una comparación de la prueba clínica de inmunogenicidad al utilizar una sola secuencia de consenso (Tabla 11 , SEQ ID NO: 25) con la prueba clínica de inmunogenicidad al utilizar los objetivos de bibliotecas combinatorias (Tabla 10, SEQ ID NO: 98 y 99) muestra que la secuencia de consenso proporcionó una eficacia equivalente sobre la amplitud de la cobertura de serotipos, tal como se evalúa por títulos de ELISA basados en VP1 para inmunogenicidad y por índices de neutralización para cepas de FMDV de los serotipos respectivos para estas dos estrategias (Tablas 10 y 11). Por consiguiente, para hacer más fácil la elaboración y QC, la única secuencia de consenso cieló los sitios VP1 objetivo y algunas secuencias de VP1 específicas elegidas de serotipos específicos con base en necesidades regionales, se seleccionaron como se muestra en las SEQ ID NOs: 2-23 y 25-33. d. Selección de un potente epítopo Th para potenciar la inmunoqenicidad de VP1 Investigadores anteriores identificaron sitios Th dentro de antígenos de FMDV, tal como el epítopo VP1 21-40, y los incorporaron en su diseño de ¡nmunógenos sintéticos de VP1. Sin embargo, los estudios de inmunogenicidad en cerdos y bovinos han mostrado que estos sitios Th endógenos de FMDV no son completamente efectivos para potenciar la inmunogenicidad de VP1 en las especies objetivo debido a su limitada promiscuidad y restricción genética. Por consiguiente, el epítopo Th de FMDV parcialmente efectivo no se utilizó, sino se reemplazó con el epítopo Th artificial UBITh® más potente para potenciar el inmunógeno peptídico en bucle de VP1 de FMDV. Los sitios artificiales UBITh® incorporan motivos Th, incluyendo posiciones Th de bibliotecas combinatorias, que se diseñaron para dar cabida a la capacidad de respuesta variable de células T de poblaciones genéticamente diversas. Este cambio en los epítopos Th resultó en la pérdida de una respuesta de memoria anti-FMDV homologa potencial (en caso de exposición), pero proporcionó una capacidad de respuesta inmune más amplia y potente. La secuencia artificial UBITh® (SEQ ID NO: 24) ha probado potencia inmunológica en múltiples especies, incluyendo cerdos.

Las construcciones utilizadas en el experimento resumido por la Tabla 10 incluyeron el sitio artificial UBITh® (SEQ ID NO: 24), lisina épsilon como el espaciador, y sitios objetivo VP1 cíclicos de las posiciones de aminoácidos 134 a 169 para el serotipo O o serotipo Asia, diseñadas como bibliotecas combinatorias (SEQ ID NOs: 101 y 102). Ambas construcciones fueron inmunogénicas, como se muestra por las respuestas de anticuerpos y neutralización (expresadas como índice de neutralización) de cobayos inmunizados.

La Tabla 11 muestra la capacidad de respuesta de cobayos a un inmunógeno de serotipo O similar que tiene el sitio UBITh® (SEQ ID NO: 24) enlazado, a través de un espaciador de lisina épsilon, a un sitio objetivo de VP1 cíclico de las posiciones de aminoácidos 129 a 169 con una secuencia de consenso de O (SEQ ID NO: 25). Esta construcción de VP1 , que contenía la secuencia de consenso de O, también mostró una fuerte inmunogenicidad, tal como se demuestra por la potente y amplia respuesta de anticuerpos neutralizantes ya a las 3 semanas postinmunización inicial (Tabla 11). e. Amplitud inesperada de la respuesta neutralizante Los sueros inmunes de cobayos, analizados para actividades neutralizantes en las Tablas 10 y 11 , mostraron neutralizaciones inesperadamente amplias. Específicamente, los inmunógenos de serotipo O de las SEQ ID NOs: 101 y 25 suscitaron anticuerpos neutralizantes contra dos subtipos O, y también posibilitaron la neutralización de subtipos de los serotipos A y Asia. Estos resultados sugieren un potencial de los inmunógenos de FMDV UBITh® para una eficacia amplia contra múltiples serotipos por inmunógenos individuales.

Tal amplitud en las neutralizaciones de serotipos también puede proporcionarse al combinar varios inmunógenos, como se muestra en la Tabla 12 (vacuna UBI FMDV O que contenía una mezcla de tres péptidos de SEQ ID NOs: 25, 27 y 28), en una sola vacuna cuando los sueros de cerdos inmunizados y desafiados demostraron amplitud en índices de neutralización COntra OTaiwan, OManisai Ocampos Y OlVIyanmar· f. Pruebas clínicas de inmunización/desafío en cerdos En tres pruebas clínicas separadas de inmunización/desafío en cerdos, la especie objetivo, se comprobó que la primera vacuna peptídica sintética de Untied Biomedical, Inc. (UBI) para FMDV, la vacuna UBITh® FMDV-O, era protectora contra el desafío infeccioso con FMDV cepa 01ia¡wan· Las pruebas clínicas se hicieron en 3 instituciones separadas, incluyendo el Instituto Nacional de Salud Animal de Taiwán (NIAHT) y el Centro de Enfermedades Animales de Plum Island USDA (PIADC).

Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 13. A los grupos 1-4 se les administraron 2 dosis de vacuna UBITh® FMDV-Oconsensus (SEQ ID NO: 25, péptido 2570). Las dosis variaron de 25, 50, 100 a 300 mg (grupos 1 a 4). Los grupos 5-7 fueron controles de placebo.

Todos los cerdos se desafiaron por inyección en un bulbo de talón con 104·5 TCID5o de FMDV 01ia¡wan (el virus se hizo crecer en células renales de hámster sirio o en cerdos). Los cerdos se desafiaron a intervalos de 2 a 10 semanas después de sus últimas inmunizaciones. Todos los cerdos inmunizados se protegieron, incluyendo los cerdos inmunizados con 15 UBITh®. La inmunidad protectora persistió en los cerdos inmunizados con UBITh®, hasta la semana 10. También se obtuvo evidencia de inmunidad protectora hasta 20 semanas después de la última inmunización, como se muestra por el título de anticuerpos neutralizantes en cerdos experimentalmente inmunizados pero sin desafiar.

Los animales vacunados tuvieron niveles séricos significativos de anticuerpos neutralizantes y se protegieron del desafío. Las capacidades de infección de las reservas de desafío viral utilizadas en las 3 pruebas clínicas separadas se establecieron por la tasa de infección de 100% de los cerdos inmunizados con placebo. Por consiguiente, los resultados de las 3 pruebas clínicas se validaron. En vista de los resultados obtenidos, la vacuna UBITh® FMDV-Oconsensus (SEQ ID NO: 25, péptido 2570) proporcionó una inmunidad protectora completa con tan sólo 2 inmunizaciones de tamaño de dosis de 25 pg (grupo 1). g. Amplitud de inmunidad protectora en cerdos desafiados Otro estudio de desafío se condujo con la vacuna UBITh® FMDV O que contenía una cantidad igual de tres construcciones VP1 O (que contenían secuencias de las cepas 2570a de consenso, Oozk/93, ÜMyanmar representadas por las SEQ ID NOs: 25, 27 y 28 respectivamente) a una dosis de 25 mg por dosis e inmunizaciones en las semanas 0 y 3 en un régimen de dos dosis. Los seis cerdos se desafiaron de manera similar por FMDV 01 Taiwan y todos se protegieron. Se recolectaron sueros de los seis cerdos inmunizados para la prueba clínica de desafío y se determinaron anticuerpos neutralizantes para los subtipos altamente prevalentes de FMDV O, 01ia¡wan, OManisa, Oiviyanmar y Ocampos (Tabla 12). Todos los cerdos produjeron niveles de anticuerpos neutralizantes de 01 Taiwan compatibles con una inmunidad sólida, que también contenía respuestas neutralizantes más fuertes contra 0Man¡sa, OMyanmar y Ocampos, indicativo de una inmunidad protectora más confiable en los subtipos del serotipo O. h. Inmunoqenicidad en rumiantes La inmunogenicidad de la vacuna UBITh® FMDV-0 OC0nsensus (SEQ ID NO: 25, péptido 2570) se demostró en una especie de rumiante en una prueba clínica de inmunogenicidad de 12 cabras. Las cabras se inmunizaron con dos dosis en las semanas 0 y 8, o tres dosis en las semanas 0, 4 y 8.

Las dosis fueron de 30 mg, 100 pg o 300 pg. La eficacia se evaluó al determinar los niveles séricos de anticuerpos neutralizantes contra FMDV 01 Taiwan- Los niveles de anticuerpos neutralizantes predictivos de protección se obtuvieron a las 12 semanas después de la última inmunización en la semana 8 (es decir, a lo largo de las 20 semanas de duración del estudio). Los esquemas de dos dosis y tres dosis fueron efectivos de igual modo, y la dosis de 30 mg fue tan efectiva como la dosis de 300 pg. Esta inmunogenicidad se ha demostrado para la vacuna UBITh® FMDV-0 en una especie rumiante objetivo, en un tamaño de dosis y formulación de vacuna equivalente a los utilizados para la inmunidad protectora en cerdos cuando se administra en 2 o 3 dosis. i. Conclusiones e interpretaciones de los hallazgos Los resultados de los experimentos descritos anteriormente pueden resumirse de la siguiente manera: La vacuna O basada en UBITh® FMDV VP1 (SEQ ID NO: 25) protegió efectivamente todos (15/15) los cerdos vacunados del desafío por FMDV Oraiwan en estudios conducidos en cuatro grupos experimentales en los tres institutos internacionales, después de dos inmunizaciones en dosis de 25, 50, 100 y 300 pg por dosis. Todos (10/10) los animales de control se infectaron en el día 2 del desafío viral.

La vacuna UBITh® FMDV O que contenía una mezcla de construcciones de VP1 O (SEQ ID NOs: 25, 27 y 28 en proporción igual, 25 pg por dosis para dos dosis administradas a las 0 y 3 semanas postinmunización inicial) suscitaron anticuerpos neutralizantes ampliamente protectores contra múltiples aislamientos de FMDV O, incluyendo 0Ta¡wan, Ocamposi On/iyanmar )/ OManisa 6n Cerdos.

La vacuna UBITh® FMDV O mostró una inmunogenicidad en una especie de rumiante, cabra, equivalente a la observada en cerdos. Este resultado predice que la presente formulación UBI será efectiva en bovinos en un intervalo de dosis comparable con el intervalo de dosis ¡nmunogénicas para cerdos.

Los inmunógenos sintéticos individuales UBITh® de FMDV suscitaron anticuerpos neutralizantes de manera simultánea contra los serotipos A, O y Asia 1 en cobayos, lo que muestra el potencial para una eficacia inesperadamente amplia en múltiples serotipos.

El péptido UBITh® FMDV O que emplea la secuencia del serotipo Oconsensus puede suscitar anticuerpos neutralizantes, medidos por el índice de neutralización, contra múltiples serotipos, incluyendo subtipos de los serotipos A, Asia 1 y O.

Los inmunógenos de la vacuna UBITh® FMDV son dirigidos al “sitio funcional” y sintéticos en su naturaleza. Las vacunas formuladas son seguras, potentes, ampliamente neutralizantes, reproducibles y estables, lo que de esta manera evita las dificultades relacionadas con la producción y control de calidad, y las desventajas asociadas con las vacunas convencionales de virus inactivado.

La disponibilidad de una vacuna químicamente definida completamente segura puede agilizar la erradicación del FMDV al alentar la vacunación incluso en regiones que se acercan al estatus libre de FMD.

EJEMPLO 7 HOMÓLOGOS PEPTÍDICOS DE INMUNÓGENOS PEPTÍDICOS SINTÉTICOS DE FMDV COMO COMPONENTES CLAVE PARA VACUNAS MULTIVALENTES BASADAS EN PÉPTIDOS DE FMDV DISEÑADAS A LA MEDIDA PARA NECESIDADES REGIONALES Las vacunas contra fiebre aftosa tradicionalmente representan la participación más grande del mercado de vacunas veterinarias en el mundo desde el punto de vista de las ventas, con 26.4% de todo el negocio de biológicos para ganado. Debido a la alta variabilidad de los serotipos y subtipos de FMDV, la composición antigénica de las vacunas clásicas de FMD basadas en lisados virales se diseña a la medida para regiones específicas en el mundo y, en muchos casos, para países o regiones específicas dentro de las mismas. El uso actual de la vacuna en regiones endémicas de FMD requiere una investigación a profundidad de la epidemiología de la enfermedad y estudios de armonización de vacunas para (1) determinar si la vacuna será efectiva contra la o las cepas que circulan en el área objetivo y (2) asegurar que el perfil real de la vacuna es adecuado para el control y erradicación.

Con la llegada de la virología molecular, una gran parte de la secuencia de la proteína de cápside VP1 del virus de fiebre aftosa puede amplificarse fácilmente por la reacción en cadena de la polimerasa dependiente de transcripción inversa (RT-PCR) a partir de aislamientos virales obtenidos de muestras de tejidos de casos de FMD sometidos de acuerdo con la práctica de vigilancia nacional, así como múltiples muestras de tejidos y sondas recolectadas de brotes de FMDV. Las secuencias de VP1 identificadas pueden alinearse. El alineamiento comprende secuencias de los serotipos con la relación genética con otros aislamientos indicados. Las secuencias VP1 de la o las cepas que circulan en el área objetivo pueden obtenerse fácilmente con base en el armazón de aminoácidos (VP1 129-168) establecido en esta descripción de invención, y homólogos peptídicos para este armazón (Tabla 2, SEQ ID NOs: 2-23) que representan la secuencia de VP1 identificada para los brotes de FMDV identificados regionalmente y para que tales homólogos peptídicos de VP1 diseñados (Tabla 3, SEQ ID NOs: 25-33) se incluyan en las formulaciones de vacunas para asegurar su conveniencia para control y erradicación, diseñadas a la medida para las necesidades regionales específicas.

Las formulaciones específicas que contienen los homólogos peptídicos derivados de ¡nmunógenos peptídicos sintéticos de FMDV (que tienen VP1 aa129 a aa168) como ingrediente clave, cuando se administran en dos o más dosis, incluyen los ejemplos mostrados en la Tabla 14: (a) Vacuna monovalente porcina de FMDV serotipo O con homólogo peptídico (SEQ ID NO: 25); (b) Vacuna bivalente porcina de FMDV serotipo O con una mezcla de dos homólogos peptídicos (SEQ ID NOs: 25 y 28) en igual proporción en peso; (c) Vacuna trivalente porcina de FMDV serotipo O con una mezcla de tres homólogos peptídicos (SEQ ID NOs: 25, 27 y 28) en igual proporción en peso; (d) Vacuna bivalente para bovinos/rumiantes de FMDV serotipos O y Asia 1 con una mezcla de dos homólogos peptídicos (SEQ ID NOs: 25 y 29) en igual proporción para utilizarse en Asia; (e) Vacuna trivalente para bovinos/rumiantes de FMDV serotipo O, Asia 1 j¡ansu y Acansu (SEQ ID NOs: 25, 29 y 31) en igual proporción para utilizarse en China; (f) Vacuna trivalente para bovinos/rumiantes de FMDV serotipo Ocampos, A24 y Cmdaiai (SEQ ID NOs: 26, 30 y 32) en igual proporción para utilizarse en Brasil; (g) Vacuna trivalente para bovinos/rumiantes de FMDV serotipo Ocampos> A24/Argentina 2001 Y C|ncia¡al (SEQ ID NOs: 26, 30, 33 y 32) en igual proporción para utilizarse en Argentina; La conveniencia de los homólogos peptídicos diseñados para utilizarse en la formulación de vacuna final puede valorarse a través de la detección de inmunogenicidad relativa y reactividad cruzada a los antígenos de VP1 de FMDV de diferentes aislamientos por los ELISA específicos de péptidos basados en secuencias de VP1 de FMDV, como se describe en el Ejemplo 1.

Como se muestra en las Tablas 15 a 17, las formulaciones de vacunas basadas en homólogos de VP1 (a) a (g) (que contienen homólogos de las SEQ ID NOs: 25-33) satisfacen necesidades regionales específicas (por ejemplo, China, Sureste Asiático, Brasil y Argentina). Específicamente, estas formulaciones proporcionan la inmunogenicidad deseada para las secuencias VP1 de los serotipos orientados (por ejemplo, Oia¡wan, Ocampos, Oozki Oiviyanmari ASÍa 1 , AGansu A24, ^Argentina 2001 , Cindaial). Además, la inmunogenicidad funcional también se ha observado para estas formulaciones de vacunas contra FMDV, tal como se demuestra por su capacidad para suscitar anticuerpos neutralizantes hacia los serotipos orientados incluyendo, pero sin limitarse a, el serotipo 0Ta¡wan99 (como se describe en el Ejemplo 6, Tabla 12). Los componentes totales de células B basados en VP1, inductores de anticuerpos neutralizantes contra FMDV, empleados en las formulaciones de vacunas, pueden ser a partir de 25 pg por dosis cuando se administran en 2 dosis dentro de un esquema de inmunización.

EJEMPLO 8 LAS FORMULACIONES DE VACUNAS CONTRA FMDV QUE CONTIENEN SOLAMENTE PÉPTIDOS DE GRUPOS DE EPÍTOPOS DE CÉLULAS B DERIVADOS DE PROTEÍNA VP1 FALLARON COMO VACUNA DE EMERGENCIA CONTRA DESAFÍOS VIRALES DE FMDV CON UNA SOLA ADMINISTRACIÓN Formulaciones específicas que incorporan homólogos peptídicos sintéticos de FMD se prepararon como se describe en el Ejemplo 7. Estas formulaciones fueron capaces de suscitar respuestas inmunes neutralizantes de FMDV en vacunas contra FMDV porcinas y para bovinos/rumiantes después de la administración de dos o más dosis. Sin embargo, estas formulaciones fueron incapaces de proteger consistentemente a cerdos y bovinos del desafío viral de FMDV con una sola administración de la formulación, tal como se requiere por el procedimiento de desafío viral de la OIE. La incapacidad de estas formulaciones para dotar a los animales de una protección completa contra el desafío con FMDV al utilizar una sola administración plantea un serio obstáculo para la comercialización de las formulaciones de vacunas contra FMDV basadas en homólogos peptídicos de VP1.

Una detallada revisión de la cinética para el desarrollo de anticuerpos neutralizantes para todas las formulaciones de vacunas basadas en homólogos de VP1 reveló que los títulos de anticuerpos neutralizantes permanecieron bajos o cerca de los títulos de fondo (<=3) hasta cuatro semanas después de la única administración (Figuras 3A y 3B). Los títulos de anticuerpos neutralizantes en cerdos y bovinos se elevaron a niveles significativamente altos en la semana 6 sólo después de la segunda administración a las 4 semanas postadministración inicial (Figuras 3A y 3B; y Tablas 15-17). Tal retardo en la generación de altos títulos de anticuerpos neutralizantes sugiere la falta (o nivel reducido) de ciertos elementos de la respuesta inmune en la vacuna peptídica basada en VP1. Estos elementos perdidos/reducidos parecen presentarse en la vacuna basada en lisados virales de FMDV, la cual es capaz de montar protección como vacuna de emergencia.

Una respuesta de memoria sensibilizadora y rápida, que da lugar a una reducción significativa de la replicación viral con la exposición viral, puede ser el elemento que se pierde de la formulación de vacuna basada en homólogos de VP1 , requerido en una respuesta inmune completamente protectora con la única administración. Potentes respuestas de linfocitos T cooperadores se generan después de dos o más dosis cuando el epítopo UBITh® extraño se enlaza a los homólogos peptídicos de VP1 , tal como se demuestra por la elevación significativa en los títulos de anticuerpos neutralizantes mostrada en las Figuras 3A y 3B; y Tablas 15 a 17. Sin embargo, una vacuna de emergencia debe sensibilizar rápida y suficientemente el sistema inmune de un animal con una sola administración de la formulación de vacuna para que sea efectiva en proporcionar una rápida respuesta de memoria con la infección viral.

Los siguientes Ejemplos describen experimentos que evalúan la respuesta de células T de rápida acción, al emplear formulaciones de vacunas que contienen epítopos de células B y T derivados de FMDV de componentes múltiples.

EJEMPLO 9 FUNDAMENTOS, SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE FORMULACIONES DE VACUNAS CONTRA FMDV BASADAS EN EPÍTOPOS DE CÉLULAS B Y T DE COMPONENTES MÚLTIPLES PARA UNA VACUNA DE EMERGENCIA DE ADMINISTRACIÓN ÚNICA Como se describe en el Ejemplo 8, los intentos repetidos en el desarrollo de una formulación de vacuna de emergencia contra FMD al utilizar una combinación de péptidos de grupos de epítopos de células B derivados de VP1 de FMDV solamente, fue incapaz de generar consistentemente altos títulos de anticuerpos neutralizantes a las 3 a 4 semanas postinmunización inicial con una sola administración. De esta manera, estas formulaciones fueron incapaces de proteger a los animales en el desafío con FMDV. Se agotaron demasiados esfuerzos para identificar los elementos ¡nmunológicos requeridos para el desarrollo potencia con éxito de una vacuna de emergencia de FMD de alta.

La vacuna comercial de emergencia basada en lisados virales de FMD induce la proliferación de células T gd en cerdos sin contacto previo, y estas células T gd en cerdos sin contacto previo expresan diversos mRNA de citocina /quimiocinas después de la exposición a antígenos virales de vacunas contra FMD. Uno de los cambios notables observados en animales que reciben la vacuna contra FMD de emergencia de alta potencia es el alto nivel de producción sistémica de citocinas, incluyendo IFN-g (Cox 2003). Cuando los PBL de cerdos inmunes a FMD (animales vacunados y desafiados con virus) se estimularon in vitro con antígenos de FMDV, inmediatamente después del desafío con virus de FMD y la recuperación, las células T gd fueron la subpoblación proliferante principal encontrada, lo que indica que tal proliferación de células T yó puede ser una característica de ciertas infecciones virales. La interacción directa célula a célula entre las células T gd y las células T CD4+ del MHC clase II+ se observaron como grupos de células que muestran una clara formación de uniones, y tales interacciones exhibidas como proliferación de células T puede bloquearse por anticuerpos monoclonales contra el MHC clase II y CD4, lo que indica capacidad de presentación de antígenos por las células T gd mediante el MHC clase II (Takamatsu 2002). La implicación de las células T gd en la inducción de inflamación y producción diferencial de citocinas reveló una importante función para las células T gd en la inmunoregulación, controlando las respuestas inmunes innata y adaptativa. Estas células pueden poseer atributos asociados con las Células Presentadoras de Antígenos (APC) profesionales. La importancia de la implicación de células T gd en la generación de respuestas inmunes rápidas contra antígenos de FMDV en la vacuna de emergencia de FMD de alta potencia basada en lisados virales nos motivó para evaluar ampliamente el diseño, tamizado y selección para la inclusión de uno o más de los péptidos de grupos de epítopos T endógenos de FMDV en nuestras vacunas de emergencia de FMD de alta potencia basadas en péptidos sintéticos, a través de la medición in vitro de la producción de IFN-g, como indicadores para el inicio de la activación de células T mediada por péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV.

Los ensayos funcionales de células T específicos, que se describen con detalle en el Ejemplo 3, se utilizaron para seleccionar e identificar péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV derivados de segmentos antigénicos de las proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B y 3D de FMDV que se reconocen por células T de cerdo y bovinos derivadas de hospedadores inmunizados con (a) vacunas de lisados virales de FMDV y (b) formulaciones peptídicas que contienen péptidos Th candidatos de FMDV. a. Identificación de péptidos de grupos Th endógenos de FMDV en animales porcinos v bovinos por medición in vitro de producción de IFN-v como indicador para el comienzo de la activación de células T inmunes Con el estímulo in vitro , las células T sensibilizadas de animales inmunizados con las formulaciones que incorporan péptidos de epítopos Th endógenos de FMDV liberaron IFN-g y, consistentemente, potenciaron la producción de anticuerpos neutralizantes para FMDV. Tal ensayo es mucho más fácil de reproducir y, de esta manera, se ha utilizado como un robusto ensayo de selección para la evaluación de la potencia y para la identificación del grupo de epítopos Th endógenos de FMDV, para su inclusión en las formulaciones finales de vacunas contra FMDV.

El diseño para el inmunógeno peptídico de grupos de epítopos de células T se llevó a cabo al probar primero péptidos que tienen secuencias que muestran grupos de motivos de unión a MHC clase II en cuanto a su capacidad para inducir una respuesta de IFN-g en cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de cerdos y bovinos inmunizados con vacuna de lisado viral de FMDV OTaiwangg, luego desafiados y recuperados. A partir de esta selección, los péptidos que fueron capaces de activar una baja, media y alta producción de IFN-g se agruparon para una posterior selección y diseño para su incorporación en las formulaciones de vacunas. La Figura 1 muestra la distribución/localización de epítopos de células B y T endógenos seleccionados en las proteínas VP4, VP2, VP3, VP1 , 2B, 2C, 3A, 3B, 3C y 3D de FMDV que se identificaron por los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 3 y utilizados en aplicaciones subsecuentes de formulaciones de vacunas.

Las secuencias para cada uno de los péptidos de grupos de epítopos de células T derivados de la cepa 0Ta¡wan9 de FDMV se identifican en la Tabla 4 (SEQ ID NOs: 34-63). Los péptidos Th de FMDV se alinearon con secuencias homologas de epítopos de célula T cooperadora de FMDV de otras cepas de FMDV, como se muestra en la Tabla 5 (SEQ ID NOs: 64-78). Para mejorar la solubilidad de estos antígenos peptídicos bastante hidrofóbicos, tres residuos de lisina (KKK) se agregaron al extremo N terminal de los inmunógenos peptídicos de células T cooperadoras individuales. Una combinación de estos péptidos de grupos de células T que contienen algunos o todos los inmunógenos peptídicos Th identificados en igual proporción en peso (SEQ ID NOs: 34-87) se utilizaron como complemento para la mezcla de homólogos peptídicos de VP1 en las formulaciones de vacunas para potenciar además la inmunogenicidad de los inmunógenos peptídicos de grupos de células B de FMDV, en porcinos y bovinos. Estas formulaciones de vacunas se utilizaron en extensos experimentos donde los títulos de anticuerpos neutralizantes en las semanas 0 y 3 se midieron/evaluaron in vitro como indicaciones para la eficacia protectora in vivo con la administración única (Tablas 18, 19). Estos péptidos Th de FMDV combinados también pueden actuar como inmunógenos peptídicos de células T de FMDV para la inmunidad mediada por células.

Para ampliar además la cobertura de epítopos de células T para animales que tienen un antecedente genético diverso, péptidos combinatorios basados en las nueve secuencias homologas específicas de epítopos de células T respectivas (Tabla 19, grupo 7, SEQ ID NOs: 79-87) también se diseñaron. De manera similar, tres residuos de lisina (KKK) se agregaron al extremo N terminal de los respectivos inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos de células T combinatorios para mejorar su solubilidad en agua para un uso posterior de la formulación. Una combinación de estos inmunógenos peptídicos combinatorios de grupos de epítopos de células T también se utilizó como complemento en las formulaciones de vacunas para potenciar además la inmunogenicidad de los inmunógenos peptídicos de grupos de epítopos de células B de VP1 de FMDV y, por su cuenta, como inmunógenos peptídicos de células T de FMDV para la inmunidad mediada por células (Tabla 19).

A través de pruebas extensas, una lista de péptidos de grupos Th endógenos de FMDV preferidos para cerdos son las SEQ ID NOs: 61 a 63; y para bovinos son las SEQ ID NOs: 34 a 60. Estos péptidos cortos pueden hacerse solubles por la adición de residuos de lisina (por ejemplo, KKK) en el extremo N terminal de los péptidos de grupos de epítopos Th. La inmunogenicidad de estos péptidos puede potenciarse al elaborar una secuencia peptídica combinatoria al utilizar cada epítopo Th con base en el o los serotipos empleados para el diseño de secuencias bibliotecas combinatorias (por ejemplo, O, Asial , A, C, etc.) y enlazar además los péptidos de grupos Th de FMDV individuales seleccionados (como una sola secuencia o como secuencia combinatoria) en forma de casete al epítopo UBITh® (SEQ ID NO: 24) como construcciones Th de FMDV combinadas. Las secuencias ejemplares que contienen estos atributos son como se muestra en la Tabla 7 como SEQ ID NOs: 88 a 95.

Debido al antecedente genético particularmente diverso de los bovinos, diversas combinaciones de péptidos Th endógenos de FMDV preseleccionados, derivados de una gran combinación de péptidos capaces de activar el comienzo de la reacción de células T específica de antígenos en los animales que reciben las formulaciones de vacunas que ya contienen los péptidos VP1 de grupos de epítopos de células B de FMDV optimizados, se probaron en cuanto a su inmunogenicidad universal en los animales (Tabla 19). La capacidad para activar el comienzo de la reacción de células T específica de antígenos, por los animales que reciben sólo una administración única de tales formulaciones de vacunas, se ejemplifica por los títulos significativos de anticuerpos neutralizantes que las vacunas fueron capaces de montar en porcinos y bovinos (Tablas 18 y 19). En ausencia de estos péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV, las vacunas sólo fueron capaces de montar un título insignificante (es decir, <=3) de anticuerpos neutralizantes después de recibir una sola administración de las vacunas (Figuras 3A y 3B) para las semanas 0 y 3 postinmunización inicial para cada una de las formulaciones que contienen sólo homólogos de inmunógenos peptídicos de VP1.

Se preparó una formulación de vacuna contra FMDV simple que contenía (1) el inmunógeno de B VP1 de FMDV del serotipo O (SEQ ID NO: 25); (2) 10% (en peso) de una construcción peptídica de epítopos Th de FMDV diseñada (SEQ ID NO: 90); y (3) tres epítopos Th de FMDV porcino en forma de casete enlazados por UBITh® (SEQ ID NO: 24). Esta formulación se administró a cerdos en una sola administración y el nivel de IFN-g se midió in vitro a partir de las PBMC e in vivo por ensayo de ELISA cuantitativo de suero (como se describe en el Ejemplo 3) durante un período de cuatro semanas. Un nivel de producción creciente de IFN y, con el tiempo después de la inmunización, se observó en este estudio, como se muestra en las Figuras 4A y 4B.

Este hallazgo confirmó además que los péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV seleccionados pueden sensibilizar a las células T del hospedador inmunizado inmediatamente después de la inmunización. Con la exposición a FMDV por infección natural o a través de un estudio de desafío, los antígenos virales expuestos inician el comienzo de las reacciones de células T específicas de antígenos a través de las células T de memoria anteriormente sensibilizadas con antígeno peptídico de células T cooperadoras de la vacuna contra FMDV. Estos epítopos Th inmunodominantes cuidadosamente seleccionados, presentes en las proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B y 3D de FMDV, proporcionan la sensibilización anterior de las células Th relacionadas con FMDV y permiten la activación de significativas respuestas proliferativas de linfocitos en los hospedadores inmunizados con la exposición a FMDV, lo que conduce a la producción de citocinas, incluyendo IFN-g, incluso después de sólo una administración única de las formulaciones de vacunas respectivas. Se sabía que las citocinas cumplen con una función clave en las respuestas inmunes mediadas por células contra una diversidad de infecciones virales citopáticas en animales. b. Identificación de las formulaciones de vacunas óptimas para utilizarse como vacuna de emergencia en porcinos y bovinos, al determinarse por ensayos de neutralización La respuesta linfoproliferativa a FMDV en animales vacunados y desafiados generalmente se encontró significativamente superior para las formulaciones que incorporan péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV, en comparación con las que no. La inclusión del epítopo de célula T específico en la formulación peptídica permite la sensibilización de células T que pueden reconocer, de manera más eficiente, los epítopos virales presentados en el contexto de un virus subsecuente encontrado.

El IFN-g es un activador principal de macrófagos, que potencia su actividad antimicrobiana y su capacidad para procesar y presentar antígenos a los linfocitos T. Se ha reportado que el IFN-g estimula la expresión del MHC en las células presentadoras de antígenos, e inhibe de manera eficiente la replicación del FMDV. De esta forma, la activación de estos mecanismos tempranos es relevante para la inducción de respuestas inmunes protectoras contra FMDV, requeridas de una vacuna de emergencia con la administración única. En presencia de péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV, las células B reactivas a VP1 de FMDV pueden activarse, lo que conduce a una rápida proliferación de células B y producción de anticuerpos. Estos péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV también pueden activar a células T cooperadoras, lo que conduce a la secreción de citocinas y resulta en un ambiente adecuado para la generación de memoria de células B. Estos hallazgos sugieren que la mejor protección clínica conferida por los péptidos B y Th endógenos de VP1 de FMDV combinados, en comparación con los péptidos B de VP1 solos, se debe en su mayor parte a la inducción de una respuesta linfoproliferativa más eficiente, y la liberación de IFNy que también conduce a una mejor inducción, de esta manera, de títulos superiores de anticuerpos neutralizantes como parte del evento temprano.

Ensayos de neutralización estándar se emplearon para la selección de formulaciones de vacunas que pueden activar mejor tales respuestas inmunes protectoras tempranas in vivo, requeridas por una vacuna de emergencia. Los sueros recolectados a tres semanas a partir de la inmunización inicial se evaluaron en los porcinos (Tabla 18) y bovinos (Tabla 19) vacunados. Dado que el ensayo de anticuerpos de neutralización se ha utilizado como ensayo sustituto para reemplazar la costosa y engorrosa prueba de desafío físico por ciertas agencias nacionales, como parte de los criterios de liberación para una vacuna de emergencia contra FMDV, estudios sistemáticos con la multitud de formulaciones de vacunas contra FMDV, al utilizar combinaciones y proporciones variables de péptidos B y de grupos de epítopos Th endógenos derivados de VP1 de FMDV, se condujeron y evaluaron en cuanto a su eficacia protectora respectiva por este ensayo de anticuerpos de neutralización sustituto, el cual se describió brevemente en el Ejemplo 2.

Específicamente, tres a cinco animales libres de FMDV por grupo para porcinos y bovinos en edades de 8-12 semanas y 6-12 meses, respectivamente, se inmunizaron en la semana 0 por diversas combinaciones de formulaciones de vacunas contra FMDV basadas en péptidos de epítopos de células B y T de componentes múltiples, después de una administración única con sueros recolectados para pruebas de títulos de anticuerpos neutralizantes. 1. Cerdos Los datos de 13 grupos de animales del estudio porcino se muestran en la Tabla 18. Las formulaciones utilizadas en estos experimentos se prepararon como se describe posteriormente. Todos los cerdos se inmunizaron con 1 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupo 1 - contenía sólo el péptido de consenso de FMDV VP1 O prototipo (SEQ ID NO: 25).

Grupos 2 a 4 - se prepararon con el péptido de consenso de FMDV VP1 O prototipo (SEQ ID NO: 25) en combinación con una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 o SEQ ID NO: 90) en una relación B:Th de 10:1 en peso a 25 + 2.5 mg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80.

Grupos 5 a 7 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25) y Oozk (SEQ ID NO: 28) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 25 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 o SEQ ID NO: 90) en una relación B:Th de 10:1 en peso a 25 + 2.5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80.

Grupos 8 a 10 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25) y Oozk (SEQ ID NO: 28) y 0Myanmar (SEQ ID NO: 27) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 25 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 y SEQ ID NO: 90 en una relación B:Th de 10:1 en peso a 25 + 2.5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80.

Grupos 11 a 13 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25) y 00zk (SEQ ID NO: 28), On/iyanmar (SEQ ID NO: 27) y Asia 1 Jiangsu (SEQ ID NO: 29) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 25 mg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 34-63, SEQ ID NOs: 61-63 y SEQ ID NO: 90) en una relación B:Th de 10:1 en peso a 25 + 2.5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Sepplcs, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80.

En resumen, todos los cerdos estaban libres de anticuerpos contra FMDV en la semana 0, cuando los estudios respectivos se iniciaron en los diversos puntos en el tiempo. La administración única de las formulaciones de vacunas contra FMDV de componentes múltiples que contenían los diversos péptidos B y de grupos de epítopos Th endógenos derivados de VP1 de FMDV, suscitaron la generación de anticuerpos significativos dirigidos contra el o uno de los péptidos orientados 0Consensus (SEQ ID NO: 25) por ELISA con un título Log10 entre 2 y 3 (es decir, 10E2 a 10E3). 2. Bovinos Los datos de un total de 32 grupos de animales, con tres animales por grupo del estudio bovino, se muestran en la Tabla 19. Las formulaciones utilizadas en estos experimentos se prepararon como se describe posteriormente. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 1 a 8 - se prepararon a partir del péptido FMDV VP1 Oconsensus prototipo (SEQ ID NO: 25) en combinación, respectivamente, con una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos, incluyendo las SEQ ID NOs: 34-63 (30 Th); SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51 , 53-63 (24 Th); SEQ ID NO: 34-39, 44, 46-51 , 53-60 (21 Th); SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15 Th); SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 48, 50, 53 (6 Th); SEQ ID NOs: 62-78 (17 Th homólogos); SEQ ID NOs: 79-87 (bibliotecas cortas 9 Th); y SEQ ID NO: 88, 89 (2 casetes Th potenciados UBITh®), respectivamente, todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 mg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80.

Grupos 9 a 11 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25), Oozk (SEQ ID NO: 28) y 0Myanmar (SEQ ID NO: 27) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 88, 89(2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91,92 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) y SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15 Th) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 12 a 16 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 50), 00zk (SEQ ID NO: 28) y Oiviyanmar (SEQ ID NO: 27) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 25 mg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15 Th) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 1:1, 5:1 , 10:1, 50:1 y 100:1 en peso en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 17 a 19 - se inmunizaron con FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25), 002k (SEQ ID NO: 28), Ofviyanmar (SEQ ID NO: 27) y Asia 1 Jiangsu (SEQ ID NO: 29) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15 Th); SEQ ID NOs: 88, 89 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91,92(2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 mg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 25 y 26 - se inmunizaron con FMDV VP1 0Campos (SEQ ID NO: 26), A24 (SEQ ID NO: 30) y Cindaiai (SEQ ID NO: 32) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 91 , 92 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 27 y 28 - se inmunizaron con FMDV VP1 Ocampos (SEQ ID NO: 26), A24 (SEQ ID NO: 30) y C|ncia¡ai (SEQ ID NO: 32) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 91 , 92 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 mg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar Emulsigen D (12%) como el adyuvante. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 29 y 30 - se inmunizaron con FMDV VP1 0Campos (SEQ ID NO: 26), AArgent¡na2ooi (SEQ ID NO: 33) y Cmdaiai (SEQ ID NO: 32) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 91 , 92 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar ISA50V2 como el adyuvante (Seppics, Francia) que contiene 0.1% de Tween 80. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

Grupos 31 y 32 - se inmunizaron con FMDV VP1 0CamPos (SEQ ID NO: 26), AArgentina2ooi (SEQ ID NO: 33) y Cmdaiai (SEQ ID NO: 32) como el componente de células B de la vacuna contra FMDV, en igual proporción en peso a 50 pg/ml en total, los cuales se complementaron respectivamente por una mezcla de igual proporción en peso de péptidos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 91 , 92 (2 casetes Th potenciados UBITh®); SEQ ID NOs: 91 , 93-95 (4 casetes Th potenciados UBITh®) todos en igual proporción en peso y en una relación B:Th de 10:1 en peso a 50 + 5 pg/ml en una emulsión agua en aceite al utilizar Emulsigen D (12%) como el adyuvante. Todos los bovinos se inmunizaron con 2 mi de emulsión como la formulación de vacuna.

En resumen, todos los animales bovinos estaban libres de anticuerpos contra FMDV en la semana 0, cuando los estudios respectivos se iniciaron en los diversos puntos en el tiempo. La administración única de las formulaciones de vacunas contra FMDV de componentes múltiples que contenían los diversos péptidos B y de grupos de epítopos Th endógenos derivados de VP1 de FMDV, suscitaron la generación de anticuerpos significativos dirigidos contra el o uno de los péptidos orientados Oconsensus (SEQ ID NO: 25), aún cuando el inmunógeno peptídico objetivo estaba en una fracción de los componentes B debido a la presencia de otro inmunógeno VP1 B relacionado de diferentes serotipos (en su mayor parte debido a la alta reactividad cruzada entre estos inmunógenos peptídicos VP1 ) usualmente con un título en el intervalo del título Logi0 entre 2 y 3.

Inesperadamente, las formulaciones que tienen un intervalo amplio en las relaciones de péptidos B:Th fueron efectivas en suscitar una respuesta inmune en los animales probados. Es decir, el intervalo porcentual para la inclusión de tales péptidos de grupos Th endógenos de FMDV puede variar a partir de 1% (es decir, relación Th a B de 1:100) hasta tanto como 50% (es decir, relación Th a B a 1 :1) (véase grupos 12 a 16 en el estudio de inmunización en bovinos) fueron formulaciones efectivas para suscitar en los animales una elevación significativa en los anticuerpos neutralizantes en sus sueros recolectados a las 3 semanas postinmunización inicial.

En general, un 10% a 20% de péptidos de grupos Th de FMDV a péptidos de grupos de epítopos de células B de VP1 de FMDV (es decir, una relación 1:5 o 1 :10) se seleccionó y utilizó en las formulaciones finales de vacunas contra FMDV basadas en péptidos para montar respuestas inmunes B y T equilibradas en animales que reciben una sola administración mediante la ruta de inyección intramuscular de la formulación de vacuna contra FMDV.

EJEMPLO 10 PROTECCIÓN DE ANIMALES PORCINOS Y BOVINOS DE LOS DESAFÍOS VIRALES DE FMDV DESPUÉS DE RECIBIR FORMULACIONES DE VACUNAS CONTRA FMDV BASADAS EN EPÍTOPOS DE CÉLULAS B Y T DE COMPONENTES MÚLTIPLES COMO VACUNA DE EMERGENCIA DE ADMINISTRACIÓN ÚNICA a. Estudios de desafío conducidos en cerdos: Con las formulaciones de vacunas contra FMDV basadas en epítopos de células B y T de componentes múltiples optimizadas, diseñadas para una vacuna de emergencia de administración única que da lugar a títulos de anticuerpos neutralizantes significativos en sueros recolectados a las 3 semanas postinmunización inicial, seis estudios de desafío adicionales se condujeron en Tamsui, Taiwán, para evaluar y validar la eficacia protectora para las formulaciones representativas seleccionadas, previamente probadas en el Ejemplo 9.

En particular, los estudios de desafío con FMDV al utilizar la cepa FMDV O aiwan se realizaron en animales vacunados. Los estudios de desafío se realizaron de acuerdo con protocolos/métodos similares. Un estudio de desafío representativo/ejemplar se describe con detalle en este Ejemplo (a continuación). Específicamente, el estudio de desafío, como se muestra en la Tabla 20 (que corresponde a los grupos 5, 6 y 7 del Estudio II; grupos 12, 13 y 14 del Estudio IV; y grupos 15, 16, 17, 18 y 19 del Estudio V como se muestra en la Tabla 25) se describe/evalúa con detalle en la Tablas 20 a 24. Los otros grupos implicados en tales estudios de desafío, conducidos en porcinos y bovinos, se presentaron en forma resumida en las Tablas 25 y 26, respectivamente.

Animales: Treinta y dos (32) cerdos híbridos SPF de 8 semanas de edad (a 0 spii) se utilizaron en los estudios de desafío. Los cerdos estaban libres de FMD y no se inmunizaron previamente con vacuna contra FMD (es decir, sin contacto previo). Los cerdos se alojaron en el Instituto de Investigación en Salud Animal (AHRI), Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo. El estudio se condujo en AHRI desde la inmunización inicial hasta la terminación del estudio de desafío.

Condiciones especiales de crianza: Los diferentes grupos se alojaron en jaulas comunitarias, dependiendo de la situación real. El grupo control se alojó en un recinto individual. Los animales que mostraron signos de infección se removieron a un recinto separado.

Virus: Cepa FMDV OTAW/97K- Equipos: Los equipos FMDV Nonstructural Protein ELISA Kit y FMD peptide 2570a EIA titration kit se utilizaron como se describe en el Ejemplo 1.

Agrupamiento: Los 32 cerdos se dividieron en 11 grupos en forma aleatoria. El número ID del animal, volumen de dosis, ruta de inyección y sitio de inyección se resumen en la Tabla 20.

Esquema de sangrado: A 0, 2, 4 semanas postvacunación (SPV) y 14 días postdesafío (DPD).

Vacunación: La vacunación se administró a 0 SPV en las dosis designadas respectivas.

Esquema de desafío: A 4 semanas después de la inmunización, los cerdos vacunados y controlados se desafiaron con FMDV O-Taiwan (virus de pasaje porcino) en los bulbos de talones de la extremidad delantera derecha mediante la ruta SC. La cantidad de virus fue de 0.5 mi (105 TCID50).

Ensayos de monitoreo: Después del desafío viral, el desarrollo de signos clínicos y síndromes de FMD en cerdos se monitoreó por 14 días con la temperatura corporal registrada diariamente.

Las temperaturas corporales de los cerdos después del desafío viral se registraron en la Tabla 21. Las temperaturas de los cerdos se elevaron ligeramente pero en su mayor parte estuvieron por debajo de 40 °C durante los 14 días postdesafío (DPC) monitoreados.

Títulos de neutralización: Los cerdos se sangraron a 0, 2 y 4 semanas postvacunación (SPV) y 14 DPD. Los sueros de cada animal se recolectaron de muestras coaguladas por centrifugación y se sometieron a ensayo de neutralización viral. Los títulos de neutralización y las medias geométricas se calcularon y se muestran en la Tabla 22. Títulos significativos de anticuerpos neutralizantes (NA) se observaron para todas las formulaciones en un modo dependiente de la dosis. Aunque la media geométrica de los títulos de NA fue inferior a 16 a 4 SPV para ciertos grupos, todos los animales se protegieron en todos los grupos experimentales (100%) a 14 DPD, mientras que dos de dos animales en el grupo de placebo control o control negativo se infectaron con signos clínicos detectados ya en el día 2. En el grupo 19 del Estudio V se utilizó vacuna de serotipo O basada en lisado viral de FMDV (de Rusia) como control positivo, donde los tres animales se protegieron con la administración única.

ELISA FMDV NS: Las muestras séricas se sometieron a ensayo con FMDV Nonstructural Protein ELISA en el AHRI con los resultados mostrados en la Tabla 23. Antes del desafío, todos los grupos probados estaban sin contacto previo, lo que muestra la falta de reactividad a la proteína NS de FMDV. Sólo los animales en el grupo de control negativo con placebo mostraron reactividad positiva a la proteína NS a 14 DPD, lo que indica su naturaleza infectiva.

Titulación de ELISA anti-VP1 (péptido 2570a)\ Los resultados de los títulos de anticuerpos anti-VP1 se probaron por ELISA basado en péptido 2570a de VP1 , como se describe en el Ejemplo 1, con los resultados mostrados en la Tabla 24. La mayor parte de los cerdos desarrollaron respuestas inmunes significativas incluso a las dos semanas después de la inmunización.

Todos los animales de los grupos experimentales, excepto aquellos en el grupo control de placebo negativo, se protegieron contra el desafío con FMDV, independientemente de sus títulos de NA cuando las formulaciones de vacunas peptídicas de FMDV incluyeron péptidos Th de FMDV endógenos, como se muestra en sus formulaciones respectivas.

Aunque algunas de las medias geométricas de los títulos de anticuerpos neutralizantes a 4 SPV en los grupos experimentales estuvieron por debajo de 16, los cerdos se protegieron en su totalidad. Esto dio una clara indicación de que, además de los anticuerpos neutralizantes, hay otros factores que están implicados en la protección de animales en los desafíos virales. La inclusión de péptidos Th de FMDV endógenos, en formato de casete corto o largo, demostró su función crítica en suscitar inmunidad celular con la administración única de las formulaciones de vacunas peptídicas. Puede haber tanto como 30 Th de FMDV (SEQ ID NOs: 34-63) o sólo 3 Th previamente refinados y seleccionados (SEQ ID NOs: 61-63) para ofrecer tal inmunidad celular en porcinos, lo cual ofrece tal protección cuando se encuentran en combinación con el o los péptidos en bucle de VP1. Las vacunas de combinación que incorporan secuencias de homólogos de FMDV VP1 O dieron una protección de igual modo efectiva, o quizá más, de los cerdos en el desafío con FMDV por la cepa Oiaiwan· No hubo anticuerpos contra la proteína NS de FMDV detectados en los grupos experimentales que recibieron las respectivas formulaciones de vacunas en todo el período monitoreado, lo cual ilustró además la protección completa de estos animales en la infección por FMDV, incluso en presencia de un desafío viral con FMDV de alta dosis (dosificación viral requerida por OIE 10X). En todas las formulaciones probadas, los cerdos que recibieron solamente 0.5 mi por dosis se protegieron de igual modo en comparación con los que recibieron 2 mi por dosis.

En trece (13) de ios grupos (grupos 1-3, 5-7, 8-10, 12-15) se utilizó FMDV Oconsensus (SEQ ID NO: 25) como el inmunógeno de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV. El grupo 16 utilizó FMDV Oconsensus, Oozk, ÜMyanmar (SEQ ID NOs: 25, 28 y 27), y el grupo 17 utilizó FMDV Oconsensus, Oozk, Oiviyanmar Y Asía 1 j¡angsu (SEQ ID NOS. 25, 28, 27 y 29) COITIO los inmunógenos de epítopos de células B derivados de VP1 de FMDV (en igual proporción en peso) respectivamente. En los grupos restantes se utilizó control de placebo.

En todas estas formulaciones, excepto por los grupos control de placebo, se agregaron péptidos de grupos de epítopos Th de FMDV endógenos a los componentes de epítopos B de VP1 de FMDV en todos los grupos, como se indica con detalle y como se muestra en la Tabla 25. Los Estudios II y IV se condujeron con los grupos en cada uno de los estudios al administrarse 2 mi, 1 mi, 0.5 mi por dosis para probar la potencia (PD50) de las formulaciones de vacunas respectivas. Todos los animales experimentales se monitorearon en sus signos clínicos de FMD durante un período de observación de 14 días. Relaciones variadas de FMDV VP1 Oconsensus (SEQ ID NO: 25) y péptido de casete Th de FMDV potenciado UBITh® (SEQ ID NO: 90) desde 1:1 , 5:1 y 10:1 también se probaron para los grupos 8 a 10 en el Estudio III. Un estudio similar de relaciones variadas también se condujo para el Estudio V con inmunógenos peptídicos combinados de VP1 de FMDV y péptido de casete Th de FMDV potenciado UBITh® (SEQ ID NO: 90) para 5:1 y 10:1 para los grupos 15 y 16, respectivamente.

En resumen, todos los animales en todos los grupos control de placebo o negativos (sin inyección) se infectaron por la cepa FMDV 0Ta¡wan ya en el día 2 en el desafío, lo que indica la validez de todas las pruebas de desafío. Una protección total de todos los cerdos en todos los grupos experimentales se observó, tal como se demuestra por los signos clínicos negativos en todo el período monitoreado, y señales negativas por el ELISA FMDV NS, a pesar de la aplicación de una dosis 10X del aislamiento viral de FMDV superior a la cantidad requerida por la OIE en estos estudios de desafío. El cálculo de PD50 a lo largo del estudio de dosificación indicó por lo menos una PD50 de >11.23 en los grupos II y IV.

De 30 péptidos de epítopos Th de FMDV (SEQ ID NO: 34-63), tres péptidos Th de FMDV se seleccionaron (SEQ ID NOs: 61-63) para una protección efectiva de los cerdos en el desafío viral con FMDV. La presentación de estos tres péptidos de epítopos Th porcinos de FMDV se potenció al utilizar un diseño tipo casete al enlazar estos tres péptidos a través de un espaciador de lisina que además se enlazó al UBITh® (SEQ ID NO: 24) en su extremo N terminal, como se muestra en la SEQ ID NO: 90. Tales péptidos de epítopos Th de FMDV pueden complementarse al inmunógeno peptídico de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV en relaciones variables al inmunógeno peptídico de células B para ofrecer protección contra FMDV en el desafío viral. En el Estudio V de la prueba de desafío, una protección total se logró en presencia de 10% de péptidos de epítopos Th endógenos cuando la composición peptídica de epítopos de células B se presenta ya sea como péptido de serotipo O monovalente (SEQ ID NO: 25, 2570 kb), o como formulación combinada de serotipos O (SEQ ID NOs: 25, 28 y 27), o como formulación de combinación de serotipos multivalentes O y Asia 1 (SEQ ID NOs: 25, 28, 27 and 29) lo que indica la adaptabilidad en la inmunogenicidad de los péptidos de epítopos de células B de VP1. b. Estudios de desafío conducidos en bovinos: En los bovinos, el desafío viral se introdujo por una inyección intramuscular modificada, en el dorso del cuello del animal, de 1 x 104 TCID50 de FMDV (Unidad Infecciosa Bovina o BIU). La cepa OS/99 se utilizó para el desafío de serotipo O y la cepa Asia 1 altamente virulenta se utilizó para el desafío de serotipo Asia 1. Los animales se examinaron diariamente, en el desafío viral después de recibir una administración única de las formulaciones de vacunas contra FMDV respectivas a 28 días, monitoreando temperaturas rectales, y una puntuación de protección con base en el tiempo de aparición y se determinó el número y severidad de las lesiones. Todos los experimentos con animales vivos se realizaron bajo los lineamientos del Ministerio de Agricultura, PRC. Modificaciones de la dosificación, tal como utilizar dosis 2X, 1X y 0.5X de la vacuna de prueba, también se utilizaron para la valoración de una potencia de la formulación particular. Para una rápida selección de formulaciones con eficacia protectora, se utilizó 1X. Para la valoración de la eficacia de formulaciones de vacuna, los animales se dividieron en grupos de 3 a 5 animales, dependiendo del diseño experimental y disponibilidad de los animales al momento del estudio.

En el Estudio I, los animales en los grupos 1 a 4 (como se muestra en la Tabla 26) con formulaciones de vacunas peptídicas que contenían el inmunógeno peptídico de grupos de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV optimizado (SEQ ID NO: 25) como el componente clave de la formulación de vacuna en ausencia de todo péptido de epítopos Th de FMDV endógeno, o en presencia de 10% de péptidos de epítopos Th exógenos derivados de proteínas toxoides DT, TT y PT fueron incapaces de ser protegidos en el desafío con cepa de serotipo Oos/99 de FMDV. Con las formulaciones de vacunas contra FMDV basadas en epítopos de células B y T de componentes múltiples optimizadas, para una vacuna de emergencia de administración única, cuatro estudios de desafío adicionales se condujeron para evaluar la eficacia protectora para las formulaciones representativas seleccionadas, previamente probadas en el Ejemplo 9, como se muestra en la Tabla 26.

En ocho (8) grupos (grupos 6-8 y 10-14 de Estudios II y III) se utilizó FMDV Oconsensus (SEQ ID NO: 25) como el inmunógeno de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV. En el Estudio IV (grupo 16) se utilizó FMDV Oconsensusi Oozk, Ok/lyanmar (SEQ ID NOS. 25, 28 y 27) COITIO el inmunógeno de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV (en igual proporción en peso). En el Estudio V (grupo 18) se utilizó FMDV Oconsensus, Oozk, 0Myanmar, Asial j¡angsu y AGansu (SEQ ID NOs: 25, 28, 27, 29 y 31 ) como el inmunógeno de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV (en igual proporción en peso).

En todas estas formulaciones, excepto por los grupos control de placebo y los grupos experimentales en el Estudio I, los péptidos de grupos de epítopos Th de FMDV endógenos con las SEQ ID NOs: 34-63, (30 Th) para el grupo 10 del Estudio III; péptidos con las SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51 y 53-60 (21 Th) para el grupo 11 del Estudio III; una mezcla de péptidos de casetes Th de FMDV potenciado UBITh® con las SEQ ID NO: 88 y 89 para los grupos 6 a 8 del Estudio II, y una mezcla de otros cuatro péptidos Th de FMDV de casete con las SEQ ID NOs: 91, 93, 94 y 95 para el grupo 16 del Estudio IV y grupo 18 del Estudio V, se agregaron a los componentes de epítopos de células B de VP1 de FMDV como se indica con detalle y como se muestra en la Tabla 26.

Los grupos 6, 7 y 8 del Estudio II se probaron para potencia de formulaciones de vacunas con administración a los animales, en los grupos respectivos, de 2 mi, 1 mi, 0.5 mi por dosis de las formulaciones de vacunas cuando 4 de 5, 4 de 5, y 3 de 5 animales se protegieron en los grupos respectivos, lo que indica una potencia significativa de la formulación de vacuna.

En resumen, todos los animales en todos los grupos control de placebo se infectaron por la cepa de FMDV Oos/99 o Asia 1 empleada para el estudio de desafío ya en el día 2 en el desafío, lo que indica la validez de todas las pruebas de desafío. Una protección significativa (4 de 5, o 3 de 5) o total se logró en todos los grupos experimentales, tal como se demuestra por los signos clínicos negativos en los animales protegidos en todo el período monitoreado. Fuimos capaces de seleccionar de treinta (30) péptidos de epítopos Th de FMDV (SEQ ID NO: 34-63), los veintiuno (21) (SEQ ID NOs: 34-39, 44, 46-51 , 53-60 (21 Th) en igual proporción (en peso), los quince (15) Th (SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63) (15 Th) en igual proporción (en peso) y finalmente los seis (6) (SEQ ID NOs: 34, 36, 37, 48, 50, 53) (6 Th) péptidos Th de FMDV en igual proporción (en peso) para una protección efectiva sobre un antecedente genético diverso del ganado. La presentación de estos quince y hasta seis (6) péptidos de epítopos Th de FMDV bovino se potenció al elaborar un diseño tipo casete al enlazar tres péptidos Th a través de un espaciador de lisina y luego enlazar ese al UBITh® (SEQ ID NO: 24) en su extremo N terminal como péptidos de casete Th de FMDV (SEQ ID NOs: 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95). Tales péptidos casete de epítopos Th de FMDV pueden complementarse al inmunógeno peptídico de epítopos de células B derivado de VP1 de FMDV en 10 o 20% para ayudar a montar la muy necesaria inmunidad por células T para FMDV. En los Estudios IV y V, la protección de 4 de 5 animales para los grupos 16 y 18 por la cepa de FMDV serotipo Oos/99 (Estudio IV) o cepa altamente virulenta FMDV Asia 1 (Estudio V), respectivamente, se logró en presencia de 10% de péptidos de epítopos Th endógenos seleccionados de 12 epítopos Th de FMDV que se presentaron en forma de casete en cuatro péptidos potenciados UBITh® (SEQ ID NOs: 91 , 93, 94, 95) en tanto que la composición peptídica de epítopos de células B se presentó ya sea como formulación combinada de serotipo O (SEQ ID NOs: 25, 28 y 27), o como formulación multivalente de serotipos O, Asia 1 y AGansu (SEQ ID NOs: 25, 28, 27, 29 y 31) lo que indica la adaptabilidad en la inmunogenicidad de los péptidos de epítopos de células B de VP1.

EJEMPLO 11 PROSPECTOS DE PRODUCTOS DE MUESTRA PARA VACUNAS MULTIVALENTES DE FMDV UBITH®, VACUNA TRIVALENTE DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS PARA FIEBRE AFTOSA (FMD) UBITH® (BRASIL) PARA PREVENIR LA INFECCIÓN POR VIRUS/A24/VIRUS C,NDAIAL TIPOS O DE FMD DE BRASIL EN BOVINOS Los siguientes son prospectos de producto de muestra para vacunas multivalentes contra FMDV UBITH®, vacunas peptídicas sintéticas contra fiebre aftosa (FMD) UBITH® en Brasil y China. a. Brasil EMULSIÓN ESTÉRIL AGUA EN ACEITE PARA INYECCIÓN PRECAUCIÓN: para uso veterinario solamente.

DESCRIPCIÓN: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (Brasil) es una vacuna trivalente de emulsión agua en aceite que contiene tres construcciones peptídicas sintéticas de VP1 de FMD UBITh®. Cada construcción peptídica se compone de un péptido sintético que tiene un epítopo VP1 inmunodominante del virus de fiebre aftosa (FMDV) de los serotipos de Brasil O, A24 y C indatai basada en las necesidades de las regiones específicas de Sudamérica, que se enlaza por síntesis a un epítopo UBITh®, un péptido de células T cooperadoras (Th) artificial, como antígeno. Cuatro péptidos Th adicionales se incluyen para potenciar además la inmunidad mediada por células hacia estos tres serotipos de FMDV. Las tres construcciones VP1 de FMD UBITh® se mezclan en igual proporción y se complementan con una pequeña fracción de la mezcla de las cuatro construcciones Th. La mezcla de construcciones sintéticas relacionadas con los epítopos B y T de FMDV entonces se mezcla con un adyuvante oleoso para formar una emulsión agua en aceite.

INDICACIONES DE USO: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (Brasil) se utiliza para la prevención de la infección por el virus de fiebre aftosa serotipos Brasil O, A 24 y C Indaial del ganado.

DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (Brasil) La formulación de vacuna se administra mediante inyección intramuscular en el área del cuello delante del hombro. Manténgase tan estrechamente como sea posible un ángulo de 45 grados entre la aguja y la superficie cutánea para evitar que la vacuna salga del orificio de la aguja cuando la aguja se retira. Se recomienda una sola dosis para uso de emergencia. Para ganado sin vacunación previa contra FMD, deben administrarse dos inmunizaciones de 2 mi con diferencia de 4-5 semanas para incrementar la inmunidad y prolongar la respuesta inmune y, de esta manera, proporcionar una mejor protección contra la infección por FMDV. Puede administrarse una inmunización adicional cada 6 meses posteriormente. En un área con animales infectados por FMDV, se recomienda la revacunación cada 6 meses. La dosificación suministrada es de 2.0 mi.

INSTRUCCIONES DE USO • Antes de su uso, dejar que el producto de vacunación alcance la temperatura ambiente.

· Mezclar el contenido de vacunación exhaustivamente antes de utilizarse.

• Remover el contenido con jeringas y agujas estériles.

• Usar todo el contenido inmediatamente una vez que la botella se abre.

Destruir los recipientes y todo el contenido sin utilizar por un procedimiento aprobado por los reglamentos gubernamentales. b. China Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (China) para prevenir la Infección por Virus de FMD en China Tipos O / Asia 1 / Añansn en el Ganado Emulsión Estéril Agua en Aceite para Inyección PRECAUCIÓN: para uso veterinario solamente.

DESCRIPCIÓN: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (China) es una vacuna trivalente de emulsión agua en aceite que contiene tres construcciones peptídicas sintéticas de VP1 de FMD UBITh®. Cada construcción peptídica se compone de un péptido sintético que tiene un epítopo VP1 inmunodominante del virus de fiebre aftosa (FMDV) de los serotipos de China Tipo O, Asia 1 y A Gansu basada en las necesidades de las regiones de China y Asia, que se enlaza por síntesis a un epítopo UBITh®, un péptido de células T cooperadoras (Th) artificial, como antígeno. Cuatro péptidos Th adicionales se incluyen para potenciar además la inmunidad mediada por células hacia estos tres serotipos de FMDV. Las tres construcciones VP1 de FMD UBITh® se mezclan en igual proporción y se complementan con una pequeña fracción de la mezcla de las cuatro construcciones Th. La mezcla de construcciones sintéticas relacionadas con los epítopos B y T de FMDV entonces se mezcla con un adyuvante oleoso para formar una emulsión agua en aceite.

INDICACIONES DE USO: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (China) se utiliza para la prevención de la infección por el virus de fiebre aftosa serotipos China Tipo O/Asia 1/A Gansu del ganado.

DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN: Vacuna Trivalente Peptídica Sintética para Fiebre Aftosa (FMD) UBITh® (China) se administra mediante inyección intramuscular en el área del cuello delante del hombro. Manténgase tan estrechamente como sea posible un ángulo de 45 grados entre la aguja y la superficie cutánea para evitar que la vacuna salga del orificio de la aguja cuando la aguja se retira. Se recomienda una sola dosis para uso de emergencia. Para ganado sin vacunación previa contra FMD, deben administrarse dos inmunizaciones de 2 mi con diferencia de 4-5 semanas para incrementar la inmunidad y prolongar la respuesta inmune y, de esta manera, proporcionar una mejor protección contra la infección por FMDV. Puede administrarse una inmunización adicional cada 6 meses posteriormente. En un área con animales infectados por FMDV, se recomienda la revacunación cada 6 meses. La dosificación suministrada es de 2.0 mi.

INSTRUCCIONES DE USO • Antes de su uso, dejar que el producto de vacunación alcance la temperatura ambiente.

• Mezclar el contenido de vacunación exhaustivamente antes de utilizarse.

• Remover el contenido con jeringas y agujas estériles.

• Usar todo el contenido inmediatamente una vez que la botella se abre.

• Destruir los recipientes y todo el contenido sin utilizar por un procedimiento aprobado por los reglamentos gubernamentales.

Tabla 1 Secuencias optimizadas de VP1 de FMDV para su incorporación en vacunas contra FMD UBITh® de diseño para presentación de epítopos de células B G o n o en O :x o 3 0_' - ~ O CD > en tu' e 3 n C DD en > o Tabla 3 Ejemplos de ¡nmunógenos peptídicos de FMDV derivados de secuencias de VP1 de FMDV de diversos serotipos (O, Asia 1 , A y C) de la misma estructura de secuencias de aminoácidos Tabla 4 Péptidos Th endógenos de FMDV derivados de FMDV O, cepa TAW/2/99 (Entrada GenBank No. AJ539137) Tabla 5 Homólogos ejemplares de péptidos Th endógenos de FMDV derivados de la misma estructura de secuencias de aminoácidos < ¡l i l i 1 I I \ i | i ! i ! r ¡ Tabla 6 Ejemplos de análogos funcionales de péptldos Th endógenos de FMDV Tabla 7 (1 de 3) Biblioteca de Péptidos Th endógenos de FMDV Tabla 7 (2 de 3) Biblioteca de Péptidos Th endógenos de FMDV Tabla 7 (3 de 3) Biblioteca de Péptidos Th endógenos de FMDV UBITh® 3 = SEQ ID NO. 24 Tabla 8 Ejemplos de inmunógenos peptídicos de FMDV derivados de secuencias de VP1 de FMDV de serotipos A, O y Asia como una sola secuencia o como secuencia de bibliotecas combinatorias N134 de la secuencia nativa se reemplaza por C.

Q158 de la secuencia de VP1 se reemplaza por C T134 de la secuencia nativa se reemplaza por C.

R158 de la secuencia nativa se reemplaza por C.

UBITh = SEQ ID NO.24 Tabla 9 Optimización de péptido antigénico objetivo de FMDV por Conformación de Secuencias y Elementos inmunoestimulantes N134 de la secuencia nativa se reemplaza por C.

Q158 de la secuencia de VP1 se reemplaza por C.

No. de animal que responde del grupo de las 3 a 5 semanas postinmunización inicial. Resultados de prueba para sueros combinados de animales reactivos en ELISA. Suero para ensayo de índice de neutralización diluido 1 :10.

Tabla 10 Biblioteca de péptidos VP1 inmunogénicos para inmunogenicidad mejorada y amplitud de neutralización de FMDV a T-J58 de la secuencia nativa se reemplaza por C. b T-134 de la secuencia nativa se reemplaza por C.

C Rl58 de la secuencia nativa se reemplaza por 0. d Semanas postinmunización Inicial. e Reactividades para sueros combinados de animales reactivos en ELISA, f Suero para ensayo de índice de neutralización diluido 1 : 100.

Los inmunógenos sintéticos optimizados de FMDV de UBI en cobayos suscitaron anticuerpos neutralizantes de manera simultánea contra múltiples serotipos, tales como A, y Asia 1 , lo que muestra el potencial para una amplia eficacia inesperada entre serotipos.

Tabla 11 Péptido inmunogénico de VP1 de consenso para una neutralización amplia de FMDV a T158 de la secuencia nativa se reemplaza por C. b Semanas postinmunización inicial. c Reactividades para sueros combinados de animales reactivos en ELISA, d Suero para ensayo de índice de neutralización diluido 1 :100.

La vacuna sintética optimizada contra FMDV O de UBI, que emplea la secuencia de consenso derivada de múltiples secuencias de serotipo O, puede suscitar potentes anticuerpos neutralizantes ya a las 3 semanas postinmunización inicial contra múltiples serotipos, tales como A, Asia 1 y O, incluyendo 0Taiwan· Tabla 12 Protección contra desafío con FMDV OTaiwan por vacuna contra FMDV OConsensus de UBI La vacuna UBITh FMDV 0C0nsensus, después de dos inmunizaciones en las semanas 0 y 3, protegieron efectivamente todos (15/15) los cerdos vacunados en el desafío con FMDV 0Ta¡wan en estudios conducidos en cuatro grupos experimentales en tres institutos internacionales. Todos (10/10) los animales de control negativo se infectaron en el día 2 después del desafío viral.

Tabla 13 Amplia neutralización de FMDV O por sueros en la prueba de desafío UBI-USDA PIADC en porcinos Todos los sueros se diluyeron 1/100 y se probaron en diluciones en serie del subtipo de FMDV O indicado. Los valores del índice de neutralización mostrados son el Log10 de la TCID50 de punto final, en donde se inactivó el 50% del virus de entrada.

La vacuna mixta UBITh FMDV O en porcinos suscitó anticuerpos neutralizantes más ampliamente protectores contra múltiples subtipos de FMDV O después de dos inmunizaciones en las semanas 0 y 3.

Tabla 14 Formulaciones de vacunas basadas en inmunógenos de FMDV VP1 para vacunas mono, bi y trivalentes que se */orientan a serotipos específicos diseñado a la medida de necesidades regionales Contenido de inmunógeno = 25 ug/ml que contiene igual proporción en peso de inmunógenos peptídicos de VP1 individuales Cantidad de inmunógeno por dosis para porcinos = 25 mg/ml/dosis/IM Cantidad de inmunógeno por dosis para bovinos = 100 pg/2 mi/dosis/IM IM = (Intramuscular) Tabla 15 Valoración de ¡nmunogenicidad después de dos inyecciones para péptidos inmunogénicos de VPI de FMDV en cerdos por ensayos de ELISA basados en péptidos objetivo y títulos de anticuerpos neutralizantes Tabla 16 Valoración de ¡nmunogenlcidad después de dos inyecciones para péptidos inmunogénicos de VPI de FMDV en bovinos por ensayos de ELISA basados en péptidos objetivo y títulos de anticuerpos neutralizantes Tabla 17 Valoración de inmunogenicidad después de dos inyecciones para péptidos ¡nmunogénicos de VPI de FMDV en bovinos por ensayos de ELISA basados en péptidos objetivo y títulos de anticuerpos neutralizantes Tabla 18 (1 de 3) Valoración de inmunogenicidad funcional con una sola administración de formulaciones de vacunas contra FMDV que contienen péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV y B derivados de VP1 de FMDV en cerdos por ELISA basado en péptidos objetivo (O consenso 2570a) y ensayo de neutralización contra la cepa FMDV O Taiwán Tabla 18 (2 de 3) Tabla 18 (3 de 3) Tabla 19 (1 de 8) Valoración de inmunogenicidad funcional con una sola administración de formulaciones de vacunas contra FMDV que contienen péptidos de grupos de epítopos Th endógenos de FMDV y B derivados de VP1 de FMDV en bovinos por ELISA basado en péptidos objetivo (O consenso 2570a) y ensayo de neutralización contra la cepa FMDV O Taiwán Tabla 19 (2 de 8) Tabla 19 (3 de 8) Tabla 19 (4 de 8) Tabla 19 (5 de 8) Tabla 19 (6 de 8) Tabla 19 (7 de 8) Tabla 19 (8 de 8) FMDV O Campos + A Argentina 2001 + tido de epítopos de C Indaial en igual lulas B de FMDV : proporción (en ptidos de epítopos peso) para su uso i Th de FMDV en en Argentina oporción 10:1 (p:p) Seq ID Nos: 26, 33, (25 + 25) mg/ml en 32 Emulsigen D FMDV O Campos + A Argentina 2001 + tido de epítopos de C Indaial en igual : lulas B de FMDV : proporción (en , ptidos de epítopos peso) para su uso l Th de FMDV en en Argentina i oporción 10:1 (p:p) Seq ID Nos: 26, 33, (25 + 2.5) pg/ml en 32 Emulsigen D Tabla 20 Estudios de desafío conducidos en cerdos IM = Intramuscular Tabla 21 Temperatura corporal de cada cerdo registrada durante 1 ~ 14 días después del desafío.

Nota: DPD = Día postdesafío.

Tabla 22 Títulos de anticuerpos de neutralización para animales de estudio a: Semanas postvacunación b: Días postdesafío c: Media geométrica Tabla 23 Resultados de ELISA anti-FMDV NS Nota: SPV = Semanas postvacunación; DPD = Días postdesafío.

Tabla 24 (1 de 2) Resultados de titulación por ELISA con anticuerpos anti-VP1 OSPV: A450nm a dilución 1:100. Otro punto en el tiempo: Título Log10 Tabla 24 (2 de 2) Resultados de titulación por ELISA con anticuerpos anti-VP1 OSPV: A450nm a dilución 1:100. Otro punto en el tiempo: Título Log10 a: Semanas postvacunación b: Días postdesaíío Tabla 25 (1 de 5) Evaluación de eficacia de vacunas contra FMDV a través de desafíos de cerdos que recibieron una sola administración, para formulaciones de vacunas contra FMDV que contienen péptidos de epítopos B derivados de VP1 de FMDV y Th endógenos de FMDV con aislamientos de FMDV de serotipos relevantes Tabla 25 (2 de 5) i i l i _ i i l i i l l i l i . . i i l l l i i I i l l : i I : i : I : : i i . l I . i i II i l , i l l , i li i l l i l : i I : , l i I : i : I : : i i i . l I l I : i : II I . i, i i l l i i i l l i , i . . l l l l i i : i l l l ili l - , I : l l l i : l i I : : l i i . l . .

I . i i l l i Tabla 25 (3 de 5) Tabla 25 (4 de 5) i i l i i i l i l l i l . i i i l l l i i I i l l : i I I : - i : i i : . l I . i i i l l : l I : : - i : i i : . l I . l , l i l . i , i l l i l l l : l I : - I : l i i i l I : - i : i i l i : i . i, i, . i, l l i i l l i l . l i . . i i i l l : l I : I : - i i i : . l I . . i i l i i Tabla 25 (5 de 5) Tabla 26 (1 de 4) Evaluación de eficacia de vacunas contra FMDV a través de desafíos de bovinos que recibieron una sola administración de formulaciones de vacunas contra FMDV que contienen péptidos de epítopos B derivados de VP1 de FMDV y Th endógenos de FMDV con aislamientos de FMDV de serotipos relevantes i i l i i i l i l i i l i l i . l l i i I l i I l i , l i l l i I i i i l ii , l I : i l I l ll l i l, . I i l i I i i I .

I ili l l i l l l i l i l i I il l l I . i . i l i i i i , l i l i i I i i i i l I : i l i l l i l i , i i . l , i l i i l i i i i l l l l i . l l l i i l i : i li l ll l l i i i i , l , . ii i I I : , l ii i , l i : ili i , . l : , i l I ili l l i . l l i l . i i i l i l i i i , il . l i l i i l i , l l i i i i , l i l ili l i l l l i . i , l l i l l l l l : i i , i i l , , l i l l i .

Tabla 26 (2 de 4) Tabla 26 (3 de 4) i i l i i l i i l . i l i l i l l i l i i i I i l l I : : i - I : i l i i : : l I . l i i l l I : i - , , , - i , l ili l I i l i : i , l : i l l i l I : . i i l i i i l i I : - , i I : l l : i l i I : - , , - , , , - , - , i l i , , , , , , i l I : , - i : l l l i , l i l i i l li l i l I . i l l l i i i i i l i l. i i i l i l i i , I : l l i . i , : , , , - : i : , : : , i , , , , l i , l i l I : , - i l i : l i i : . l i l I . . i l l i l l l i i l i l . I : l l , , , : i , , , , I - i l i : : . l I . l i l l Tabla 26 (4 de 4)

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna contra fiebre aftosa (FMD), que comprende a) un péptido inmunogénico sintético que comprende una secuencia de epítopo de células B en bucle de VP1 de FMDV y una secuencia de epítopo Th; b) un péptido separado que comprende una secuencia de epítopo sintéticos de célula T cooperadora de FMDV; y c) un vehículo de suministro o adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i) SEQ ID NOs: 1 o 2; ¡i) un homólogo de (a); y iii) cualquier combinación de (a) o (b).

2. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) comprende ia secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

3. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

4. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el homólogo en (b) es un homólogo de la SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3 a 23.

5. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) se enlaza de manera covalente en el extremo terminal carboxilo de la secuencia de epítopo Th.

6. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 5, en donde la secuencia de epítopo Th es la SEQ ID NO: 24.

7. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 5, en donde el epítopo de célula T cooperadora se enlaza de manera covalente al antígeno peptídico a través de un espaciador que comprende un residuo de lisina épsilon.

8. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 5, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 25 a 33 y combinaciones de las mismas.

9. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 5, en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 34 a 95 y combinaciones de las mismas.

10. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la cantidad total de antígeno peptídico en (a) se encuentra entre aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1 mg por dosis.

11. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el vehículo de suministro o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en Montanide ISA 50V, Polioxietileno (20) monooleato de sorbitán, Emulsigen, Emulsigen D y un oligonucleótido de CpG.

12. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 8, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29 y/o combinaciones de las mismas.

13. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 9, en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 34-63, 90 y/o combinaciones de las mismas.

14. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29 y/o combinaciones de las mismas, y en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 34-63, 90 y combinaciones de las mismas.

15. Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 14 al animal.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el animal es un cerdo.

17. Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 14 al animal.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el animal es un cerdo.

19. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 8, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) es las SEQ ID NOs: 25, 27, 28, 29, 31 y/o combinaciones de las mismas.

20. Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 19 al animal.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el animal es una vaca.

22. Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 19 al animal.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde el animal es una vaca.

24. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 8, en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) es las SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 y/o combinaciones de las mismas.

25. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 9, en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 91-95 y combinaciones de las mismas.

26. La vacuna contra FMD de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el péptido inmunogénico sintético en (a) es las SEQ ID NOs: 26, 30, 32, 33 y/o combinaciones de las mismas, y en donde el péptido de epítopo de célula T cooperadora de FMDV en (b) es las SEQ ID NOs: 91-95 y combinaciones de las mismas.

27. Un método para suscitar una respuesta inmune en un animal, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 26 al animal.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el animal es una vaca.

29. Un método para proteger a un animal de la infección por FMD, que comprende proporcionar una sola administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de la vacuna de la reivindicación 26 al animal.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el animal es una vaca.