KR20150084993A - 구제역 (fmd)에 대한 합성 펩티드-기재 응급 백신 - Google Patents

Abstract

합성 FMD 펩티드 면역원 및 이를 함유하는 조성물이 개시된다. 이러한 합성 FMD 펩티드 면역원을 사용하는 동물에서의 FMD 감염의 검출, 치료 및 예방 방법이 또한 개시된다. 구체적 실시양태에서, 구제역에 대한 펩티드-기재 응급 백신 및 이의 제제가 기술된다. 다양한 백신 제제가 FMDV VP1 단백질로부터 유래된 펩티드들의 혼합물을 함유하고, 이때 각각의 펩티드는 각각의 펩티드의 면역원성을 강화하기 위한 인공 Th 에피토프에 연결된 B 세포 FMDV 중화/수용체 결합 에피토프 서열을 함유한다. 바이러스 면역원을 함유하는 개시된 백신 제제에 FMDV 단백질로부터 유래된 FMDV 내인성 Th 에피토프를 나타내는 펩티드들, 이의 상동체 및 기능성 유사체의 혼합물이 임의적으로 보충될 수 있다. 이같은 바이러스 펩티드 조성물이 허용되는 전달 시스템에서 백신 제제로서 제조되고, 단일 투여만으로 FMDV 시험감염 시 감염으로부터 돼지 및 소를 보호하는 것을 제공할 수 있다.

Description

구제역 (FMD)에 대한 합성 펩티드-기재 응급 백신{SYNTHETIC PEPTIDE-BASED EMERGENCY VACCINE AGAINST FOOT AND MOUTH DISEASE (FMD)}

본 개시내용은 구제역 (FMD) 방제를 위한 구제역 바이러스 (FMDV)에 대한 펩티드-기재 응급 백신 및 이의 제제에 관한 것이다.

구제역 (FMD)은 가장 전염성인 동물 질병이다. 병원체인 구제역 바이러스 (FMDV)는 4개의 캡시드 단백질 (VP1-VP4) 및 비-구조 폴리펩티드 (2A-2C 및 3A-3D)를 코딩하는 양성 센스 RNA 게놈이 있는 피코르나비리다에(Picornaviridae) 과의 아프토바이러스(aphthovirus)이다 (문헌 [Carrillo, C. et al., 2005]에서 검토됨).

FMDV는 급속하게 복제되고, 소, 돼지, 양 및 염소와 같은 발굽이 갈라진 동물을 포함하는 감염된 동물 및 접촉 중인 감수성 동물 사이에서 공기를 통해 확산될 수 있다 (에어로졸 전파성). FMD는 국제 수역 사무국 (Office International des Epizooties: OIE)의 동물 감염성 질병 목록(A list of animal infectious disease) 상에 있고, 동물 및 동물 제품의 국제 무역에 대한 가장 중요한 제약으로서 인식되었다. 현재, FMD는 감염된 동물 및 노출된 동물의 검역 및 박멸에 의해, 그리고, 대부분의 국가에서, 화학적으로 불활성화된 바이러스 조성물의 백신 접종에 의해 제어된다. 이의 존재로부터 초래되는 해로운 경제적 결과로 인해, 이러한 질병이 없는 국가들은 백신 접종 없이 이러한 상태를 유지하기 위한 다수의 조치를 도입하였다.

FMDV의 7가지의 독특한 혈청형이 기술되었고, 각각의 혈청형은 다양한 하위유형으로 추가로 나뉜다. 이러한 혈청형에는 A, O, C, 아시아, 및 남아프리카 유형 SAT-1, 2, 및 3이 포함되고, A, O, 및 아시아가 가장 통상적이다. 바이러스의 유전적 복잡성 및 다양성에 더하여, FMDV는 높은 비율로 무작위로 돌연변이될 수 있다.

FMDV에 대한 백신을 제제화하는 것에서의 상당한 어려움은 이러한 바이러스의 현저한 항원 다양성 및 혈청형들 사이의 교차-보호의 결여이다. 즉, 1가지 혈청형의 바이러스에 대해 백신 접종되거나 또는 이로부터 회복된 동물이 나머지 6가지 혈청형의 바이러스로의 감염에 대해 감수성이다. 또한, 혈청형 내에서의 항원 변동 정도는 1가지 하위유형에 대해 효과적인 백신이 동일한 혈청형 내의 또 다른 하위유형에 대해 보호적이지 않을 수 있는 정도이다.

현재의 FMD 백신은 각각의 관련된 혈청형 또는 하위유형의 기준 균주를 포함하는 불활성화 바이러스들의 혼합물을 함유하고, 이는 국지 순환에 존재하는 바이러스 균주들을 모니터링함으로써 결정된다. 신생 FMD 변이체로부터의 돌발을 방지하기 위해, 현장 단리물이 주기적으로 모니터링되어야 하고, 생산 중인 현재의 백신에 비교되어야 한다. 따라서, 백신이 현행성이고 효과적이라는 것을 확실히 하기 위해, 불활성화 FMD 바이러스 백신의 생산은 (1) 백신에 포함될 여러 바이러스 균주를 성장 및 불활성화시키는 것, (2) 각각의 불활성화 균주의 역가 및 효능을 모니터링하는 것, 및 (3) 새로운 신생 변이체에 의한 보호 효능 상실을 방지하기 위해 현재의 균주를 포함하도록 주기적으로 백신 제품을 다시 제제화하는 것을 필요로 한다.

효율적인 불활성화 바이러스 백신을 생산하고 유지시키는 것은 FMDV 혈청형들 사이의 상당한 항원 변동의 관점에서 성가시고 복잡하다. 불활성화 FMDV 백신과 연관된 여러 공지된 쟁점 및 단점에는 생물재해 및 생물보안 위험, 제품 불안정성 및 가변성, 및 치료된 동물에서의 의도치 않은 해로운 부작용이 포함된다.

예를 들어, 불활성화 바이러스 백신의 제작은 생물재해/생물보안 위험을 일으키는데, 인접 환경의 오염을 방지하기 위해 바이러스가 고-봉쇄 설비에서 제조되어야 하기 때문이다. 추가적으로, 불활성화 바이러스 제품의 무해성이 완전히 보장될 수 없다. 실제로, 유럽에서의 여러 최근의 FMDV 사례가 불완전하게 불활성화된 바이러스로 추적되었다. 이러한 잠재적인 생물재해/생물보안 위험은 적격인 백신 공급원의 수를 소수로 제한한다. 이같은 제한은 지역이 돌발에 효과적 및 즉각적으로 반응하는 능력을 방해할 수 있다.

현재의 FMD 백신은 제품 불안정, 뿐만 아니라 로트-대-로트 가변성을 또한 겪는다. 상기 논의된 바와 같이, 백신이 모니터링되어야 하고, 현재의 및 신생 FMDV 균주 양쪽 모두를 포함하도록 주기적으로 다시 제제화되어야 한다. 또한, 세계의 각각의 지역은 임의의 소정의 시간에 상이한 현재/신생 FMDV 균주로부터의 보호를 필요로 할 것이다. 따라서, 불활성화 바이러스 백신의 복합적이고 규정되지 않은 조성물이 세계적으로 생산되고 있다. 불활성화 바이러스 백신의 이러한 복합적인 혼합물은 면역역가를 확실히 하기 위해 규칙적인 간격으로 계속 점검되어야 한다.

상기 쟁점들에 더하여, 현재의 FMDV 백신은 치료된 동물에서 의도치 않은 해로운 부작용을 야기하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 알레르기 반응, 아나필락시스 쇼크 및 자발적인 사망의 보고가 현재의 백신으로 치료된 동물에서 보고되었다.

불활성화 바이러스 용해물을 기반으로 하는 기존의 상업용 백신의 단점은 더욱 안전하고 더 양호하게 규정된 서브유닛 제품을 생산하는 연구를 장려하였다 (Brown, F. 1992). 그러나, 불활성화 바이러스에 대한 허용되는 대체물이기 위해, 이같은 서브유닛 제품은 불활성화 바이러스 백신과 면역원성이 등가이어야 하고, 항원 변이체에 대한 광범위한 보호 스펙트럼을 제공하여야 한다. 가장 중요하게는, 서브유닛 제품은 FMD 응급 백신으로서 적격이기 위해 단일 백신 투여 후에 시험감염(challenge) 연구에 대한 OIE 가이드라인을 충족시킬 필요가 있다.

바이러스 용해물을 기반으로 하는 기존의 상업용 FMD 백신과 연관된 문제들 중 일부를 극복하기 위해, 본 발명가 및 발명가의 연구 팀은 FMDV 시험감염으로부터 돼지를 보호하기 위해 합성 펩티드를 기반으로 하는 FMDV 백신을 개발하는 것에서 지난 15년에 걸쳐 상당한 발전을 이루어냈다. 특히, 본 발명가는 최적화된 VP1 루프화(looped) B 세포 에피토프 펩티드를 함유하는 제제를 사용하여 FMDV에 대한 광범위한 중화 항체를 도출시킬 수 있는 효과적인 FMDV 백신을 성공적으로 개발하였다. 펩티드를 인공 T 헬퍼 에피토프에 공유결합으로 연결시킴으로써 이러한 VP1 루프화 B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성이 추가로 강화될 수 있다 (Wang, CY and Shen, M, 2000; Wang, CY et al., 2001; Wang, CY, et al., 2002). 이러한 백신은 제제의 다중 투여 후에 FMDV 시험감염으로부터 돼지를 효과적으로 보호하는 것으로 나타났다 (Wang, CY, et al. 2002). VP1 루프화 B 세포 에피토프 펩티드 제제는 고전적인 FMDV 바이러스 균주로부터 동물을 보호하는 것에서 중요한 백신인 것으로 증명되었다.

OIE 프로토콜 하에 "응급" FMD 백신으로서 적격이기 위해, 제제는 오직 단일 투여 후에 FMD 혈청형에서의 광범위한 항원 적용범위와 함께 신속한 방어 면역을 유도하여야 한다. VP1 루프화 B 세포 에피토프 펩티드 제제의 다중 투여는 고전적인 FMDV 바이러스 균주에 대한 효과적인 보호를 제공하지만, 제제의 단일 투여는 응급 기반으로 FMDV 시험감염에 대해 돼지를 보호할 수 없었다. 추가적으로, VP1 루프화 B 세포 에피토프 펩티드 제제는 1회 또는 2회의 투여 후에 FMDV 시험감염으로부터 소를 보호하는 것으로 나타나지 않았다 (Rodriguez, LL. et al. 2003).

FMDV에 대한 응급 용도 및 일반적인 보호 용도를 위한 안전하고 효과적인 펩티드 기반 FMD 백신 및 이의 제제의 개발을 허용하도록, 공개되어 있는 광범위한 문헌을 조사하고, FMD 응급 백신에서 요구되는 방어 면역 반응의 상관물을 확인하여 입증하는 것이 긴급하게 요구된다.

FMD에 대해 현재 이용가능한 백신의 단점 및 한계의 관점에서, 오직 단일 투여 후에 FMDV로부터 돼지 및 소를 보호할 수 있는 응급 백신 제제가 여전히 긴급하게 요구된다.

참고문헌:

본 개시내용은 동물에서의 구제역 (FMD)의 검출, 치료 및/또는 예방에 유용한 합성 펩티드에 관한 것이다. 본 개시내용의 합성 펩티드는 동물의 FMD 감염을 민감하게, 그리고 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있는 펩티드 항원을 포함한다. 이러한 합성 펩티드는 FMD 감염에 대한 방어 면역 반응의 생성을 자극하도록 함께 작용하는 B 세포 (B) 및 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프 양쪽 모두가 있는 펩티드 면역원을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 펩티드 항원, 뿐만 아니라 펩티드 면역원 양쪽 모두이다. 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 동물에서 FMD 바이러스 (FMDV)에 대한 항체의 존재를 검출하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 FMDV의 존재에 대해 양성으로 시험되는 동물 및/또는 FMDV에 대해 양성으로 시험된 동물에 노출된 동물에서 동물을 치료하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 동물에서 FMD 감염을 예방하는데 사용된다.

또한 본 개시내용은 합성 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이같은 조성물은 동물에서의 FMD의 검출, 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 샘플 내의 FMDV에 대한 항체의 존재를 검출하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 동물의 FMD 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물이다. 특정한 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 동물에서 FMDV에 대한 면역 반응을 도출시키는데 사용된다. 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 바이러스에 노출된 동물에서 FMD 감염을 예방할 수 있는 백신 조성물이다.

본 개시내용은 동물에서의 FMD 감염의 검출, 치료 및/또는 예방 방법을 또한 포함한다. 개시된 방법은 본원에 또한 개시된 합성 펩티드 및 합성 펩티드를 함유하는 조성물을 이용한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 OIE 가이드라인에 따른 응급 백신으로서 적격인 펩티드-기재 제약 조성물에 관한 것인데, 이는 조성물이 단일 투여 후에 FMD 감염에 대한 충분하고 적절한 보호를 제공하기 때문이다. 이러한 실시양태에서, 응급 백신으로서 사용될 수 있는 제약 조성물은 천연 FMD 단백질, 뿐만 아니라 내인성 T 세포 에피토프로부터 유래된 병원체 단백질 상의 항원 부위를 모방하는 펩티드 면역원을 함유한다. 기술된 제제는 표적 FMD 단백질에 대한 기능성 항체를 효율적으로 도출시켜, 동물에게 FMD 시험감염으로부터의 보호를 제공한다.

다양한 실시양태에서, 합성 펩티드 면역원은 FMDV에 대한 중화 항체를 도출시킬 수 있는 B 세포 항원 부위가 있는 VP1 루프화 펩티드 (서열 1 및 2), 이의 상동체 (예를 들어, 서열 3-23, 96-99), 및 이의 조합을 함유할 수 있다.

개시된 VP1 루프화 펩티드는 B 세포 항원 펩티드 (예를 들어 서열 25-33, 100-102)의 면역원성을 강화하도록 펩티드 항원의 아미노- 또는 카르복실- 말단에 공유결합으로 연결된 T 헬퍼 에피토프 (서열 24)를 또한 함유할 수 있다. 특정 변이에서, 숙주 세포-매개 면역을 제공하도록 T 헬퍼 에피토프를 나타내는 펩티드들의 혼합물이 펩티드 면역원에 보충된다. 이같은 펩티드는 FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B 및 3D 단백질로부터 유래된 T 헬퍼 에피토프 (예를 들어 서열 34-63), 이의 상동체 및 기능성 유사체, 뿐만 아니라 조합형 서열에서 유래된 라이브러리 펩티드 (예를 들어 서열 64-87) 및 UBITh® 강화 카세트 형태로 디자인된 FMDV Th 에피토프 펩티드 (예를 들어 서열 88-95)를 포함한다.

본 개시내용은 동물에서 FMDV에 대한 항체 및 세포-매개 면역 반응 양쪽 모두를 도출시키는 방법을 또한 제공한다. 이같은 방법은 FMDV로의 바이러스 시험감염 시 FMDV 항체가 없는 동물에게 FMD 교차 보호를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 개시된 방법은 조합된 FMDV B 및 T 헬퍼 에피토프 펩티드 클러스터를 함유하는 제약 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 FMD 면역원성 펩티드의 저비용 제작 및 품질 제어를 위한 방법, 이를 함유하는 응급 백신 제제, 뿐만 아니라 백신 제제의 단일 투여만으로 응급 기반으로 FMDV 시험감염으로부터 동물을 보호할 수 있는 전달 시스템을 또한 제공한다.

도 1은 본원에 개시된 특정한 실시양태에 따른 FMDV 단백질 상의 B 및 Th 에피토프의 분포 및 위치를 도해하는 개략도이다. 단백질에 대한 도면에서 확인되는 아미노산 위치는 FMDV O_{타이완 (Taiwan) 99} 게놈 서열의 서열을 기초로 한다. 각각의 유전자 생성물의 명칭 (VP4, VP2, VP3, VP1+2A, 2B+2C, 3A+3B1+B2, B3, 3C 및 3D)이 확인되고, 각각의 코딩되는 단백질의 크기를 기초로 하는 상이한 길이의 백색 막대가 이어진다. B 및 T 세포 에피토프 또한 이들의 각각의 크기 (아미노산 개수) 및 에피토프의 위치 (에피토프가 유래된 단백질 내에서의 아미노산 번호)를 기초로 확인되고, 이때 각각의 에피토프는 이의 첫번째 아미노산 및 마지막 아미노산 및 이러한 단백질 내에서의 이들의 번호매김에 의해 표시된다 (예를 들어, VP4의 경우, S221-M235는 이러한 T 세포 에피토프가 VP4 단백질 내의 아미노산 위치 221에서의 세린으로 시작하여 아미노산 위치 235에서의 메티오닌으로 끝나는 아미노산 15개의 길이라는 것을 의미한다).
도 2는 본원에 개시된 특정한 실시양태에 따른 백신 제제의 발견에서 상업화까지의 개발 공정을 확인하는 순서도이다.
도 3a는 UBITh® VP1 백신 (서열 25)의 2회 투여가 제공된 소로부터의 중화 항체 (NA) 역가를 나타내는 그래프이다. 15마리의 FMDV가 없는 6-12개월령의 소를 0주 및 3주에 면역화시켰다. 0주에서 6주 사이에 매주 혈청을 수집하였고, 각각의 면역화 후의 NA 역가에 대해 검정하였다.
도 3b는 UBITh® VP1 백신 (서열 25)의 2회 투여가 제공된 돼지로부터의 중화 항체 (NA) 역가를 나타내는 그래프이다. 15마리의 FMDV가 없는 3 내지 5주령의 돼지를 0주 및 3주에 면역화시켰다. 0주에서 6주 사이에 매주 혈청을 수집하였고, 각각의 면역화 후의 NA 역가에 대해 검정하였다.
도 4a는 용량 당 27.5 ㎍/㎖으로 ISA50V2 유중수 (w/o 50/50) 에멀젼 내의 10:1 중량비의 VP1 유래 B 세포 에피토프 (O_{컨센서스 (Consensus)} 서열 25) 및 UBITh® 강화 내인성 FMDV Th 카세트 클러스터 펩티드 (서열 90)를 함유하는 UBITh® FMD 백신 제제의 단일 투여가 제공된 돼지에서의 PBMC에 의해 유도된 세포 면역 반응 (IFN-γ 생산)을 도해하는 그래프이다. 매주 동물을 출혈시켰고, IFN-γ 반응으로 백신 펩티드 항원을 회상하도록 시험관 내에서 반응하는 이의 PBMC의 능력을 실시예 3에 기술된 바와 같이 결정하였다.
도 4b는 백신이 접종되지 않은 음성 대조군 동물 (백색 원 ○)에 비교된 용량 당 27.5 ㎍/㎖으로 ISA50V2 유중수 (w/o 50/50) 에멀젼 내의 10:1 중량비의 VP1 유래 B 세포 에피토프 (O_컨센서스 서열 25) 및 UBITh® 강화 내인성 FMDV Th 카세트 클러스터 펩티드 (서열 90)를 함유하는 UBITh® FMD 백신 제제의 단일 투여가 제공된 돼지에서의 PBMC에 의해 유도된 세포 면역 반응 (IFN-γ 생산) (흑색 사각형 ■)을 도해하는 그래프이다. 시험감염 전에 제28일에 동물을 출혈시켰고, 제0일 기준선 값의 차감에 의해 최종 값을 보정하였다.

본 개시내용은 동물에서의 구제역 (FMD)의 검출, 치료 및/또는 예방에 유용한 합성 펩티드에 관한 것이다. 본 개시내용의 합성 펩티드는 동물에서 FMD 바이러스에 대한 항체를 민감하게, 그리고 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있는 펩티드 항원을 포함한다. 합성 펩티드는 FMD 감염에 대한 방어 면역 반응의 생성을 자극하도록 함께 작용하는 B 세포 (B) 및 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프 양쪽 모두가 있는 펩티드 면역원을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 펩티드 항원, 뿐만 아니라 펩티드 면역원 양쪽 모두이다. 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 동물에서 FMD 바이러스 (FMDV)에 대한 항체의 존재를 검출하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 FMDV의 존재에 대해 양성으로 시험되는 동물 및/또는 FMDV에 대해 양성으로 시험된 동물에 노출된 동물에서 동물을 치료하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 동물에서 FMD 감염을 예방하는데 사용된다.

또한 본 개시내용은 합성 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이같은 조성물은 동물에서의 FMD의 검출, 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 샘플 내의 FMDV의 존재를 검출하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 동물의 FMD 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물이다. 특정한 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 동물에서 FMDV에 대한 면역 반응을 도출시키는데 사용된다. 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 바이러스에 노출된 동물에서 FMD 감염을 예방할 수 있는 백신 조성물이다.

본 개시내용은 동물에서의 FMD 감염의 검출, 치료 및/또는 예방 방법을 또한 포함한다. 개시된 방법은 본원에 개시된 합성 펩티드 및 합성 펩티드를 함유하는 조성물을 이용한다.

a. B 세포 에피토프 - FMDV 합성 펩티드 면역원

여러 상동성 FMDV 혈청형 O 균주로부터의 VP1 구조 단백질 내의 B 세포 항원 부위를 정렬하고 평가함으로써 합성 펩티드 면역원에 대한 아미노산 서열을 수득하였다. 표 2에 제시된 정렬을 기초로, 전장 FMDV VP1 구조 단백질의 아미노산 잔기 134 내지 158에 상응하는 아미노산 25개의 항원 컨센서스 서열을 수득하였다 (서열 1). (전장 VP1 서열에 대한 아미노산 번호매김의 예를 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NP_740460에서 확인할 수 있다). 위치 134 및 158에 상응하는 아미노산은 펩티드가 내부-디술피드 루프 구조를 형성하게 하도록 시스테인 잔기로 치환되었다. 41개의 아미노산 (서열 2)을 함유하는 더 긴 FMDV 항원 컨센서스 펩티드가 이러한 정렬로부터 또한 수득되었다. 이러한 제2 컨센서스 서열은 서열 1을 포함하고, N- 및 C-말단 양쪽 모두에 추가적인 플랭킹 서열을 포함한다. 제2 컨센서스 서열은 전장 FMDV VP1 구조 단백질의 아미노산 잔기 129 내지 168에 상응하고, 이때 위치 134 및 158에 상응하는 아미노산은 시스테인 잔기로 치환된다. 표 1에 제시된 바와 같이 2개의 컨센서스 서열이 확인된다.

O, 아시아 1, 및 A 혈청형으로부터의 VP1 B 세포 에피토프에 대한 컨센서스 서열이 유사한 상동체 정렬을 통해 또한 수득되었고, 표 2에서 서열 2, 12, 및 16으로서 제시된다. 각각의 컨센서스 서열 내의 가변성 위치에 대한 아미노산은 이러한 위치에서 각각의 혈청형에서 가장 빈번하게 나타난 아미노산을 기초로 할당되었다.

합성 펩티드 면역원 서열 1 및 2의 효과적이고 허용되는 변이는 FMDV의 돌연변이체 및 변이체 균주로부터의 상응하는 서열 및 형상 요소가 있는 면역학적으로 기능성인 상동체를 포함한다. 상동성인 FMDV 항원 펩티드들은 기원 변이체인 FMDV O_타이완 균주의 VP1 구조 단백질 위치 129 내지 168 및 FMDV 혈청형 O의 다중 균주로부터 유래된 컨세서스 서열과 밀접하게 상호관련되는 아미노산 잔기를 갖는다 (Mason, PW et al., 2003). 이같은 상동체들은 서열 정렬 프로그램 예컨대 ClustalW (독일의 유럽 분자생물학 실험실(European Molecular Biology Laboratory)의 줄리 디. 톰슨(Julie D. Thompson), 토비 깁슨(Toby Gibson), 및 영국 캠브리지의 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute)의 데스몬드 히긴스(Desmond Higgins)에 의해 제조됨; 알고리즘)를 통해 쉽게 확인될 수 있다. 표 2는 FMDV O_컨센서스 서열 (2570a, 서열 2), 뿐만 아니라 O_{캄포스 ( Campos )}, O_타이완, O_{미얀마(Myanmar)}, O_{오즈크 ( Ozk )}, O_{란저우 ( Lanzou )}, 아시아 1_{윤난 ( Yunnan )}, 아시아 1_{지앙수 ( JiangSu )}, A₂₄, A_{간수 (Gansu)}, A_{진지앙 ( Xinjiang )}, C_{인다이알 ( Indaial )}, C3_{벨지움 (Belgium)}, C3_{아르헨티나 (Argentina)} 등을 포함하는 다양한 균주 및 다중 혈청형으로부터 취해진 FMDV VP1 구조 단백질 내의 22개의 항원 서열 (서열 3 내지 23)의 ClustalW 정렬을 나타낸다.

본 발명에 포함되는 VP1의 추가적인 상동체는 모든 FMDV 균주로부터의 VP1 서열의 루프화 구조에서 불변적으로 발견되는 특징적인 "RGD" (Arg-Gly-Asp) 세포 수용체 결합 서열을 함유하는 펩티드 및 단백질을 포함한다. 이러한 RGD 서열은 VP1 단백질의 아미노산 위치 145 내지 147에 상응한다.

표 2에 나타난 바와 같이, "RGD" 서열의 하류 (C-말단 쪽)에서 발견되는 아미노산의 개수는 다양한 VP1 서열들 간에 동일하다. 그러나, RGD 서열로부터 상류 (N-말단 쪽)의 아미노산의 개수는 특정 혈청형 (예를 들어, O, 아시아 1, A, 또는 C)에 따라 다르다. 각각의 혈청형 내에서, N-말단 서열은 특정 혈청형에 대한 컨센서스 서열에 대한 동일성이 75% 이상이다 (예를 들어, 혈청형 아시아 1의 경우 서열 12에 비교했을 때의 서열 13 내지 15; 및 혈청형 A의 경우 서열 16에 비교했을 때의 서열 17 내지 19). 한 실시양태에서, 변이체 O_{미얀마 /7/02} 균주 상동체 (서열 7)는 서열 2에 대한 동일성이 85%를 초과한다 (컨센서스 서열에서의 것과 상이한 잔기들은 음영으로서 제시됨). 또 다른 실시양태에서, 변이체 균주 O_{오즈크 /93} 상동체 (서열 8)는 서열 2에 대한 동일성이 약 90%이다 (컨센서스 서열에서의 것과 상이한 잔기들은 음영으로서 제시됨).

표 2에서 제시되고 다른 방식으로 기술된 상동성 VP1 펩티드들은 적합한 비로 조성물에서 조합될 수 있고, 특이적 FMDV 균주를 표적화하는 중화 항체를 효과적으로 도출시키도록 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 상동성 VP1 펩티드들을 함유하는 제약 조성물은 FMD 감염을 예방하기 위한 효과적인 백신이다. 예를 들어, 유중수 (w/o) 에멀젼 (예를 들어, ISA50V2 사용) 또는 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼 (예를 들어, 에멀시젠(Emulsigen) 사용)으로서 제조된 상동성 VP1 펩티드(들)를 함유하는 제제가 FMD 감염을 예방하는데 효과적이다.

다중 VP1 서열 펩티드를 함유하는 조성물의 효과를 사용하는 것이 논의된 다양한 실시양태 및 예가 하기에서 제공된다. 예를 들어, 실시예 6, 7, 9 및 10은 O_컨센서스, O_{돼지 /소/O/ Mya /7/02} (O_미얀마로 약기됨) 및 O_{오즈크 /93} (O_오즈크로 약기됨)의 서열에 상응하는 3가지 FMDV 혈청형 O VP1 펩티드의 조합을 함유하는 다가 FMDV 돼지 및/또는 소 백신 조성물을 기술한다. 이러한 펩티드 혼합물을 함유하는 조성물은 여러 분기성 O 군주에 의해 부과되는 감염에 대응하기 위한 강력한 3가 돼지 백신을 생산할 수 있다. 유사하게, O_컨센서스 (2570a), 아시아 1_{지앙수 /차이나/2005} (아시아 1_지앙수로 약기됨), 및 A_{간수 /차이나/60Y} (A_간수로 약기됨)의 VP1 펩티드들의 조합을 사용하는 다중-혈청형 백신이 혼합되어, 중국에서 다중 FMDV 혈청형으로부터의 균주에 의해 부과되는 감염에 대응하기 위한 3가 혈청형 소 백신이 형성될 수 있다. 또한, O_{캄포 스/브라질/58Y} (O_캄포스로 약기됨), A_{24 크루제이로 캘리포니아( Cruzeiro California)} (A₂₄로 약기됨), 및 C_{인다이알 /브라질/84Y} (C_인다이알로 약기됨)로부터의 VP1 서열 펩티드의 조합을 함유하는 남미용으로 개조된 효과적인 다중-혈청형 소 백신은 남미에서 가장 유행하는 다중 혈청형으로부터의 균주에 의해 부과되는 FMD 감염에 대응하는데 효과적이다.

FMDV의 다른 영역 및 단백질에 대해 상대적인, 본 발명의 합성 펩티드 내에 포함되도록 선택된 FMDV VP1 단백질 상의 B 세포 에피토프의 위치가 도 1에서 제시된다. 이러한 단백질 서열들은 FMDV O_{타이완 99} 게놈/코딩된 아미노산 서열의 서열 (진뱅크 수탁 번호 AJ539137)을 기초로 한다.

합성 펩티드 면역원의 면역학적으로 기능성인 유사체가 동물에서 면역 반응을 도출시키는데 또한 효과적이고, 본 발명의 일부로서 포함된다. 면역학적으로 기능성인 유사체는 원래의 펩티드와 실질적으로 동일한 항원 및 면역원성을 유지하는, 서열 1, 2, 12, 및 16의 컨센서스 서열 및/또는 서열 3-11, 13-15, 및 17-23의 상동체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 기능성 유사체인 변이체는 아미노산 위치에서의 보존적 치환, 전체적인 전하의 변화; 또 다른 모이어티에 대한 공유결합 부착; 또는 아미노산 부가, 삽입, 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합이 있을 수 있다.

보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 화학적 성질이 유사한 또 다른 아미노산 잔기를 치환하는 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고, 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며, 양성 전하를 띠는 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고, 음성 전하를 띠는 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

한 실시양태에서, 특정 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 원래의 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 함유하고, 펩티드의 아미노 말단에 부가된 3개의 리신 (Lys-Lys-Lys)을 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 원래의 펩티드 서열에 3개의 리신이 포함되는 것은 원래의 펩티드의 전체적인 전하를 변화시키지만, 원래의 펩티드의 기능은 변경시키지 않는다.

특정한 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 50% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 80% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 85% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 90% 이상이다.

b. FMDV 내인성 T 헬퍼 ( Th ) 에피토프

합성 면역원 펩티드를 함유하는 조성물은 FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 제약/백신 제제 내의 Th 에피토프의 존재는 FMDV 보호에 대한 중요한 상관물인 항원 특이적 T 세포 활성화를 개시시킴으로써 치료된 동물에서 면역 반응을 프라이밍(priming)시킨다. 추가적으로, FMDV 상에 존재하는 신중하게 선택된 면역우세 Th 에피토프를 포함하는 제제는 광범위한 세포 매개 면역을 일으킬 수 있고, 이는 제제를 유전적 구성이 다양한 동물, 예컨대 소를 치료 및 보호하는 것에서 효과적이게 한다.

FMDV 단백질로부터의 T 헬퍼 에피토프 펩티드와 조합된 B 세포 에피토프가 있는 면역원 펩티드를 함유하는 제제의 단일 투여로 면역화된 동물은 천연 감염 또는 FMDV 시험감염 시험으로부터의 FMDV에 대한 후속 노출 시 림프구 증식성 반응을 유발할 수 있다. 증식성 반응은 IFN-γ 생산을 포함하는 사이토카인 생산에 이르고, 이는 동물에서 다양한 세포병변성 바이러스 감염에 대한 세포-매개 면역 반응을 강화한다

시험관내 T 세포 증식 검정법을 사용하여, 그리고 Th 에피토프를 함유하는 FMD 제제/백신으로 면역화된 숙주 동물에서의 생체내 및 시험관내 사이토카인 IFN-γ 생산을 평가함으로써, 서열 34-63의 Th 에피토프 펩티드가 확인되었다. 추가적으로, 필요한 세포 면역을 유전적 배경이 다양한 숙주 동물, 예컨대 소에서 효과적으로, 그리고 일관적으로 생산할 수 있는 적합한 제약 조성물을 결정하기 위해, (a) FMDV B 에피토프 클러스터 VP1 펩티드 및 (b) FMDV 내인성 Th 펩티드의 대형 풀 조합을 함유하는 제제가 분석되었다. 면역화/백신 접종 숙주에서 시험관내 IFN-γ 생산을 모니터링하는 것에 더하여, 이러한 숙주들이 제제의 단일 투여만으로 FMDV에 대한 중화 항체를 개시시킬 수 있었는지 여부를 결정하기 위해 중화 항체 역가를 또한 평가하였다.

다양한 실시양태에서, FMDV 단백질 VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B 및 3D의 항원 절편으로부터 FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드가 유래된다. 본 발명의 제제에서 사용될 때 특히 유용한 것으로 발견된 특이적인 FMDV 내인성 Th 펩티드들 (서열 34-63)이 표 4에서 확인된다. 구체적으로, (a) FMDV 바이러스 용해물 제제/백신 및 (b) FMDV 후보 Th 펩티드를 함유하는 펩티드 제제로 면역화된 숙주로부터 수득된 돼지 및 소 T 세포에 의해 표 4에서 열거된 FMDV 내인성 Th 에피토프가 인식된다. FMDV의 다른 영역 및 단백질에 대해 상대적인, FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 및 3D 단백질 상의 Th 에피토프의 분포 및 위치 (표 4에서 열거됨)가 도 1에서 제시된다. 이러한 단백질 서열들은 FMDV O_{타이완 99} 게놈/코딩된 아미노산 서열의 서열 (진뱅크 수탁 번호 AJ539137)을 기초로 한다.

표 4에서 확인된 Th 에피토프의 상동체 또한 효과적이고, 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 서열 64-78은 FMDV O_{TAW /2/99} (진뱅크 수탁 번호 AJ539137)로부터의 상동성 Th 에피토프 서열이다. 표 5는 FMDV O_{타이완 /99}로부터의 Th 에피토프를 FMDV O_TAW/2/99로부터의 상동성 Th 에피토프와 비교하는 것의 서열 정렬을 제공한다. 구체적으로, 표 5는 FMDV 3D 단백질 (서열 61 대 64; 62 대 65; 63 대 66; 60 대 71 및 72); FMDV 2B 단백질 (서열 48 대 67 및 68), FMDV 3A 단백질 (서열 53 대 69 및 70), FMDV VP4 단백질 (서열 34 대 73 및 74), FMDV VP2 단백질 (서열 36 대 75 및 76), 및 FMDV VP3 단백질 (서열 37 대 77 및 78)로부터의 상동성 Th 에피토프를 정렬한다.

FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체 또한 효과적이고, 본 발명의 일부로서 표함된다. 면역학적으로 기능성인 유사체는 원래의 펩티드와 실질적으로 동일한 면역원성을 유지하는 서열 34-63 및/또는 서열 64-78의 상동체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 기능성 유사체인 변이체는 아미노산 위치에서의 보존적 치환, 전체적인 전하의 변화; 또 다른 모이어티에 대한 공유결합 부착; 또는 아미노산 부가, 삽입, 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합이 있을 수 있다.

보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 화학적 성질이 유사한 또 다른 아미노산 잔기를 치환하는 경우이다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고, 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며, 양성 전하를 띠는 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고, 음성 전하를 띠는 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

특정한 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 50% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 80% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 85% 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 기능성 유사체는 원래의 아미노산 서열에 대한 동일성이 90% 이상이다.

한 실시양태에서, 특정 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체는 원래의 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 함유하고, 펩티드의 아미노 말단에 부가된 3개의 리신 (Lys-Lys-Lys)을 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 원래의 펩티드 서열에 3개의 리신이 포함되는 것은 원래의 펩티드의 전체적인 전하를 변화시키지만, 원래의 펩티드의 기능은 변경시키지 않는다.

Th 에피토프 펩티드에 대한 기능성 유사체의 또 다른 변이가 표 6에서 확인된다. 특히, 서열 39 및 40은 서로의 기능성 유사체인데, C-말단에서의 4개의 아미노산의 결실 (서열 39) 또는 포함 (서열 40)에 의해서만 상이하기 때문이다. 이러한 2개의 유사체 간의 차이는 이러한 서열들 내에 함유된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다.

다른 변이에서, FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드가 이러한 특정 펩티드에 대한 상동체들의 가변성 잔기를 기초로 하는 펩티드 프레임워크 내의 특정 위치에서 나타난 아미노산 잔기들의 혼합물을 함유하는 조합형 서열로서 제시될 수 있다. 합성 공정 동안 특정 위치에서 1개의 특정 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산들의 혼합물을 부가함으로써 1회의 공정에서 조합형 펩티드의 어셈블리가 합성될 수 있다. 이같은 조합형 FMDV 내인성 Th 펩티드 어셈블리는 유전적 배경이 다양한 동물들에 대한 광범위한 Th 에피토프 적용 범위를 허용할 수 있다. FMDV 내인성 Th 펩티드의 대표적인 조합형 서열은 표 7에 제시된 서열 79-87을 포함한다. 이러한 조합형 서열들은 대표적인 FMDV 내인성 Th 에피토프에 대한 서열 34-63 (표 4에 제시됨)으로부터 유래된다.

다양한 실시양태에서, 다중 FMDV 내인성 Th 에피토프 서열들을 단일 펩티드에서 함께 연결함으로써 T 세포 면역원성이 강화될 수 있다. 함께 연결된 Th 에피토프 서열들은 동일한 Th 에피토프 서열 (반복되는 Th 에피토프 서열이 있는 펩티드가 생성됨); 상이한 Th 에피토프 서열 (다양한 Th 에피토프 서열이 있는 펩티드가 생성됨); 또는 이의 조합일 수 있다. 추가적으로, Th 에피토프 서열들은 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이 함께 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 스페이서는 적합한 장소에서의 단일 서열로서 다중 FMDV Th 에피토프들을 함유하는 펩티드의 세포내 절단을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 아미노산을 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 스페이서는 리신이다.

본 발명의 Th 에피토프 펩티드는 유전적으로 다양한 표적 동물 종 집단으로부터의 동물에게 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다. 본 발명의 제제에서 특히 유용한 것으로 발견된 펩티드는 서열 34-78와 같은 다중 FMDV Th 에피토프의 클러스터를 함유하는 펩티드, 및 서열 79-87과 같은 Th 에피토프 서열의 조합형 서열을 함유하는 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표 7에 제시된 바와 같이 Th 에피토프들을 인공 Th (UBITh®) (서열 24)에 연결시킴으로써 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드가 T 세포 면역원성을 추가로 강화시킬 수 있다 (서열 88-95).

c. 스페이서

합성 FMDV 펩티드 면역원 (이의 상동체 및 유사체 포함)이, 스페이서로 또는 스페이서 없이, Th 에피토프를 함유하는 것으로 공지된 서열을 함유하는 펩티드에 공유결합으로 연결될 수 있다. 연결된 펩티드들은 Th 에피토프 펩티드에 공유결합으로 연결되지 않은 등가의 면역원보다 강화된 면역원성을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드가 합성 FMDV 펩티드 면역원의 N-말단에 공유결합으로 연결된다. 일부 변이에서, 스페이서가 2개의 서열 사이에 존재한다. 바람직하게는, 스페이서는 단일 아미노산 εNLys이다. 구체적 실시양태에서, 서열 24의 인공 Th 에피토프 펩티드가 서열 2의 합성 FMDV 펩티드 면역원의 N-말단에 εNLys 스페이서를 통해 공유결합으로 연결된다 (표 3에서 서열 25로 또한 제시됨). 합성 FMD 펩티드 면역원의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된 Th 에피토프 서열을 함유하는 추가적인 예시적인 펩티드가 표 3에서 제시된다. 특히, Th 에피토프 펩티드 서열 24가 -εNLys 스페이서를 통해 다양한 합성 FMDV 펩티드 면역원의 아미노 말단에 연결된다 (서열 25 내지 33).

d. 조성물

본 개시내용은 또한 합성 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 동물에서의 FMD의 검출, 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, FMDV B 세포 에피토프가 있는 합성 펩티드를 함유하는 조성물이 샘플 내의 FMDV에 대한 항체의 존재를 검출하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, FMDV B 세포 에피토프가 있는 합성 펩티드를 함유하는 조성물은 동물에서의 FMD 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 제약 조성물이다. 특정 실시양태에서, FMDV B 세포 에피토프가 있는 합성 펩티드를 함유하는 제약 조성물이 동물에서 FMDV에 대한 면역 반응을 도출시키는데 사용된다. FMDV B 세포 에피토프가 있는 합성 펩티드를 함유하는 제약 조성물은 FMDV에 대한 백신으로 사용될 수 있다.

합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 제약 조성물은 표적 FMD 단백질에 대한 기능성 항체를 효율적으로 도출시켜, 동물에게 FMD 시험감염으로부터의 보호를 제공한다. 실제로, 이러한 제약 조성물의 단일 투여만 제공된 동물이 FMD 감염에 대해 충분히, 그리고 적합하게 보호된다. 따라서, FMD 감염으로부터의 완전한 보호를 동물에게 제공하기 위해 다중 투여 또는 부스터(booster) 용량이 요구되지 않는다. 따라서, 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 제약 조성물이 OIE 가이드라인에 따른 응급 백신으로서 적격하다.

본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 표 1에 제시된 컨센서스 서열 (서열 1 또는 2), 및/또는 표 2에 제시된 바와 같은 이의 상동체 또는 유사체, 및/또는 이의 조합을 갖는 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 추가적으로, 조성물에서 사용된 FMDV 펩티드 면역원이 조성물의 B 세포 면역원성을 강화하도록 인공적인 조합형 T 헬퍼 에피토프에 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 합성 FMDV 펩티드 면역원이 서열 24의 인공적인 조합형 T 헬퍼 에피토프에 연결된다. 다양한 혈청형으로부터의 대표적인 FMDV VP1 펩티드 면역원이 표 3에서 확인된다.

FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 조성물은 하나 이상의 FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드를 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 및 3D 단백질로부터 유래된 Th 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 조성물에서 특히 유용한 것으로 발견된 Th 에피토프 펩티드는 표 4, 5, 6, 및 7에 제시된 펩티드 (서열 34-95) 및 실시예 9 및 10에 기술된 표 18, 19, 25, 및 26에 제시된 펩티드를 포함한다. 제약 조성물 (백신 제제 포함)은 FMDV-특이적 항체 반응을 도출시킬 수 있고, 단지 단일 투여로 FMDV 감염에 대해 돼지 및 소를 보호하는 펩티드 항원 특이적 T 세포 반응의 개시를 유발할 수 있다.

추가적으로, 조성물은 제약상 허용되는 전달 시스템 내에 담체 및/또는 기타 첨가물을 함유할 수 있다. 따라서, 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 조성물이 백신 제제에서 일상적으로 제공되는 아주반트, 제약상 허용되는 담체 또는 기타 성분을 사용하여 제약 백신 제제로서 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 성분에는 백반, 불완전 프로인트(Freund) 아주반트, 리포신(liposyn), 사포닌, 스쿠알렌, L121, 에멀시젠, 모노포스포릴 지질 A (MPL), QS21, ISA 35, ISA 206, ISA50V2, 및 ISA 720을 포함하는 아주반트 또는 유화제, 뿐만 아니라 기타 효과적인 아주반트 및 유화제가 있다. 특정한 실시양태에서, 전달 비히클 및 아주반트는 몬타니드(Montanide)™ ISA 50V2 (유중수 에멀젼의 생산을 위한 식물성 오일 및 만니드 올레에이트로 구성된 오일 백신 아주반트 조성물), 트윈(Tween)® 80 (폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로 또한 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이의 임의의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 에멀시젠 또는 에멀시젠 D를 아주반트로 하는 수중유중수 (즉, w/o/w) 에멀젼이다 (군 27, 28, 31, 및 32에 대해 실시예 9, 표 19에서 기술된 바와 같음). 백신 제제에 일상적으로 혼입되는 기타 성분, 및 균형을 이룬 B 및 T 세포 면역 반응이 단일 투여 시에 개시될 수 있고 바이러스 시험감염 시에 보호를 제공할 수 있도록 하는 투여량에 대한 설명서 (실시예 9 및 10)이 또한 제공된다.

즉각 방출 제제로서 또는 지속 방출 제제용으로 제약 조성물이 제제화될 수 있다. 추가적으로, 면역원 포획 및 마이크로입자와의 공동투여를 통해 전신 면역 또는 국소화된 점막 면역의 유도를 위해 제약 조성물이 제제화될 수 있다. 이같은 전달 시스템은 업계의 숙련된 기술자에 의해 쉽게 결정된다.

본 개시내용의 펩티드를 함유하는 다양한 백신 제제가 FMDV에 대해 발굽 동물을 보호하는데 효과적이다. 예를 들어, FMDV 백신 제제로서 유용한 제약 조성물이 합성 FMDV 펩티드 면역원 및 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트를 함유하고, 이때 합성 FMDV 펩티드 면역원은:

a) 서열 1-2;

b) (a)의 상동체;

c) (a) 또는 (b)의 항원적으로, 그리고 면역학적으로 기능성인 유사체,

d) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 아미노산 부가, 및/또는 아미노산 결실이 있는 (a), (b), 또는 (c); 및

e) (a)-(d)의 임의의 조합

로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

구체적인 제제에서, 합성 FMD 펩티드 면역원은 서열 2, 7, 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 제제에서, 조성물은 스페이서를 통해 인공적인 조합형 Th 펩티드에 연결된 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하고, 이의 서열은 서열 25이다.

기타 제제는 용량 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 같은 중량비의 서열 34 내지 63의 30개의 FMDV Th 에피토프 펩티드를 추가로 함유한다. 구체적인 제제에서, 같은 중량비의 서열 34 내지 63의 양은 용량 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍이다.

또 다른 제제에서, 조성물은 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트 내의 서열 25, 27, 및 28의 합성 FMDV 펩티드 항원의 혼합물 및 같은 중량비의 서열 34 내지 63의 FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드의 풀을 포함하고, 이때 펩티드 항원의 양은 용량 당 약 10 ㎍ 내지 약 1 ㎎이다.

e. 투여

피하, 경구, 근육내 또는 기타 비경구 또는 장 경로를 포함하는 임의의 편리한 경로에 의해 제약 조성물 및 백신 제제가 투여될 수 있다. 유사하게, 단일 용량 또는 다중 용량으로서 백신이 투여될 수 있다. 면역화 일정은 통상적인 숙련된 기술자에 의해 쉽게 결정된다.

유효량의 합성 펩티드 면역원 및 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제약 조성물이 제제화된다. 또한 제약 조성물은 체중 1 ㎏ 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 ㎎의 면역원을 일반적으로 함유하는 적절한 투여량 단위 형태로 제제화된다. 다중 용량으로 전달될 때, 제약 조성물은 투여량 단위 형태 당 적합한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 투여된 투여량은 백신 및 치료제 업계에 주지된 바와 같이 대상의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 좌우될 것이다.

합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 제약 조성물, 예컨대 백신 제제는 단일 투여로 제공된 경우에도 효과적인 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 제약 조성물의 단일 투여가 돼지, 소, 양, 염소 및 기타 감수성 야생 종을 포함하는 다양한 T 헬퍼 세포 집단이 있는 동물을 프라이밍시키는데 충분하다. 특히, Th 에피토프 펩티드와 조합된 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 제약 조성물은 후속 바이러스 시험감염으로부터 동물을 보호하는 균형잡힌 B (중화 항체) 및 T 세포 (사이토카인 방출 등) 면역 반응을 도출시킬 수 있다.

Th 에피토프 펩티드와 조합된 합성 FMDV 펩티드 면역원을 함유하는 제제를 사용하는 단일 투여 면역화가 OIE, 타이완 및 PRC 가이드라인에 따라 광범위하게 평가되었다 (실시예 9 및 10에서 추가로 논의됨). 이러한 시험으로부터 수득된 결과는 면역화된 숙주를 FMD 감염에 대해 보호하는 것에서의 이러한 제제들의 효능을 반복적으로, 그리고 재현가능하게 실연하였다. 따라서, 이러한 시험들은 FMDV 제제의 디자인, 뿐만 아니라 동물에서 응급 FMDV 백신으로서 FMDV 제제를 사용하는 것의 능력을 입증하였다.

f. 제작 방법

본 개시내용은 또한 FMDV 감염에 대해 면역 반응을 도출시키고 동물을 보호하기 위한 합성 FMDV 펩티드 면역원, Th 에피토프 펩티드, 조성물 및 제약 제제/백신을 제작하는 방법에 관한 것이다.

합성 FMDV 펩티드 면역원을 사용하는 것은 전통적인 불활성화 바이러스 백신에 비해 다수의 유의한 장점을 제공한다. 예를 들어, 전통적인 불활성화 바이러스 백신은 값비싼 생물학적 봉쇄 장치를 요구할 수 있고, 실험실에서 직접적으로 작업하는 개인에게, 뿐만 아니라 이러한 봉쇄 장치/프로토콜이 실패하는 경우 대중에게 심각한 생물재해성 위험을 일으킬 수 있다. 대조적으로, 펩티드 항원의 제작에서는 생물재해 물질이 사용되지 않고, 이는 건강 및 안전 위험을 급격하게 감소시키고, 값비싼 생물학적 봉쇄 장치에 대한 요구를 제거한다. 또한, 부위-특이적 면역원은 선택된 에피토프의 높은 몰 농도를 제시하고, 이는 FMDV 항원 펩티드를 사용하는 백신의 안전성 및 면역역가를 확실히 하는 것을 돕는다.

추가적으로, 공지된 B 세포 및 Th 에피토프가 있는 규정된 합성 펩티드를 면역원으로서 사용하는 것은, 이러한 시약들이 백신의 면역원성 성분으로서 사용되는 경우에, FMDV 및/또는 재조합 단백질과 함께 정제될 수 있는 FMDV-감염 또는 재조합 바이러스-감염 숙주 세포로부터 또는 재조합 단백질 발현 시스템으로부터 유래되는 항원 물질의 존재에 의해 야기되는 원치 않는 비-FMDV-특이적 면역 반응을 제거한다. 예를 들어, 돼지로부터의 혈청은 숙주 세포 또는 재조합 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 효모 또는 배큘로바이러스에 대한 항체가 있을 수 있고, 이는 생물학적으로 유래된 항원을 기초로 하는 진단 시험에서 사용된 항원 물질과 교차-반응성일 수 있다. 이러한 무관한 면역원이 성분으로서 있는 백신에 의해 생성된 이같은 면역 반응은 보호적이지 않을 것이다. 대조적으로, 본원에서 기술된 FMDV 펩티드 백신이 제공된 돼지 또는 소는 숙주 세포 또는 발현 벡터로부터 유래된 단백질에 대한 유해 항체 또는 기타 면역 반응이 없는 집중적인 면역 반응을 생성시킬 것이다.

또한, 불활성화된 바이러스의 생산 동안 도입될 수 있는 불일치 또는 실수는 치료된 동물에서의 적합하고/하거나 원하는 면역 반응을 방지할 수 있다. 그러나, 긴 합성 FMDV 펩티드 면역원의 합성 동안 도입될 수 있는 불일치 및/또는 실수는 대부분 치료된 동물에서 원하는 면역 반응을 저해하거나 방지하지 않는다. 실제로, 펩티드 합성 동안 도입될 수 있는 불일치/실수는 표적화된 펩티드 합성과 함께 다중 펩티드 유사체를 생성시킨다. 이러한 유사체들은 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이같은 펩티드 유사체들은 면역진단 목적을 위한 고체상 항원으로서 또는 백신접종 목적을 위한 면역원으로서 면역학적 용도에서 사용되는 경우에 항원 및 면역원성에 대한 기여물로서 펩티드 제제에서 적절하다.

합성 펩티드의 면역학적 용도에서의 25년의 경험 동안, 출원인은 의도된 면역학적 활성의 유지를 허용하는 구조적 가변성에서의 범위가 생물학적으로 유도된 약물과 공동-생산되는 대형 분자에서 발견되는 원하는 활성 및 원치 않는 독성 또는 소형 분자 약물에 의한 특이적 약물 활성의 유지를 위해 허용되는 구조적 가변성에서의 범위보다 훨씬 더 수용성이라는 것을 발견하였다. 따라서, 의도된 펩티드와 크로마토그래피 성질 및 면역학적 성질이 유사한 결실 서열 부산물의 혼합물로서 합성 공정의 실수에 의해 불가피하게 생산되었거나 또는 의도적으로 디자인된 펩티드 유사체가 종종 원하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 디자인된 유사체 및 의도치 않은 유사체 혼합물은 제작 공정 및 생성물 평가 공정 양쪽 모두를 모니터링하기 위해 분별 QC 절차가 개발되어 이러한 펩티드를 사용하는 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하는 한 효과적이다.

상기 기술된 장점의 관점에서, 본 개시내용에서 기술된 펩티드는 표준 기술, 예컨대 고체 상 합성 방법 및 이러한 공정에 대한 무수한 이용가능한 개선을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다 (Moore, V, 1992). 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 펩티드를 또한 제조할 수 있다. 따라서, FMDV B 세포 및 T 세포 에피토프 클러스터 항원 펩티드 및 FMDV B 세포 에피토프 클러스터 항원 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자 및 이의 상보물이 본 발명의 일부로서 본 개시내용에 또한 포함된다. 유사하게, 핵산 분자를 포함하는 벡터 (발현 벡터 포함), 뿐만 아니라 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 본 발명의 일부로서 본 개시내용에 또한 포함된다.

다양한 예시적인 실시양태들이 FMDV 항원 펩티드 및 FMDV 항원 펩티드의 면역학적으로 기능성인 유사체를 생산하는 방법을 또한 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법들은 FMDV 항원 펩티드 및/또는 이의 면역학적으로 기능성인 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 펩티드 및/또는 유사체가 발현되는 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.

추가적으로, 고체-상 합성에 의해 펩티드가 생산될 수 있다. 이러한 화학적 공정으로 생산된 펩티드의 품질이 제어 및 규정될 수 있고, 그 결과 항원성, 면역원성 및 수율의 재현성이 보증될 수 있다.

g. 구체적 실시양태

본 발명의 구체적 실시양태는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:

(1) a) 합성 FMDV VP1 펩티드 항원;

b) 합성 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드; 및

c) 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하며, 여기서 (a)에서의 FMDV VP1 펩티드 항원은

i) 서열 1 또는 2;

ii) (a)의 상동체; 및

iii) (a) 또는 (b)의 임의의 조합

로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, (b)에서의 합성 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드는 (a)에서의 펩티드 항원에 공유결합으로 연결되지 않은 것인, 구제역 (FMD) 백신 조성물.

(2) 제1실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 FMD 백신.

(3) 제1실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 FMD 백신.

(4) 제1실시양태에 있어서, (b)에서의 상동체가 서열 3 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 서열 2의 상동체인 FMD 백신.

(5) 제1실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 아미노- 또는 카르복실-말단에서 Th 에피토프 서열을 포함하는 펩티드에 공유결합으로 연결된 것인 FMD 백신.

(6) 제5실시양태에 있어서, Th 에피토프 서열이 서열 24인 FMD 백신.

(7) 제5실시양태에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 엡실론 리신 잔기를 포함하는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유결합으로 연결된 것인 FMD 백신.

(8) 제1실시양태에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34 내지 95 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FMD 백신.

(9) 제1실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원의 총량이 용량 당 약 10 ㎍ 내지 약 1 ㎎인 FMD 백신.

(10) 제1실시양태에 있어서, 전달 비히클 또는 아주반트가 몬타니드 ISA 50V, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, 에멀시젠, 에멀시젠 D, 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FMD 백신.

(11) a) 서열 25-33 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 FMDV VP1 펩티드 항원;

b) 서열 34-95로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드; 및

c) 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트

를 포함하는 구제역 (FMD) 백신 조성물.

(12) 제11실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 25, 27, 28, 29 및/또는 이들의 조합인 FMD 백신.

(13) 제11실시양태에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34-63, 90, 및/또는 이들의 조합인 FMD 백신.

(14) 제11실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 25, 27, 28, 29 및/또는 이들의 조합이고, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34-63, 90, 및 이들의 조합인 FMD 백신.

(15) 제약상 유효량의 제14실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.

(16) 제15실시양태에 있어서, 동물이 돼지인 방법.

(17) 제약상 유효량의 제14실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.

(18) 제17실시양태에 있어서, 동물이 돼지인 방법.

(19) 제11실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 25, 27, 28, 29, 31, 및/또는 이의 조합인 FMD 백신.

(20) 제약상 유효량의 제19실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.

(21) 제20실시양태에 있어서, 동물이 소인 방법.

(22) 제약상 유효량의 제19실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.

(23) 제22실시양태에 있어서, 동물이 소인 방법.

(24) 제11실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 26, 30, 32, 33, 및/또는 이의 조합인 FMD 백신.

(25) 제11실시양태에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 91-95, 및 이의 조합인 FMD 백신.

(26) 제11실시양태에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원이 서열 26, 30, 32, 33, 및/또는 이의 조합이고, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 91-95, 및 이의 조합인 FMD 백신.

(27) 제약상 유효량의 제26실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.

(28) 제27실시양태에 있어서, 동물이 소인 방법.

(29) 제약상 유효량의 제26실시양태의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.

(30) 제29실시양태에 있어서, 동물이 소인 방법.

하기의 예들은 본 발명을 설명하는 역할을 하고, 본 발명의 범주를 제한하도록 사용되지 않아야 한다.

실시예 1

FMDV 펩티드의 합성

제약 조성물에 포함된 FMDV 펩티드를 합성하는 방법이 기술된다. 실험실 파일럿 및 현장 연구용으로 유용한 소규모의 양으로, 뿐만 아니라 백신 및 검정법 제제의 산업용/상업용 생산에 유용한 대규모 (킬로그램) 양으로 이러한 펩티드가 합성될 수 있다.

서열 길이가 아미노산 약 10개 내지 70개인 FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 및 3D 단백질로부터의 FMDV B 및 T 세포 에피토프 클러스터 부위 양쪽 모두를 나타내는 FMDV 항원 펩티드의 대형 레퍼토리가 디자인되었다. 일부 펩티드의 경우, 적절한 부위에서 아미노산 치환이 이루어져, 상응하는 천연 단백질과의 교차-반응을 최대화하도록 국소 구조 보존을 위한 제약을 발휘하기 위한 고리형 펩티드의 형성을 허용하였다 (예를 들어, 시스테인 잔기로의 치환). 대표적인 FMDV 항원 펩티드가 표 2 (서열 1-23)에서 확인된다.

각각의 펩티드의 각자의 면역원성을 강화하기 위해 인공적인 조합형 Th 펩티드에 연결된 항원 펩티드가 또한 합성되었다. 서열 24의 조합형 Th 펩티드 (UBITh®)에 연결된 대표적인 FMDV 항원 펩티드가 표 3 (서열 24-33) 및 표 7 및 8 (서열 89-102)에서 확인된다.

Fmoc 화학을 사용하여, 면역원성 시험에서 사용된 모든 펩티드를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied BioSystems)의 펩티드 합성기 모델 430A, 431 및 433을 사용하여 합성하였다. 3관능성 아미노산의 N-말단 및 측쇄 보호기에서의 Fmoc 보호와 함께, 고체-상 지지체 상에서의 독립적인 합성으로 각각의 펩티드가 생산되었다. 완성된 펩티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 측쇄 보호기를 90% 트리플루오로아세트산으로 제거하였다. 합성 펩티드 제제를 매트릭스-보조 레이저 탈착 비행 시간(Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight: MALDTOF) 질량 분광법으로 평가하여, 정확한 아미노산 함량을 확실히 하였다. 합성 펩티드를 역상 HPLC로 또한 평가하여, 합성 프로파일 및 제제 농도를 확인하였다.

합성 공정의 엄격한 제어 (커플링 효율을 모니터링하는 것을 포함함)에도 불구하고, 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 조기 종결을 포함하는 신장 사이클 동안의 의도치 않은 이벤트로 인해 펩티드 유사체가 또한 생산되었다. 따라서, 합성된 제제는 전형적으로 표적으로 하는 펩티드와 함께 다중 펩티드 유사체를 포함하였다. 이같은 의도치않은 펩티드 유사체를 포함함에도 불구하고, 생성된 합성 펩티드 제제는 면역진단 (항체 포획 항원으로서) 및 백신 접종 (펩티드 면역원으로서)을 포함하는 면역학적 용도에서 사용하기에 적절하였다. 전형적으로, 의도적으로 디자인되거나 또는 합성 공정 동안 부산물의 혼합물로서 생성된 이같은 펩티드 유사체들은, 제작 공정 및 생성물 평가 공정 양쪽 모두를 모니터링하기 위해 분별 QC 절차가 개발되어 이러한 펩티드를 사용하는 최종 생성물의 재현성 및 효능을 보장하는 한, 종종 원하는 펩티드의 정제된 제제만큼 효과적이다.

모든 펩티드를 노동 집약적이고 시간에 민감한 혈청학적 또는 시험관내 IFN-γ 생산 스크리닝 공정 (펩티드 합성, 백신 제제, 동물 면역화의 반복 사이클을 포함함), 및 각각의 진단 및 백신 용도를 위해 표적 동물에서 추가로 시험하기 위한 후보 펩티드를 산출하기 위한 혈청학적 및 시험관내 IFN-γ 생산 시험에 적용하였다. 다양한 예에서 사용된 구체적인 제제가 하기에서 기술된다.

실시예 2

검정법 및 시약

본 발명의 합성 펩티드 및 제제를 평가하기 위한 검정법 및 시약이 개발되었고, 하기에서 기술된다.

a. FMDV VP1 ( aa134 -168) 또는 VP1 ( aa129 -168) 펩티드-기재 ELISA

하기 실시예에서 기술된 다양한 샘플을 평가하기 위한 ELISA 검정법이 개발되었고, 하기에서 기술된다.

96웰 플레이트의 웰들을 개별적으로 1시간 동안 37℃에서 10 mM NaHCO₃ 완충제, pH 9.5 (달리 언급되지 않는 한) 내의 2 ㎍/㎖ (달리 언급되지 않는 한)의 개별적인 표적 펩티드 100 ㎕로 코팅하였다.

펩티드로 코팅된 웰을 PBS 내의 3 중량%의 젤라틴 250 ㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여, 비-특이적 단백졀 결합 부위를 차단한 후, 0.05 부피%의 트윈(TWEEN)® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 건조시켰다. 분석될 혈청을 20 부피%의 정상 염소 혈청, 1 중량%의 젤라틴 및 0.05 부피%의 트윈® 20을 함유하는 PBS로 1:20 (달리 언급되지 않는 한) 희석하였다. 백 마이크로리터 (100 ㎕)의 희석된 검체를 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 37℃에서 반응시켰다.

그 후, 미결합 항체를 제거하기 위해 웰을 PBS 내의 0.05 부피%의 트윈® 20으로 6회 세척하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제가 접합된 염소 항-돼지 IgG가 양성 웰에서 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 표지된 추적자로서 사용되었다. PBS 내의 1 부피%의 정상 염소 혈청 + 0.05 부피%의 트윈® 20 내의 미리 적정된 최적 희석도의 100 ㎕의 퍼옥시다제-표지 염소 항-돼지 IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 또 다른 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 내의 0.05 부피%의 트윈® 20으로 6회 세척하여 미결합 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충제 내의 0.04 중량%의 3',3',5',5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피%의 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100 ㎕와 또 다른 15분 동안 반응시켰다. 이러한 기질 혼합물은 유색 생성물을 형성함으로써 퍼옥시다제 표지를 검출하는데 사용되었다. 100 ㎕의 1.0M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도 (A₄₅₀)를 결정하였다.

동물 혈청 내의 FMDV 항체를 검출하기 위한 목적으로 혈청 희석을 행하였다: (a) 잠재적인 천연 감염을 확인하기 위해, 1:20의 희석물을 사용하였고, A₄₅₀ 판독값을 기록하였으며, 차단값 계산을 위한 빌트-인(built-in) 고유 음성 대조군을 사용하였거나; 또는 (b) 펩티드-기재 FMDV 백신 제제가 제공된 돼지의 항체 역가를 결정하기 위해, 1:10에서 1:10,000까지의 혈청의 10배 단계 희석물을 시험하였고, Log₁₀으로 표현되는 시험된 혈청의 역가를 A₄₅₀의 선형 회귀 분석에 의해 계산하였고, 이때 차단값 A₄₅₀은 0.5로 설정되었다. 필요하다면, 혈청 내의 이소형-특이적 항-FMDV 항체 (예를 들어 IgG1, IgG2 및 IgA)의 검출을 세로텍(Serotec)이 공급한 이러한 이소형에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 측정하였다. 상기 기술된 바와 유사하게 항체 역가를 결정하였다.

100 ㎕/웰의 10 ㎖ NaHCO₃ 완충제, pH 9.5 내의 2 ㎍/㎖의 FMDV VP1 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 (서열 1-23)가 각각의 VP1 ELISA에서 코팅 항원으로서 사용되었다.

b. 비-구조 단백질 3B 펩티드-기재 ELISA

FMDV 비-구조 (NS) 단백질 3B와의 혈청 항체 반응성에 대한 ELISA를 1:21의 희석으로 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Wang, CY et al. 2001). 펩티드로 면역화된 소 및 음성 소 대조군으로부터의 혈청이 각각의 시험에 포함되었다. 수득된 결과는 차단값 OD 값 (일반적으로 0.220 OD)의 차감 후에 OD 단위로 보고된다.

이러한 FMDV NS 3B 펩티드-기재 ELISA 검정법은 백신 접종 동물을 감염된 동물로부터 구별할 수 있다. 구체적으로, 동물로부터 수득된 혈청이 비-구조 FMDV 단백질과 반응하는지 여부를 기초로 백신 접종 동물 및 감염 동물이 구분될 수 있다. 특히, 본 개시내용의 백신 제제로 면역화된 동물로부터 수득된 혈청은 비-구조 FMDV 단백질과 반응하지 않는데, 이는 백신 제제가 구조 단백질 VP1으로부터의 에피토프만 함유하기 때문이다. 따라서, 감염 동물로부터 수득된 혈청 샘플만 비-구조 FMDV 단백질과 반응한다.

c. 백신 접종 동물과 감염 동물의 구별 (DIVA) 진단 시스템

혈청형 특이적 FMDV VP1 펩티드-기재 ELISA와 조합된 FMDV NS 3B 펩티드-기재 ELISA의 사용은 (1) 감염 동물을 백신 접종 동물로부터 구별하고 (2) 동물이 감염된 또는 이에 대해 백신 접종된 FMDV의 특정 혈청형을 확인하기 위한 유용하고 편리한 도구를 제공한다. 따라서, ELISA 검정법들의 이러한 조합은 혈청학적 수단을 통해 바이러스 시험감염 시 FMDV 백신 효능의 편리하고 유용한 평가를 제공한다.

d. 면역원성 평가

하기 실시예에 기술된 방법에 따라 동물을 면역화시켰다. 백신 제제의 투여 후, 혈액 샘플을 수득하고, 면역원성을 평가하였다.

구체적으로, 면역화된 동물로부터의 샘플을 소의 경우는 0, 3, 및 5의 초기 면역화 후 주수 (wpi)에, 돼지의 경우는 0, 4, 및 6 wpi에 수득하였다. 샘플을 56℃에서 30분 동안 가열하여 혈청 보체 인자들을 불활성화시켰다. 합성 펩티드를 함유하는 제제의 면역원성을 상기 기술된 바와 같이 고체 상 항원으로서 상응하는 FMDV VP1 항원 펩티드를 사용하는 펩티드-기재 ELISA에 의해 평가하였다. 단계적으로 희석된 동물 혈청을 시험하였고, 양성 역가는 역수 희석의 Log₁₀으로서 표현되었다.

혈청양성 샘플을 군으로 풀링하였고, 하기 기술된 바와 같이 FMDV의 다양한 단리물에 대해 중화 활성을 결정하였다.

e. FMDV 바이러스

혈청형 A의 FMDV A₁₂ 및 A₂₄; 혈청형 O의 O₁, O₂, O_타이완, O_오즈크, O_미얀마; 아시아 1_XJ 균주 등을 포함하는 다양한 FMDV 균주를 사용하는 시험감염 연구 (하기 실시예에서 논의됨)에 동물을 적용하였다. 이러한 실험에서 사용된 FMDV 균주를 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포의 단층에서 성장시켰고, USDA의 플럼 아일랜드 동물 질병 센터(Plum Island Animal Disease Center, USDA) (뉴욕주 그린포트) 및/또는 타이완의 국립 동물 건강 연구소(National Institute of Animal Health, Taiwan) (NIAHT)에서 봉쇄 하에 정제하였다. 본질적으로 기존에 기술된 바와 같이 (Brown 1963), 중국 농업 과학 아카데미 란저우 수의학 연구소 중국 농업부 표준 실험실(PRC's Ministry of Agriculture reference laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agriculture Sciences)로부터 산업용 용도로 바이러스가 또한 수득되었고, 이때 펠릿이 1% SDS 또는 1% 노니데트(Nonidet) P-40으로 처리된 후 15-45% 수크로스 구배를 통해 원심분리되었다.

정제된 바이러스 피크를 확인하였고, 260 nm로 설정된 분광광도계의 유동 셀을 통해 각각의 원심분리 튜브의 내용물을 펌핑함으로써 단리하였다.

f. 중화 지수로서의 FMDV 중화 활성의 혈청학적 평가

혈청 샘플을 동물로부터 수득된 혈액으로부터 가공하고, 시험할 때까지 -20℃에서 유지시켰다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 다양한 혈청형의 분취량 (10,000 MPD₅₀)을 사용하여, 일련의 증가되는 입력 바이러스 로드 상에서의 중화 결정에 의해 혈청 샘플의 1:100 희석에 의해 중화된 바이러스의 계산을 달성하였다.

기존에 기술된 방법 (Morgan 1990)을 사용하여 혈청 샘플을 평가하였다. 1:100 희석에서 FMDV 마이크로플라크(microplaque)의 2.5 Log₁₀ 감소를 나타낸 샘플이 FMDV 감염에 대한 방어 면역에 대해 고도로 예보성인 것으로 간주되었다.

g. FMDV -특이적 중화 항체 검정법: 표준 베타 중화 시험

각각의 혈청의 2배 단계 희석물을 100 또는 200 TCID₅₀ (50% 조직 배양 감염 용량)의 FMDV와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 96웰 플레이트에서 표준 베타 중화 시험을 수행하였다. BHK-21 세포의 신선한 단층을 함유하는 96웰 플레이트에서 잔존하는 바이러스 활성을 결정하였다. 바이러스 접종원의 50%를 중화하는 log₁₀ 혈청 희석도로서 혈청 중화 역가가 결정되었다.

예를 들어, FMDV O_{1 타이완}을 중화시키는 항체에 대한 정량적 검정법을 200 ㎕의 동일한 부피를 사용하여 편평 바닥 미량역가 플레이트 내의 BHK-21 세포에 대해 수행하였다. 오십 마이크로리터 (50 ㎕)의 면역화-전 및 면역화-후 희석 혈청을 개별적인 실험 동물들로부터 수집하였다. 이러한 혈청들을 따로따로 200 TCID₅₀의FMDV O_{1 타이완}을 함유하는 50 ㎕ 분취량과 혼합하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 2.5×10⁵개의 BHK-21 세포를 함유하는 백 마이크로리터 (100 ㎕)의 배양 배지 (10.0% 소 태아 혈청이 보충된 MEM (깁코(Gibco))를 각각의 검정법에 첨가하였다. 48시간 후에 세포병변 효과 (CE)에 대해 배양물을 현미경으로 검사하였다. 200 TCID₅₀ 바이러스-유도 CE의 50% 억제를 제공한 혈청의 최종 희석도의 역수로서 역가가 표현되었다.

h. 면역원성 연구에서 사용된 동물

기니 피그: 성숙한 나이브 성체 수컷 및 암컷 던칸-하틀리(Duncan-Hartley) 기니 피그 (300-350 g/BW)에서 면역원성 연구를 수행하였다. 군 당 3마리의 기니 피크가 실험에서 사용되었다.

특정 병원체 부재 (specific pathogen-free: SPF) 농장으로부터의 약 4 내지 12주령의 돼지의 귀에 면역원성 연구에 대해 표지하고, 연구 프로토콜에 따라 3 내지 5마리의 돼지/군으로 군을 나누었다.

소: 지역 공급원으로부터 수득되었고 연구 프로토콜에 따라 3 내지 5마리의 소/군으로 나누어진 2 내지 6개월령의 건강한 수소에서 면역원성 연구를 수행하였다. 바이러스 시험감염 연구에서 사용된 동물들을 생물안전 수준-3-농업 봉쇄 설비 내에 거주시켰고, 1주일 동안 순응시킨 후에 연구를 시작하였다.

염소: 지역 공급원으로부터 수득된 건강한 염소에서 면역원성 연구를 수행하였다.

면역화 전에, 개별적인 동물들로부터의 혈청 샘플을 FMDV-특이적 중화 항체의 존재에 대해 시험하여, 이전에 동물에게 FMDV 백신이 접종되었거나 또는 동물이 FMDV로 감염되지 않았음을 확인하였다. 이러한 동물들로부터의 혈청을 또한 상기 기술된 NS 3B 및 FMDV VP1에 대한 ELISA 검정법을 사용하여 평가하여, 이러한 단백질들에 대한 항체 또한 동물에 없었음을 확실하게 하였다.

종 및 프로토콜에 따라 각각의 동물을 25 내지 300 ㎍/용량의 백신으로 면역화하였다.

i. 조성물

각각의 실험에서 사용된 제약 조성물 및 백신 제제가 하기에 기술된 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다. 간략하게, 각각의 연구 군에서 상술된 제제들은 일반적으로 (1) 서열 1-23, 25-32로부터 선택된 단일 VP1 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원; (2) 서열 1-23, 및 25-32로부터 선택된 상동체들을 포함하는 VP1 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 혼합물; 또는 (3) 서열 33-92로부터 선택된 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드들의 혼합물이 보충된 서열 1-23 및 25-32로부터 선택된 VP1 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원들의 혼합물을 함유하였다. 특정 아주반트 제제에서 펩티드가 유화되었다. 백신은 일반적으로 합성 FMDV 펩티드 면역원을 물에 약 25 내지 300 ㎍/㎖로 용해시킴으로써 제조되었고, 셉픽(Seppic)의 몬타니드 ISA 50V2로 유중수 (w/o) 에멀젼 (1:1 부피)으로 제제화되었다. 백신 제제를 실온에서 약 30분 동안 유지시켰고, 면역화 전에 약 10 내지 15초 동안 와동시켰다.

일부 동물을 2회 용량의 특정 백신 제제로 면역화시켰고, 이는 0 (최초) 및 3 wpi (부스터)에 근육 내로 (IMO) 투여되었다. 그 후, 이러한 면역화된 동물들을 시험하여, 백신 제제 내에 존재하는 합성 FMDV 에피토프 면역원의 면역원성을 평가하였다. 나머지 동물들을 단일 용량의 특정 백신 제제로 면역화하여, 제제에서 사용된 펩티드가 FMDV에 대한 반응 백신으로서 적격인 상당한 중화 항체 반응을 효율적으로 개시시킬 수 있는지 여부를 평가하였다.

실시예 3

FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드의 스크리닝 및 확인을 위한 T 세포 기능검정법

T 세포 기능 실험에 대한 절차가 하기와 같이 상세하게 기술된다.

a. 말초혈 단핵 세포 ( PBMC )의 단리, 동결 및 해동

헤파린 처리 혈액을 수집하고, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다. 포스페이트-완충 염수 (PBS)에서 2회 세척한 후, PBMC를 10% FCS가 보충된 RPMI 1640으로 이루어진 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 일부 실험의 경우, 단리된 PBMC를 동결시키고, 액체 N₂에서 보관하고, 후속 시험관 배양을 위해 해동시켰다.

b. 혈청 IFN -γ 정량

샌드위치 ELISA를 사용하여, 돼지 또는 소로부터 수집된 혈청 샘플 내의 IFN-γ를 정량하였다. 백신접종 전 및 동물에게 FMDV를 시험감염하기 전 제21일 또는 제28일에 IFN-γ를 정량하였다. 먼저 맥시소르브(Maxisorb) ELISA 플레이트 (눈크(Nunc))의 개별적인 웰을 0.5 ㎍/웰의 포획 항체 (미국의 PBL 바이오메디컬 래버러토리즈(PBL Biomedical Laboratories)에서 구입함)로 코팅함으로써 검정법을 수행하였다. 각각의 검정법 웰 내로 200 ㎕의 ELISA 차단 완충제를 첨가함으로써, 고정된 항체가 점유하지 않은 부위를 차단하였다. 플레이트를 각각 200 ㎕의 0.025% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBS-T20)로 4회 세척한 후, ELISA 희석 완충제에 개별적으로 희석된 혈청 샘플 (1:10, 25 및 75)을 검정법 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여, 사이토카인이 고체 상 항-IFN-γ 포획 항체에 결합되게 하였다. 그 후, 플레이트를 PBS로 4회 세척하고, 항-IFN-γ 항체의 검출을 0.25 ㎍/웰로 검정법 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 100 ㎕의 단백질 A 접합체를 각각의 시험 웰에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 기간 후에 과량의 접합체를 세척하여 제거하고 (PBS로 6회), 100 ㎕의 권장 기질 용액을 반응 검출을 위해 첨가하였다. 개별적인 검정법 웰에서의 발색을 50 ㎕의 1N H₂SO₄를 첨가하여 30분 후에 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 색 강도를 기록하였다. 먼저, 개별적인 혈청으로부터 수득된 A₄₅₀ 측정값을 동일한 시험 조건 하에 표준 재조합 IFN-γ (PBL 바이오메디컬 래버러토리즈, 미국)의 희석물을 검정함으로써 구축된 보정 그래프에 비교함으로써 결과를 계산하였다. 면역화 전의 동물에 대해 측정된 값을 차감함으로써 백신접종 후 제28일의 각각의 동물의 혈청에서의 IFN-γ 반응을 나타냈다. 최종 결과는 혈청 1 ㎖ 당 pg으로서 표현되었다.

c. PBMC에 의해 생산된 IFN -γ의 검정법

백신 접종 동물로부터의 PBMC를 2.5×10⁶개의 세포/㎖로 10.0 ㎍의 선택된 백신 면역원 조성물의 존재 하에 24웰 배양 플레이트 (눈크)의 개별적인 웰에서 배양하였다. 자극 항원 없이 PBMC만 함유하는 음성 대조군 배양물이 또한 포함되었다. 모든 배양물을 37℃에서 3일 동안 5.0% CO₂ 인큐베이터에서 유지시켰다. 배양 개시 3일 후에 상청액을 수집하고, 상기 기술된 정량적 검정법을 사용하여 IFN-γ 함량을 측정하였다.

실시예 4

돼지 및 소 동물에서의 FMDV 시험감염 절차

시험감염 절차는, 일반적으로, OIE 표준 매뉴얼(OIE Manual of Standards)의 구제역 챕터에 기술된 프로토콜을 기초로 하였다. 시험감염 절차에서 사용된 FMDV 균주는 O-1_{타이완 (99)}, O-1_{미얀마 (02)}, O-1_{오즈크 (차이나, 93)}, O-1 _캄포스, 및 아시아 1_{( XJ 또는 지앙수 , 차이나, 05)}을 포함하였다. 중국에서 수행된 돼지 시험감염 연구를 위한 절차는 농업부 가이드라인에 따라 근육내 경로를 통해 FMDV 바이러스를 투여함으로써 변형되었다.

a. 돼지

표준화된 보호 감염 용량 (PD₅₀) (즉, 시험 동물의 50%가 보호되었을 때의 투여량)을 동물에서 측정하였다. 효능 시험에서 무게가 약 40 ㎏인 돼지 15마리 (각각 5마리의 돼지를 함유하는 3개의 군으로 무작위로 나뉨)를 사용함으로서 돼지에서의 PD₅₀을 결정하였다. 3개의 군에 각각 1회 용량, 1/3회 용량 및 1/9회 용량의 시험 백신 제제를 투여하였다. 특정 제제의 효능을 평가하기 위해 투약에 대한 변형, 예컨대 2×, 1×, 0.5× 및 0.25× 용량을 함유하는 투여량을 또한 사용하였다. 추가적으로, 1× 용량을 사용하는 제제의 신속한 스크리닝을 또한 빈번하게 사용하였다.

백신 제제 효능의 평가를 위해, 돼지를 실험 디자인 및 특정 연구용 시점의 동물의 이용가능성을 기초로 군 당 (5마리 대신) 3마리를 함유하는 군으로 나누었다. 이러한 3개의 군의 각각의 돼지에 근육내 (IM) 경로를 통해 귀 뒤에서 백신을 접종하였다. 단일 백신 접종 28일 후에, 1,000 ID₅₀의 지시된 바와 같은 FMD O-유형 균주로부터의 병독성 바이러스를 동물에게 접종함으로써, 2마리의 대조군 돼지와 함께 15마리의 백신 접종 돼지에 각각 시험감염을 행하였다.

이상적인 실험에서는, 10일의 모니터링 후에 대조군 돼지의 하나 이상의 발굽에서 소포성 병변이 발견되었어야 했다. 추가적으로, 백신 보호가 실패하지 않으면, 백신접종 돼지에서는 FMD 증상 또는 징후가 관찰되지 않아야 한다. 시험감염 시험의 결과를 기초로 리드-무네흐(Reed-Muench) 방법을 사용하여 백신 제품의 PD₅₀을 계산하였다. 품질 방출 시험을 통과하기 위해 백신의 표적 용량은 최소한 3 PD₅₀을 함유하여야 한다.

타이완에서, 농업 위원회의 가이드라인에 따라 국립 동물 건강 연구소 (타이완 탐수이)의 P3 설비에서 1×10⁵ TCID₅₀ (조직 배양에서 미리 적정됨)의 FMDV O_{1 타이완} 바이러스 (PRC 가이드라인에 따라 투여되는 양보다 약 10배 이상 더 높음)를 돼지 앞다리의 제구 내로 접종하는 것을 통해 바이러스 시험감염이 수행되었다. 실험 동물을 14일 관찰 기간에 걸쳐 FMD의 임상 징후에 대해 모니터링하였다. 이러한 관찰은 (1) 체온을 매일 기록하는 것, (2) 동물 다리에서의 모든 절름발이의 발달을 모니터링하는 것, 및 (2) 동물의 다리의 관상대 및 주둥이 상에서의 모든 후천적 소포성 병변을 모니터링하는 것을 포함하였다. 시험감염 시험의 결과를 기초로 리드-무네흐 방법을 사용하여 백신 제품의 PD₅₀을 계산하였다. 백신 방출을 허용하기 위해 백신의 표적 용량은 최소한 3 PD₅₀을 함유하여야 한다.

b. 소

소에서, 총 1×10⁴ TCID₅₀의 FMDV (소 감염 단위(Bovine Infectious Unit) 또는 BIU)를 함유하도록 적정 및 조정된 침연물 1 ㎖ (혀 위의 10개의 부위 각각에 100 ㎕)의 설피내 (intradermolingual: IDL) 접종에 의해 바이러스 시험감염이 도입되었다. 직장 온도를 매일 모니터링함으로써 동물을 검사하였고, 병변이 나타난 시간 및 병변의 횟수 및 중증도를 기초로 하는 보호 점수를 결정하였다.

완전한 보호는 병변이 완전히 없는 것 (0점)으로서 정의되었고, 8점 미만의 점수는 부분적인 보호로 간주되었다. 하기와 같이 임상 점수를 계산하였다:

i) 40℃ (1점), > 40.5 (2점), 또는 > 41 (3점)의 체온 상승;

ii) 식욕 감소 (1점) 또는 음식을 섭취하지 않고 전날부터 음식이 남음 (2점);

iii) 절름발이 (1점) 또는 서있기를 꺼림 (2점);

iv) 관상대의 촉진 후 열 및 통증이 존재함 (1점) 또는 영향을 받은 발로 서지 않음 (2점);

v) 영향을 받은 발의 수에 따라 최대 4점의 발 위의 소포; 및

vi) 혀 (1점), 잇몸 또는 입술 (1점) 또는 주둥이 (1점) 상의 가시적인 입 병변 (최대 3점).

살아 있는 동물의 모든 실험은 OIE 표준 매뉴얼, PRC 농업부 또는 타이완 농업 위원회의 가이드라인 하에 수행되었다. 특정 제제의 효능을 평가하기 위해 투약에 대한 변형, 예컨대 2×, 1×, 0.5× 및 0.25× 용량을 함유하는 투여량을 또한 사용하였다. 또한, 1× 용량을 사용하는 제제의 신속한 스크리닝을 또한 빈번하게 사용하였다.

실시예 5

FMDV O _{타이완 99} 단리물 서열을 아미노산 프레임워크 구조로 사용하는 FMDV 단리물의 완전 게놈 서열의 비교 분석, 및 펩티드 면역원 디자인을 위한 FMDV B 및 내인성 Th 에피토프의 위치

FMDV 게놈 구성의 철저한 검토 후에, FMDV 혈청형 O_{타이완 99} 다기능단백질 아미노산 서열을 FMDV 항원 펩티드의 확인 및 디자인을 위한 기초로서 사용하였다. 이같은 펩티드들은, 일단 프레임워크가 확립되면, 지역 용도를 위한 다중 혈청형에 대한 서열을 나타내도록 조정될 수 있다. 기존에 기술된 바 (Carrillo 2005)와 같은 상응하는 진뱅크 수탁 번호를 통해 접속된 7개의 혈청형 모두를 나타내는 103개의 FMDV 단리물의 완전 게놈 서열과 FMDV O_{타이완 99} 서열의 정렬로 가변성에 대한 기능적 구속을 나타내는 고도로 보존된 FMDV 단백질 영역, 뿐만 아니라 잠재적인 생물학적 관련성이 있는 신규 바이러스 모티프가 확인되었다. 구체적으로, FMDV VP1 단백질 "RGD" 수용체 결합 부위 주변의 서열 및 이의 혈청형-관련 컨센서스 서열 (즉, 디자인되고 있는 특정 혈청형의 FMDV 단리물들의 서열의 비교를 기초로 각각의 위치에 대해 가장 빈번하게 나타나는 아미노산)은 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 디자인을 위한 청사진인 반면, 고도로 보존된 FMDV 단백질 영역은 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 디자인을 위한 표적 부위였다. 실시예 3에서 상세하게 기술된 절차로 혈청학적 검정법 및 세포 검정법 양쪽 모두에 의해 스크리닝한 후, 일련의 언급된 B 및 T 헬퍼 세포 에피토프 클러스터 펩티드 (서열 1 내지 102)가 도 1 및 표 1 내지 8에 나타난 바와 같이 상이한 균주 및 혈청형을 나타내는 FMDV 백신 제제에서의 적용을 위해 확인되었다.

실시예 6

FMDV 펩티드 기반 백신을 위한 주요 성분으로서의 FMDV B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 분석

a. 디자인 역사

각각의 백신 또는 면역치료 제품은 특정 질병 메커니즘 및 개입에 필요한 표적 단백질(들)을 기초로 하는 자기 자신의 디자인 초점 및 접근법을 필요로 한다. 디자인이 이에 따라서 성형되는 표적은 질병 경로에서 수반되는 세포 단백질, 또는 여러 단백질이 수반될 수 있는 감염체를 포함할 수 있다.

B 및 T 세포 에피토프 확인 및 분포에 대한 종래의 지식 또한 분자성 디자인 공정에 이롭다. 일단 표적 분자(들)이 선택되면 광범위한 혈청학적 확인 공정이 요구된다. 이어서, 디자인된 펩티드의 백신 제제에 의해 도출된 항체의 기능적 성질을 평가하기 위해 소형 동물에서의 연속적인 파일럿 면역원성 연구가 수행된다. 그 후, 이같은 혈청학적 적용이 백신 면역원성 및 도출된 항체의 기능적 성질의 추가적인 확인을 위해 표적 종의 동물에서 수행된다. 모든 연구는 평가를 위한 면역화된 숙주로부터 수집된 혈청으로 다중 병행 군에서 수행된다. 디자인 방향을 추가로 확인하기 위해 표적 종에서의 초기 시험감염 연구가 또한 수행된다. 그 후, 각각의 제제 디자인에 대비하기 위해 조합되어 사용되는 경우의 펩티드 구축물들 사이의 각각의 상호작용과 관련된 기능적 성질에서의 미세한 차이를 평가하기 위해 표적 펩티드가 다양한 혼합물에서 제조된다. 추가적인 평가 후에, 최종 펩티드 구축물, 펩티드 조성물 및 이의 제제가 제제의 각각의 물리학적 파라미터와 함께 확립되어, 최종 생성물 개발 공정에 이른다.

광범위한 디자인 경험은 가속된 속도로 도 2에 제시된 바와 같이 발견에서 상업화까지의 차세대 백신 제품의 개발을 허용한다.

특정 FMDV 펩티드 및 조성물의 개발 동안, 하기의 개발 목표가 고려되었다: 1) 광범위한 중화 항체를 도출시키는데 충분한 VP1 루프 도메인 표적 부위를 확인하는 것, 2) 면역계에 대한 최적 제시를 위한 펩티드 표적 부위를 디자인하는 것, 3) 돼지 및 반추동물 표적 종에서의 면역역가를 위한 UBITh® 부위를 선택하는 것, 4) 이러한 필수 성분을 비용-효율적으로 생산될 수 있는 펩티드 면역원 디자인 내로 혼입시키는 것, 및 5) 방어 면역을 위한 백신 제제, 용량 크기, 및 면역화 프로토콜을 개발하는 것. FMDV 펩티드 면역원을 분석 및 평가하는 전체적인 목표는 FMDV 서열 데이터베이스 및 분자 모델의 집중적인 실증 조사에 이어지는 동물을 면역화시키기 위한 백신 제제를 위한 다수의 후보 면역원의 합성을 필요로 하였다. 총 831마리의 돼지 및 860마리의 소가 오직 1회의 투여 후에 바이러스 시험감염 시 돼지 및 소 동물을 효과적으로 보호할 수 있는 조성물 및 제제를 발견하기 위한 면역원성 및 중화 항체 역가 연구에 있었다. 전체적으로, 본 발명을 개발하는 것에서 수반된 기니 피그 및 염소에서의 초기 연구에 더하여, 돼지에서의 25개의 연구 및 소에서의 32개의 연구가 있었다.

b. 가장 강력한 VP1 루프 도메인 표적의 확인

FMDV에 대한 효과적인 펩티드 백신을 위한 결정적인 요소는 중화 항체의 생산을 도출시키는 B 세포 에피토프의 제시에 최적인 VP1의 G-H 루프 도메인으로부터의 정확한 서열의 선택이다. 펩티드 면역원에 의한 도메인의 최적 제시를 위한 프레임은 단일 아미노산 위치만큼 작은 이동에 의해 영향을 받을 수 있다. VP1 캡시드 단백질의 입체형상 구조에 대한 입수가능한 분자 모델을 검사하고, 이러한 초가변 영역 내에서의 서열 비교를 VP1에 대한 교차 반응성이 양호한 합성 면역원이 루프 도메인의 확장된 절편을 포함하여야 한다는 것을 결정하는 것에서 평가하였다.

표 8에서 나타난 바와 같이 혈청형 A의 FMDV A₁₂의 서열을 기초로 aa134-159 또는 aa134-169를 포함하는 VP1 표적 부위가 있는 펩티드 면역원이 생산되었다. 이러한 펩티드의 면역원성을 펩티드를 단독으로 함유하는 조성물 또는 보충적인 T 세포 도움을 위한 FMDV 내인성 Th 에피토프 또는 외인성 Th 에피토프를 또한 함유하는 조성물에서 결정하였다. 루프 구조를 안정화시키는 고리형 구속이 있는 펩티드 또는 이러한 구속이 없는 펩티드 상에서 면역원성 검정법을 또한 수행하였다. 특정 위치에서의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환하여 디술피드 결합을 생성시킴으로서 펩티드의 고리화가 용이해졌다 (예를 들어, VP1 위치 134(N->C) 및 158(Q->C)).

다양한 펩티드를 함유하는 조성물을 기니 피그에서 면역역가에 대해 평가하였다. 표 9는 다양한 펩티드의 평가로부터 수득된 실험 결과를 제공한다. 표 9는 하기를 나타낸다:

i. 더 긴 펩티드 구축물이 더 양호한 중화 반응을 제공하였다. 예를 들어, 서열 97이 서열 96과 비교하여 더 양호한 중화 반응을 제공하였다. 추가적으로, 잔기 129까지의 표적 부위의 추가적인 확장 (서열 99) 또한 특정 용도에 유용한 것으로 증명되었다.

ii. 고리화된 펩티드가 이러한 구조를 함유하지 않은 펩티드와 비교하여 더 높은 중화 활성을 제공하였다. 예를 들어, 고리형 펩티드 서열 98이 서열 97과 비교하여 더 높은 중화 활성을 제공하였다.

iii. FMDV VP1 도메인에 연결된 인공 Th 에피토프 UBITh® (서열 24)로부터의 Th 부위에 의해 제공된 외인성 Th가 이러한 에피토프를 함유하지 않은 구축물을 넘어서는 중화 효능을 일으켰다. 예를 들어, 서열 100이 서열 99, 98, 97 및 96과 비교하여 더 양호한 중화 활성을 제공하였다.

iv. 조성물 내에 외인성 Th 에피토프를 첨가하는 것에 의해 면역원성이 추가로 강화되었다.

이러한 결과들의 관점에서, 아미노산 129에서 169까지의 확장된 VP1 표적 부위를 함유하는 고리형 펩티드가 가장 면역강화성인 것으로 결정되었다 (예를 들어, 서열 99).

c. 혈청형-특이적 VP1 표적 부위의 디자인

영국 퍼브라이트의 세계 표준 실험실에서 제공한 포괄적인 FMDV에 대한 FMDV 서열 데이터베이스를 검색하여 혈청형 O, A, 아시아, C 등으로부터의 하위유형에 대한 다양한 VP1 루프 도메인 (아미노산 129-169)을 수득하였다. 그 후, 각각의 위치에 대한 컨센서스 아미노산을 표 2에 나타난 바와 같이 디자인하였다. 더욱 더 광범위하게 VP1 루프 도메인의 항원 가변성을 포함하도록 단일 위치에 다중 아미노산이 있는 표 8에 나타난 바와 같은 조합형 라이브러리 표적 서열 (서열 101 및 102)을 또한 제조하였다.

단일 컨센서스 서열 (표 11, 서열 25)을 사용하는 면역원성 시험과 조합형 라이브러리 표적 (표 10, 서열 98 및 99)을 사용하는 면역원성 시험의 비교는 이러한 2가지 접근법 (표 10 및 11)에 대한 면역원성에 대한 VP1 기반 ELISA 역가 및 각각의 혈청형의 FMDV 균주에 대한 중화 지수에 의해 판단되는 바와 같이 혈청형 적용범위의 범위에 걸쳐 컨센서스 서열이 등가의 효능을 제공하였음을 나타낸다. 따라서, 제작 및 QC의 용이성을 위해, 단일 컨센서스 서열의 고리화된 표적 VP1 부위 및 지역적인 요구를 기초로 특정 혈청형으로부터 선택된 일부 특이적 VP1 서열이 서열 2-23 및 25-33에서 나타난 바와 같이 선택되었다.

d. VP1 면역원성을 강화하는 강력한 Th 에피토프의 선택

기존의 연구원들은 FMDV 항원 내의 Th 부위, 예컨대 VP1 21-40 에피토프를 확인하였고, 이들을 자신의 합성 VP1 면역원 디자인 내로 포함시켰다. 그러나, 돼지 및 소에서의 면역원성 연구는 이러한 FMDV 내인성 Th 부위들이 이들의 한정된 혼란성(promiscuity) 및 유전적 제한으로 인해 표적 종에서 VP1 면역원성을 강화시키는데 완전히 효과적이지 않다는 것을 나타냈다. 따라서, 부분적으로 효과적인 FMDV Th 에피토프가 사용되지 않았고, FMDV VP1 루프화 펩티드 면역원을 강화하기 위해 더욱 강력한 UBITh® 인공 Th 에피토프로 교체되었다. 인공 UBITh® 부위는 조합형 라이브러리 Th 위치를 포함하여 Th 모티프를 혼입시키고, 이는 유전학적으로 다양한 집단의 다양한 T 세포 반응성을 수용하도록 디자인되었다. Th 에피토프에서의 이러한 변화는 잠재적인 상동성 항-FMDV 메모리 반응의 상실을 초래하였지만 (노출 시), 더 넓고 더욱 강력한 면역 반응성을 제공하였다. 인공 UBITh® 서열 (서열 24)은 돼지를 포함하여 여러 종에서의 면역역가가 입증되었다.

표 10에 요약된 실험에서 사용된 구축물은 인공 UBITh® 부위 (서열 24), 스페이서로서의 엡실론 리신, 및 조합형 라이브러리로서 디자인된 혈청형 O 또는 혈청형 아시아에 대한 아미노산 위치 134 내지 169로부터의 고리형 VP1 표적 부위 (서열 101 및 102)를 포함하였다. 면역화된 기니 피그의 항체 및 중화 반응 (중화 지수로서 표현됨)에 의해 나타난 바와 같이 양쪽 구축물 모두 면역원성이었다.

표 11은 UBITh® 부위 (서열 24)가 엡실론 리신 스페이서를 통해 컨센서스 O 서열 (서열 25)의 아미노산 위치 129 내지 169로부터의 고리형 VP1 표적 부위에 연결된 유사한 혈청형 O 면역원에 대한 기니 피그의 반응성을 나타낸다. 빠르게는 최초 면역화 후 3주의 강력한 넓은 중화 항체 반응에 의해 증명되는 바와 같이 (표 11), O 컨센서스 서열을 함유하는 이러한 VP1 구축물 또한 강한 면역원성을 나타냈다.

e. 중화 반응의 예상 밖의 범위

표 10 및 11에서 중화 활성에 대해 분석된 기니 피그 면역 혈청이 예상 밖으로 넓은 중화를 나타냈다. 구체적으로, 서열 101 및 25의 혈청형 O 면역원이 2개의 O 하위유형에 대한 중화 항체를 도출시켰고, 혈청형 A 및 아시아로부터의 하위유형의 중화를 또한 제공하였다. 이러한 결과들은 개별적인 면역원에 의한 다중 혈청형에 대한 넓은 효능에 대한 UBITh® FMDV 면역원의 잠재력을 시사한다.

면역화 및 시험감염 피그로부터의 혈청이 O_타이완, O_{마니사 ( Manisa )}, O_캄포스 및 O_미얀마에 대한 중화 지수에서의 범위를 나타냈을 때, 표 12에 제시된 바와 같은 여러 면역원 (서열 25, 27, 및 28의 3개의 펩티드의 혼합물을 함유한 UBI FMDV O 백신)을 단일 백신으로 조합함으로써 혈청형 중화에서의 이같은 범위가 또한 제공될 수 있다.

f. 돼지에서의 면역화/시험감염 시험

표적 종인 돼지에서의 3가지 별도의 면역화/시험감염 시험에서, FMDV에 대한 최초의 유나이티드 바이오메디컬 인크(Untied Biomedical, Inc.) (UBI)의 합성 펩티드 백신인 UBITh® FMDV-O 백신이 FMDV O1_타이완 균주로의 감염성 시험감염에 대해 보호적인 것으로 증명되었다. 타이완의 국립 동물 건강 연구소 (NIAHT) 및 USDA의 플럼 아일랜드 동물 질병 센터 (PIADC)가 포함되는 3개의 별도의 기관에서 시험이 행해졌다.

이러한 실험으로부터의 결과가 표 13에서 요약된다. 군 1-4에게는 2회 용량의 UBITh® FMDV-O_컨센서스 (서열 25, 펩티드 2570) 백신을 제공하였다. 용량은 25, 50, 100 내지 300 ㎍ 범위였다 (군 1 내지 4). 군 5-7은 위약 대조군이었다.

모든 돼지에서 10^4.5 TCID₅₀의 FMDV O1_타이완을 제구 내로 주사함으로써 시험감염을 행하였다 (바이러스는 베이비 햄스터 신장 세포 또는 돼지에서 성장되었다). 최종 면역화 후 2 내지 10주의 간격으로 돼지에서 시험감염을 행하였다. 15마리의 UBITh®-면역화 돼지를 포함하여 모든 면역화 돼지가 보호되었다. 제10주까지 UBITh®-면역화 돼지에서 방어 면역이 지속되었다. 실험적으로 면역화되었지만 시험감염되지 않은 돼지에서의 중화 항체 역가에 의해 나타나는 바와 같은 최종 면역화 후 20주까지의 방어 면역의 증거가 또한 수득되었다.

백신 접종 동물은 모두 중화 항체의 혈청 수준이 유의하였고, 시험감염으로부터 보호되었다. 위약-면역화 돼지의 100% 감염률에 의해 3회의 별도의 시험에서 사용된 바이러스 시험감염 모액의 감염력이 확립되었다. 따라서, 3가지 실험 모두로부터의 결과가 유효하였다. 수득된 결과의 관점에서, UBITh® FMDV-O_컨센서스 (서열 25, 펩티드 2570) 백신은 적게는 용량 크기 25 ㎍의 2회 면역으로 완전한 방어 면역을 제공하였다 (군 1).

g. 시험감염 돼지에서의 방어 면역의 범위

용량 당 25 ㎍의 용량의 동일한 양의 3가지 VP1 O 구축물을 함유하는 UBITh® FMDV O 백신 (각각 서열 25, 27 및 28로 표현되는 균주 2570a 컨센서스, O_{오즈크 /93}, O_미얀마로부터의 서열을 함유함)으로 또 다른 시험감염 연구를 수행하였고, 2회-용량 체계로 제0주 및 제3주에 면역화하였다. 6마리 돼지 모두가 FMDV O1_타이완으로 유사하게 시험감염되었고, 모두 보호되었다. 시험감염 시험에 대해 면역화된 6마리의 돼지로부터 혈청을 수집하였고, 고도로 유행성인 FMDV O 하위유형인 O1_타이완, O_마니사, O_미얀마 및 O_캄포스에 대해 중화 항체가 결정되었다 (표 12). 모든 돼지가 단일 면역에 필적하는 O1_타이완 중화 항체의 수준을 생산하였고, O_마니사, O_미얀마 및 O_캄포스에 대한 더 강력한 중화 반응을 또한 함유하였으며, 이는 혈청형 O 하위유형들에 걸쳐진 더욱 신뢰할 수 있는 방어 면역을 가리킨다.

h. 반추 동물에서의 면역원성

UBITh® FMDV-O O_컨센서스 (서열 25, 펩티드 2570) 백신의 면역원성이 염소 12마리의 면역원성 시험에서 반추동물 종에서 나타났다. 염소를 제0주 및 제8주에 2회 용량으로 또는 제0주, 제4주 및 제8주에 3회 용량으로 면역화시켰다. 용량은 30 ㎍, 100 ㎍, 또는 300 ㎍이었다. FMDV O1_타이완에 대한 중화 항체의 혈청 수준을 결정함으로써 효능을 평가하였다. 보호를 예보하는 중화 항체 수준이 제8주의 최종 면역화 후 12주까지 (즉, 20주의 연구 기간에 걸쳐) 수득되었다. 2회 용량 및 3회 용량 일정 양쪽 모두 동일하게 효과적이었고, 30 ㎍ 용량이 300 ㎍ 용량만큼 효과적이었다. 따라서, 2회 또는 3회 용량으로 투여되었을 때 돼지에서의 방어 면역에 대해 사용된 것과 등가의 용량 크기 및 백신 제제에서 표적 반추동물 종에서 UBITh® FMDV-O 백신에 대해 면역원성이 나타났다.

i. 결론 및 결과 해석

하기와 같이 상기 기술된 실험으로부터의 결과가 요약될 수 있다:

용량 당 25, 50, 100 및 300 ㎍의 용량의 2회 면역화 후에, UBITh® FMDV VP1을 기반으로 하는 O 백신 (서열 25)이 3개의 국제 기관에서 4개의 실험 군으로 수행된 연구에서 모든 (15/15) 백신접종 돼지를 FMDV O_타이완 시험감염으로부터 효과적으로 보호하였다. 모든 (10/10) 대조군 동물이 바이러스 시험감염의 제2일에 감염되었다.

VP1 O 구축물의 혼합물을 함유하는 UBITh® FMDV O 백신 (동일한 비의 서열 25, 27 및 28; 최초 면역화 후 제0주 및 제3주에 제공된 2회 용량에 대해 용량 당 25 ㎍)이 돼지에서 O_타이완, O_캄포스, O_미얀마 및 O_마니사를 포함하는 다중 FMDV O 단리물에 대한 광범위하게 보호적인 중화 항체들을 도출시켰다.

UBITh® FMDV O 백신은 반추동물 종인 염소에서 돼지에서 나타난 것과 등가의 면역원성을 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 UBI 제제가 돼지에 대한 면역원성 용량 범위에 필적하는 용량 범위에서 소에서 효과적일 것임을 예보한다.

개별적인 UBITh® 합성 FMDV 면역원들이 기니 피그에서 혈청형 A, O 및 아시아 1에 대해 동시에 중화 항체를 도출시켰고, 이는 다중 혈청형을 가로지르는 예상 밖의 넓은 효능에 대한 잠재력을 나타낸다.

혈청형 O_컨센서스 서열을 사용하는 UBITh® FMDV O 펩티드는 혈청형 A, 아시아 1 및 O으로부터의 하위유형을 포함하는 다중 혈청형에 대해 중화 지수에 의해 측정되는 중화 항체를 도출시킬 수 있다.

UBITh® FMDV 백신 면역원은 성질 면에서 "기능성 부위"-지향성이고 합성이다. 제제화된 백신은 안전하고, 강력하며, 광범위하게 중화성이고, 재현가능하고, 안정적이며, 따라서 통상적인 죽은 바이러스 백신과 연관된 생산 및 품질 제어-관련 난점 및 단점을 우회한다.

완전히 안전한 화학적으로 규정된 백신의 입수가능성은 FMD가 없는 상태에 접근 중인 지역에서도 백신접종을 장려함으로써 FMDV의 박멸을 진척시킬 수 있다.

실시예 7

지역적인 요구에 맞춰진 FMDV 펩티드 기반 다가 백신을 위한 주요 성분으로서의 합성 FMDV 펩티드 면역원의 펩티드 상동체

전통적으로 구제역 백신은 전체 가축 생물학적 사업의 26.4%로 판매 면에서 전세계 수의학 백신 시장의 최대 점유를 나타낸다. FMDV 혈청형 및 하위유형의 높은 가변성으로 인해, 고전적인 바이러스 용해물-기반 FMD 백신의 항원 조성이 특정 세계 지역에 대해, 그리고 다수의 경우에 특정 국가 또는 국자 내의 지역에 대해 맞춰진다. FMD-풍토성 지역에서의 현재의 백신 사용은 (1) 표적 구역에서 퍼지고 있는 균주(들)에 대해 백신이 효과적일 것인지 여부를 결정하고, (2) 백신의 실제 프로파일이 제어 및 박멸에 적절하다는 것을 확실히 하기 위해 질병 역학의 심층 조사 및 백신 조화 연구를 필요로 한다.

분자 바이러스학의 출현으로, 구제역 바이러스의 캡시드 단백질 VP1 서열의 많은 부분이 국립 감시 관례에 따라 제출된 FMD 사례로부터의 조직 샘플, 뿐만 아니라 FMDV 돌발로부터 수집된 다중 조직 및 프로방(probang) 샘플로부터 수득된 바이러스 단리물로부터 역전사-의존적 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 쉽게 증폭될 수 있었다. 확인된 VP1 서열들을 정렬할 수 있었다. 정렬은 지시된 다른 단리물과 유전학적 관련이 있는 혈청형들의 서열을 포함한다. 표적 구역에서 퍼지고 있는 균주(들)의 VP1 서열을 본 발명의 개시내용에서 확립된 아미노산 프레임워크 (VP1 129-168) 및 이러한 프레임워크에 대한 펩티드 상동체 (표 2, 서열 2-23)를 기초로 쉽게 수득할 수 있고, 이는 특정 지역 요구에 대해 맞춰진, 제어 및 박멸에 대한 이들의 적절성을 확실히 하기 위해 백신 제제 내에 포함될 지역적으로 확인된 FMDV 돌발 및 이렇게 디자인된 VP1 펩티드 상동체 (표 3, 서열 25-33)에 대한 확인된 VP1 서열을 나타낸다.

2회 이상의 용량으로 투여될 때 주요 성분으로서 합성 FMDV 펩티드 면역원 (VP1 aa129 내지 aa168이 있음)으로부터 유래된 펩티드 상동체들을 함유하는 특정 제제는 표 14에 제시된 예들을 포함한다:

(a) 펩티드 상동체 (서열 25)가 있는 1가 돼지 FMDV 혈청형 O 백신;

(b) 동일한 중량비의 2개의 펩티드 상동체 (서열 25 및 28)의 혼합물이 있는 2가 돼지 FMDV 혈청형 O 백신;

(c) 동일한 중량비의 3개의 펩티드 상동체 (서열 25, 27 및 28)의 혼합물이 있는 3가 돼지 FMDV 혈청형 O 백신;

(d) 아시아에서 사용하기 위한 동일한 비의 2개의 펩티드 상동체 (서열 25 및 29)의 혼합물이 있는 2가 소/반추동물 FMDV 혈청형 O 및 아시아 1 백신;

(e) 중국에서 사용하기 위한 동일한 비의 3가 소/반추동물 FMDV 혈청형 O, 아시아 1_지앙수 및 A_간수 백신 (서열 25, 29 및 31);

(f) 브라질에서 사용하기 위한 동일한 비의 3가 소/반추동물 FMDV 혈청형 O_캄포스, A24, 및 C_인다이알 백신 (서열 26, 30 및 32);

(g) 아르헨티나에서 사용하기 위한 동일한 비의 3가 소/반추동물 FMDV 혈청형 O_캄포스, A_{24/아르헨티나 2001}, 및 C_인다이알 백신 (서열 26, 30, 33 및 32).

최종 백신 제제에서 사용하기 위한 디자인된 펩티드 상동체의 적절성을 실시예 1에 기술된 바와 같은 특이적인 FMDV VP1 서열-기반 펩티드 ELISA에 의한 상이한 단리물들로부터의 FMDV VP1 항원에 대한 교차-반응성 및 상대적인 면역원성의 검출을 통해 평가할 수 있었다.

표 15 내지 17에 나타난 바와 같이, VP1 상동체-기반 백신 제제 (a) 내지 (g) (서열 25-33의 상동체를 함유함)는 특정한 지역적 요구 (예를 들어, 중국, 동남아시아, 브라질 및 아르헨티나)를 충족시킨다. 구체적으로, 이러한 제제들은 표적화된 혈청형 (예를 들어 O_타이완, O_캄포스, O_오즈크, O_미얀마, 아시아 1, A_간수, A₂₄, A_{아르 헨티나 2001}, C_인다이알)의 VP1 서열에 대한 원하는 면역원성을 제공한다. 또한, 혈청형 O_타이완99를 포함하지만 이에 한정되지 않는 표적화된 혈청형에 대한 중화 항체를 도출시키는 이들의 능력에 의해 실연되는 바와 같이 이러한 FMDV 백신 제제들에 대해 기능성인 면역원성이 또한 관찰되었다 (실시예 6, 표 12에 기술된 바와 같음). 백신 제제에서 사용된 전체 FMDV 중화 항체-유도 VP1 기반 B 세포 성분은 면역화 일정에서 2회 용량으로 투여된 경우에 용량 당 25 ㎍만큼 낮을 수 있다.

실시예 8

VP1 단백질에서 유래된 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드만 함유하는 FMDV 백신 제제가 단일 투여 시 FMDV 바이러스 시험감염에 대한 응급 백신으로서 실패하였다

합성 FMD 펩티드 상동체가 혼입된 특정 제제들을 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조하였다. 이러한 제제들은 2회 이상의 용량의 투여 후에 돼지 및 소/반추동물 FMDV 백신 양쪽 모두에서 FMDV 중화 면역 반응을 도출시킬 수 있었다. 그러나, 이러한 제제들은 OIE 바이러스 시험감염 절차에 의해 요구되는 바와 같은 제제의 단일 투여로 FMDV 바이러스 시험감염으로부터 돼지 및 소를 일관적으로 보호할 수 없었다. 이러한 제제가 단일 투여를 사용하여 FMDV 시험감염으로부터 완전한 보호를 동물에게 제공할 수 없는 것은 VP1 펩티드 상동체-기반 FMDV 백신 제제의 상업화에 심각한 장애를 일으킨다.

모든 VP1 상동체-기반 백신 제제를 위한 중화 항체 개발을 위한 동역학의 면밀한 검토에서, 단일 투여 후의 4주까지 중화 항체 역가가 낮게 또는 배경 역가 (<=3)에 가깝게 유지되었음을 밝혀졌다 (도 3a 및 3b). 돼지 및 소 양쪽 모두에서의 중화 항체 역가가 최초 투여 4주 후의 2차 투여 후에만 제6주에 유의하게 높은 수준으로 상승되었다 (도 3a 및 3b; 및 표 15-17). 고역가 중화 항체 생성에서의 이같은 지연은 VP1-기반 펩티드 백신 내의 특정 면역 반응 요소의 결여 (또는 이의 수준 감소)를 시사한다. 이러한 결여/감소된 요소가 응급 백신으로서 보호를 개시시킬 수 있는 FMDV 바이러스 용해물-기반 백신에 존재하는 것으로 보인다.

바이러스 노출 시 바이러스 복제의 유의한 감소를 야기하는 초기의 신속한 회상 반응이 단일 투여 시 완전한 방어 면역 반응에서 요구되는 VP1 상동체-기반 백신 제제에서 결여된 요소일 수 있다. 도 3a 및 3b; 및 표 15 내지 17에 나타난 중화 항체 역가에서의 유의한 상승에 의해 증명되는 바와 같이, 외래 UBITh® 에피토프가 VP1 펩티드 상동체에 연결된 경우 2회 이상의 용량 후에 강력한 T 헬퍼 반응이 생성된다. 그러나, 바이러스 감염 시 빠른 회상 반응을 제공하는 것에서 효과적이기 위해 응급 백신은 백신 제제의 단일 투여로 신속하게, 그리고 충분하게 동물의 면역계를 프라이밍시켜야 한다.

하기의 실시예들은 다성분 FMDV 유래 B 및 T 에피토프를 함유하는 백신 제제를 사용함으로써 즉효성 T 세포 반응을 평가하는 실험을 기술한다.

실시예 9

단일 투여 응급 백신을 위한 다성분 B 및 T 에피토프 기반 FMDV 백신 제제의 원리, 스크리닝, 확인 및 최적화

실시예 8에서 기술된 바와 같이, FMDV VP1 유래 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드들의 조합을 단독으로 사용하는 응급 FMD 백신 제제 개발에서의 반복된 시도는 단일 투여로의 최초 면역화 후 3 내지 4주에 고역가 중화 항체를 일관적으로 생성시킬 수 없었다. 따라서, 이러한 제제들은 FMDV 시험감염 시 동물을 보호할 수 없었다. 성공적인 고효능 응급 FMD 백신의 개발을 위한 필요한 면역학적 요소를 확인하기 위해 광범위한 시도가 확장되었다.

상업적인 FMD 바이러스 용해물-기반 응급 백신은 나이브 돼지 γδ T 세포 증식을 유도하고, 이러한 나이브 돼지 γδ T 세포는 FMD 백신 바이러스 항원에 노출된 후 다양한 사이토카인/케모카인 mRNA를 발현한다. 고효능 응급 FMD 백신이 제공된 동물에서 관찰된 현저한 변화 중 하나는 IFN-γ을 포함하는 사이토카인의 높은 수준의 전신 생산이다 (Cox 2003). FMD 면역 돼지 (백신접종 및 바이러스 시험감염 동물)로부터의 PBL을 FMD 바이러스 시험감염 및 회복 직후에 시험관 내에서 FMDV 항원으로 자극했을 때, γδ T 세포가 발견된 주요 증식 아집단이었고, 이는 이같은 γδ T 세포 증식이 특정 바이러스 감염의 특징일 수 있음을 가리킨다. 세포들의 클러스터가 명확한 시냅스 형성을 나타내는 바와 같이 γδ T 세포와 MHC 클래스 II+ CD4+ T 세포 간의 직접적인 세포 대 세포 상호작용이 관찰되었고, 이같은 상호작용은 T 세포 증식이 MHC 클래스 II 및 CD4에 대한 모노클로날 항체에 의해 차단될 수 있다는 것을 나타냈으며, 이는 MHC 클래스 II를 통한 γδ T 세포의 항원 제시 능력을 가리킨다 (Takamatsu 2002). 염증 유도 및 차별적인 사이토카인 생산에서 γδ T 세포가 수반되는 것은 선천 및 후천 면역 반응 양쪽 모두를 제어하는, 면역조절에서의 γδ T 세포의 중요한 역할을 드러낸다. 이러한 세포는 전문적인 항원 제시 세포 (APC)와 연관된 특색을 보유할 수 있다. 바이러스 용해물-기반 고효능 응급 FMD 백신에서 FMDV 항원에 대한 빠른 면역 반응을 생성시키는 것에서 γδ T 세포가 수반되는 것의 중요성은 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드에 의해 매개되는 T 세포 활성화의 개시에 대한 지표물로서의 IFN-γ 생산의 시험관내 측정을 통해 본 발명가들의 합성 펩티드-기재 고효능 응급 FMD 백신 내에 FMDV 내인성 T 에피토프 클러스터 펩티드 중 하나 이상을 포함시키는 것을 위한 디자인, 스크리닝 및 선택을 광범위하게 평가하도록 본 발명가들을 자극하였다.

실시예 3에서 상세하게 기술된 바와 같은 특정 T 세포 기능 검정법을 사용하여, (a) FMDV 바이러스 용해물 백신 및 (b) FMDV 후보 Th 펩티드를 함유하는 펩티드 제제로 면역화된 숙주로부터 유래된 돼지 및 소 T 세포가 인식하는 FMDV 단백질 VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 3A, 3B 및 3D의 항원 절편으로부터 유래된 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드를 스크리닝 및 확인하였다.

a. 면역 T 세포 활성화의 개시에 대한 지표물로서의 IFN -γ 생산의 시험관내 측정에 의한 돼지 및 소 동물에서의 FMDV 내인성 Th 클러스터 펩티드의 확인

시험관내 자극 시, FMDV 내인성 Th 에피토프 펩티드가 혼입된 제제로 면역화된 동물로부터의 프라이밍된 T 세포가 IFN-γ를 방출하였고, FMDV 중화 항체의 생산을 일관적으로 강화시켰다. 이같은 검정법은 재현하기가 훨씬 더 쉽고, 따라서 효능 평가 및 궁극적인 FMDV 백신 제제에 포함시키기 위한 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터의 확인을 위한 강건한 스크리닝 검정법으로서 사용되었다.

T 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 디자인은 먼저 MHC 클래스 II 결합 모티프의 클러스터를 나타내는 서열의 펩티드를 FMDV O_타이완99 바이러스 용해물 백신으로 면역화된 후, 시험감염되고 회복된 돼지 및 소로부터 수득된 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 배양에서 IFN-γ를 유도하는 이의 능력에 대해 시험함으로써 수행되었다. 이러한 스크리닝으로부터, 낮은 IFN-γ 생산, 중간 IFN-γ 생산 및 높은 IFN-γ 생산을 유발할 수 있는 펩티드를 백신 제제 내의 혼입을 위한 추가적인 스크리닝 및 디자인을 위해 군으로 나눴다. 도 1은 실시예 1 및 3에서 기술된 방법에 의해 확인되었고 후속 백신 제제 용도에서 사용된 FMDV VP4, VP2, VP3, VP1, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D 단백질 상의 선택된 B 및 내인성 T 세포 에피토프의 분포/국소화를 나타낸다.

FMDV O_타이완99 균주로부터 유래된 T 세포 에피토프 클러스터 펩티드 각각에 대한 서열이 표 4에서 확인된다 (서열 34-63). FMDV Th 펩티드들을 표 5에 나타난 바와 같은 다른 FMDV 균주로부터의 상동성 FMDV T 헬퍼 에피토프 서열 (서열 64-78)과 정렬하였다. 이러한 다소 소수성인 펩티드 항원들의 용해도를 개선하기 위해, 3개의 리신 잔기 (KKK)가 개별적인 T 헬퍼 펩티드 면역원의 N-말단에 부가되었다. 일부 확인된 Th 펩티드 면역원 또는 모두를 동일한 중량비로 함유하는 이러한 T 세포 클러스터 펩티드들 (서열 34-87)의 풀이 돼지 및 소 양쪽 모두에서 FMDV B 세포 클러스터 펩티드 면역원의 면역원성을 추가로 강화하기 위한 백신 제제 내의 VP1 펩티드 상동체들의 혼합물에 대한 보충물로서 사용되었다. 단일 투여 시의 생체내 보호 효능에 대한 지표로서 중화 항체 역가가 제0주 및 제3주에 시험관 내에서 측정/평가되는 광범위한 실험에서 이러한 백신 제제가 사용되었다 (표 18, 19). 이러한 풀링된 FMDV Th 펩티드들은 세포 매개 면역을 위한 FMDV T 세포 펩티드 면역원으로서 또한 작용할 수 있다.

유전학적 배경이 다양한 동물에 대한 T 세포 에피토프 적용범위를 추가로 넓히기 위해, 각각의 9개의 T 에피토프-특이적 상동성 서열 (표 19, 군 7, 서열 79-87)을 기초로 하는 조합형 펩티드를 또한 디자인하였다. 유사하게, 3개의 리신 잔기 (KKK)를 각각의 조합형 T 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 N-말단에 부가하여, 추가적인 제제 용도를 위해 이들의 수 용해도를 개선시켰다. 이러한 T 에피토프 클러스터 조합형 펩티드 면역원들의 풀이 백신 제제에서 보충물로 또한 사용되어, FMDV VP1 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원의 면역원성 및 세포 매개 면역을 위한 FMDV T 세포 펩티드 면역원으로서의 이들 자신의 면역원성을 추가로 강화시켰다 (표 19).

광범위한 시험을 통해, 돼지에 대한 바람직한 FMDV 내인성 Th 클러스터 펩티드의 목록은 서열 61 내지 63이고; 소에 대해서는 서열 34 내지 60이다. 이러한 짧은 펩티드들은 Th 에피토프 클러스터 펩티드의 N-말단에 리신 잔기들 (예를 들어 KKK)을 부가하는 것에 의해 가용성이게 될 수 있다. 조합형 라이브러리 서열 디자인에 사용된 혈청형(들) (예를 들어 O, 아시아1, A, C 등)을 기초로 하는 각각의 Th 에피토프를 사용하여 조합형 펩티드 서열을 제조하고, 추가로 카세트 형태의 선택된 개별적인 FMDV Th 클러스터 펩티드를 (단일 서열로서 또는 조합형 서열로서) UBITh® 에피토프 (서열 24)에 콤보 FMDV Th 구축물로서 연결함으로써, 이러한 펩티드들의 면역원성이 강화될 수 있다. 이러한 특색들을 함유하는 예시적인 서열들이 표 7에서 서열 88 내지 95로서 제시된다.

소의 특히 다양한 유전학적 배경으로 인해, 최적화된 FMDV B 에피토프 클러스터 VP1 펩티드를 이미 함유하는 백신 제제가 제공된 동물에서 항원 특이적 T 세포 반응의 개시를 유발할 수 있는 펩티드들의 대형 풀로부터 유래된 미리 선택된 FMDV 내인성 Th 펩티드들의 다양한 조합을 동물에서의 만능 면역원성에 대해 시험하였다 (표 19). 이같은 백신 제제의 단일 투여만이 제공된 동물에 의한 항원 특이적 T 세포 반응의 개시를 유발하는 능력이 돼지 및 소 양쪽 모두에서 백신이 개시시킬 수 있는 중화 항체의 유의한 역가에 의해 예시된다 (표 18 및 19). 이러한 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드의 부재 하에, VP1 펩티드 면역원 상동체만 함유하는 제제 각각에 대해 최초 면역화 후 제0주 및 제3주에 대해 백신의 단일 투여가 제공된 후에 백신은 무시할 수 있는 (즉 <=3) 역가의 중화 항체만을 개시시킬 수 있었다 (도 3a 및 3b).

(1) 혈청형 O로부터의 FMDV VP1 B 면역원 (서열 25); (2) 10% (중량 기준)의 디자인된 FMDV Th 에피토프 펩티드 구축물 (서열 90); 및 (3) UBITh® (서열 24)로 연결된 카세트 형태의 3개의 돼지 FMDV Th 에피토프를 함유하는 간단한 FMDV 백신 제제를 제조하였다. 이러한 제제를 단일 투여로 돼지에게 제공하였고, IFN-γ 수준을 4주 기간에 걸쳐 PBMC로부터 시험관 내에서, 그리고 혈청의 정량적 ELISA 검정법 (실시예 3에 기술된 바와 같음)에 의해 생체 내에서 측정하였다. 도 4a 및 4b에서 나타난 바와 같이, 면역화 후 경시적으로 IFN γ의 증가되는 생산 수준이 이러한 연구에서 관찰되었다.

이러한 발견은 선택된 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드가 면역화 직후에 면역화된 숙주의 T 세포를 프라이밍할 수 있다는 것을 추가로 확증한다. 천연 감염에 의한 또는 시험감염 연구를 통한 FMDV 노출 시, 노출된 바이러스 항원이 이전에 FMDV 백신 T 헬퍼 펩티드 항원에 의해 프라이밍된 메모리 T 세포를 통해 항원 특이적 T 세포 반응의 개시를 일으킨다. FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B 및 3D 단백질 상에 존재하는 이러한 주의깊게 선택된 면역우세 Th 에피토프들은 FMDV 관련 Th 세포의 사전 프라이밍을 제공하고, 각각의 백신 제제의 단일 투여 후에도, FMDV 노출 시 면역화된 숙주에서 유의한 림프구 증식성 반응을 유발하는 것을 허용하여 IFN-γ를 포함하는 사이토카인의 생산에 이른다. 이러한 사이토카인은 동물에서의 다양한 세포병변 바이러스 감염에 대한 세포-매개 면역 반응에서 주요한 역할을 하는 것으로 공지되었다.

b. 중화 검정법에 의해 결정된 바와 같은 돼지 및 소 양쪽 모두에서 응급 백신으로서 사용하기 위한 가장 최적인 백신 제제의 확인

백신접종 및 시험감염 동물에서의 FMDV에 대한 림프증식성 반응은 일반적으로 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드가 혼입된 제제에 대해 이러한 펩티드가 없는 것보다 유의하게 더 높은 것으로 발견되었다. 펩티드 제제 내에 특이적 T-세포 에피토프가 포함되는 것은 추후에 바이러스와 마주치는 환경에서 제시되는 바이러스 에피토프를 더욱 효율적으로 인식할 수 있는 T 세포의 프라이밍을 허용한다.

IFN-γ는 대식세포의 주요 활성화제이고, 이의 항균 활성 및 항원을 프로세싱하여 T 림프구에 제시하는 능력을 강화한다. IFN-γ가 항원 제시 세포에서의 MHC 발현을 자극하고 FMDV 복제를 효율적으로 억제한다고 보고되었다. 따라서, 이러한 초기 메커니즘의 활성화가 단일 투여 시 응급 백신에 요구되는 FMDV에 대한 방어 면역 반응의 유도와 관련된다. FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드의 존재 하에, FMDV VP1 반응성 B 세포가 활성화되어, 신속한 B 세포 증식 및 항체 생산에 이를 것이다. 이러한 FMDV 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드는 또한 T 헬퍼 세포를 활성화시켜, B 세포 메모리 생성에 대한 적절한 환경을 초래하는 사이토카인 분비에 이를 것이다. 이러한 발견들은 VP1 B 펩티드 단독과 비교하여 조합된 FMDV VP1 B 및 내인성 Th 펩티드에 의해 부여되는 더 양호한 임상 보호가 대부분 더욱 효율적인 림프증식성 반응 및 IFNγ 방출의 유도에 기인하고, 이는 또한 초기 이벤트의 일부로서 중화 항체의 더 양호한 유도, 따라서 더 높은 역가에 이른다는 것을 시사한다.

표준 중화 검정법이 응급 백신에 의해 요구되는 생체 내에서의 이같은 초기 방어 면역 반응을 최상으로 유발할 백신 제제의 스크리닝에 사용되었다. 초기 면역화로부터 3주에 수집된 혈청을 백신접종 돼지 (표 18) 및 소 (표 19)에서 평가하였다. 중화 항체 검정법이 응급 FMDV 백신으로서의 방출 기준의 일부로서의 특정 국가 기관에 의한 비싸고 성가신 신체 시험감염 시험을 대체하도록 대용 검정법으로서 사용되었기 때문에, 다양한 조합 및 비의 FMDV VP1 유래 B 및 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드를 이용하는 다수의 FMDV 백신 제제로의 체계적인 연구가 수행되었고, 실시예 2에서 간략하게 기술된 이러한 대용 중화 항체 검정법에 의해 이들 각각의 보호 효능에 대해 평가되었다.

구체적으로, 각각 8-12주령 및 6-12개월령의 돼지 및 소에 대한 군 당 3 내지 5마리의 FMDV가 없는 동물을 단일 투여 후에 다성분 B 및 T 에피토프 펩티드 기반 FMDV 백신 제제의 다양한 조합으로 제0주에 면역화시켰고, 이때 중화 항체 역가 시험을 위해 혈청을 수집하였다.

1. 돼지

돼지 연구로부터의 13개의 동물 군으로부터의 데이터가 표 18에서 제시된다. 하기 기술된 바와 같이 이러한 실험에서 사용된 제제들이 제조되었다. 모든 돼지가 백신 제제로서의 1 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 1 - 원형 FMDV VP1 O 컨센서스 펩티드 (서열 25)만 함유하였다.

군 2 내지 4 - 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 25+2.5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 내인성 FMDV Th 펩티드들 (예를 들어, 서열 34-63, 서열 61-63, 또는 서열 90)의 혼합물과 10:1의 B:Th 중량비로 조합된 원형 FMDV VP1 O 컨센서스 펩티드 (서열 25)로 제조되었다.

군 5 내지 7 - 총 25 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25) 및 O_오즈크 (서열 28)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 25+2.5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 내인성 FMDV Th 펩티드들 (예를 들어, 서열 34-63, 서열 61-63, 또는 서열 90)의 혼합물이 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다.

군 8 내지 10은 총 25 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25) 및 O_오즈크 (서열 28) 및 O_미얀마 (서열 27)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 25+2.5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 34-63, 서열 61-63, 및 서열 90의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다

군 11 내지 13은 총 25 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25) 및 O_오즈크 (서열 28) O_미얀마 (서열 27) 및 아시아 1_지앙수 (서열 29)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 25+2.5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 내인성 FMDV Th 펩티드들 (예를 들어, 서열 34-63, 서열 61-63, 및 서열 90)의 혼합물이 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다.

요약하면, 모든 돼지가 다양한 시점에 각각의 연구가 시작되었을 때 제0주에 FMDV 항체가 없었다. 다양한 FMDV VP1 유래 B 및 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드를 함유한 다성분 FMDV 백신 제제의 단일 투여가 ELSIA에 의한 표적화된 펩티드 O_컨센서스 (서열 25) (또는 이 중 하나)에 대해 지시된 유의한 항체의 생성을 도출시켰고, 이때 Log₁₀ 역가는 2 내지 3 (즉, 10E2 내지 10E3)이었다.

2. 소

소 연구로부터의 군 당 동물 3마리의 32개의 동물 군으로부터의 데이터가 표 19에서 제시된다. 하기 기술된 바와 같이 이러한 실험에서 사용된 제제들이 제조되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 1 내지 8은 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 34-63 (30개의 Th); 서열 34-39, 44, 46-51, 53-63 (24개의 Th); 서열 34-39, 44, 46-51, 53-60 (21개의 Th); 서열 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15개의 Th); 서열 34, 36, 37, 48, 50, 53 (6개의 Th); 서열 62-78 (17개의 Th 상동체); 서열 79-87 (9개의 짧은 Th 라이브러리); 및 서열 88, 89 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트)를 각각 포함하는 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물과 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 각각 조합된 원형 FMDV VP1 O_컨센서스 펩티드 (서열 25)로부터 제조되었다.

군 9 내지 11은 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25), O_오즈크 (서열 28) 및 O_미얀마 (서열 27)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 88, 89 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트), 및 서열 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15개의 Th)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 12 내지 16은 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25), O_오즈크 (서열 28) 및 O_미얀마 (서열 27)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼으로 동일한 중량비의 서열 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15개의 Th)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 1:1, 5:1, 10:1, 50:1 및 100:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 17 내지 19는 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25), O_오즈크 (서열 28), O_미얀마 (서열 27) 및 아시아 1_{지 앙수} (서열 29)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63 (15 개의 Th); 서열 88, 89 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 25 및 26은 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_캄포스 (서열 26), A₂₄ (서열 30), 및 C_인다이알 (서열 32)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 27 및 28은 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_캄포스 (서열 26), A₂₄ (서열 30), 및 C_인다이알 (서열 32)로 면역화되었고, 이들 각각에 아주반트로서의 에멀시젠 D (12%)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 29 및 30은 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_캄포스 (서열 26), A_{아르헨티나2001} (서열 33), 및 C_인다이알 (서열 32)로 면역화되었고, 이들 각각에 0.1% 트윈 80을 함유하는 아주반트로서의 ISA50V2 (셉픽스, 프랑스)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

군 31 및 32는 총 50 ㎍/㎖의 동일한 중량비의 FMDV 백신 B 세포 성분으로서의 FMDV VP1 O_캄포스 (서열 26), A_{아르헨티나2001} (서열 33), 및 C_인다이알 (서열 32)로 면역화되었고, 이들 각각에 아주반트로서의 에멀시젠 D (12%)를 사용하는 유중수 에멀젼 내의 50+5 ㎍/㎖로 동일한 중량비의 서열 91, 92 (2개의 UBITh® 강화 Th 카세트); 서열 91, 93-95 (4개의 UBITh® 강화 Th 카세트)의 내인성 FMDV Th 펩티드들의 혼합물이 모두 동일한 중량비로, 그리고 10:1의 B:Th 중량비로 보충되었다. 모든 소가 백신 제제로서의 2 ㎖의 에멀젼으로 면역화되었다.

요약하면, 모든 소 동물이 다양한 시점에 각각의 연구가 시작되었을 때 제0주에 FMDV 항체가 없었다. 다양한 FMDV VP1 유래 B 및 내인성 Th 에피토프 클러스터 펩티드를 함유한 다성분 FMDV 백신 제제의 단일 투여가 표적화된 펩티드 O_컨센서스 (서열 25) (또는 이 중 하나)에 대해 지시된 유의한 항체의 생성을 허용하였고, 심지어 상이한 혈청형의 다른 관련된 VP1 B 면역원의 존재로 인해 표적 펩티드 면역원이 B 성분의 분획인 경우에도 그러하였으며 (대부분 이러한 VP1 펩티드 면역원들 간의 높은 교차 반응성에 기인함), 일반적으로 역가는 2 내지 3의 Log₁₀ 역가 범위였다.

예상 밖으로, B:Th 펩티드의 비가 광범위한 제제가 시험된 동물에서 면역 반응을 도출시키는데 효과적이었다. 즉, 이같은 FMDV 내인성 Th 클러스터 펩티드의 포함에 대한 % 범위가 낮게는 1% (즉 1:100의 Th 대 B 비)에서 높게는 50% (즉 1:1의 Th 대 B 비)까지 변할 수 있었고 (소 면역화 연구의 군 12 내지 16 참조), 동물에서 최초 면역화 후 3주에 수집된 혈청 내의 중화 항체의 유의한 상승을 도출하는데 효과적인 제제가었다.

일반적으로, 10% 내지 20%의 FMDV Th 클러스터 펩티드 대 FMDV VP1 B 에피토프 클러스터 펩티드 (즉 1:5 또는 1:10 비)가 선택되었고, FMDV 백신 제제의 근육내 주사 경로를 통한 단일 투여가 제공된 동물에서 균형잡힌 B 및 T 면역 반응을 개시시키도록 최종 펩티드 기반 FMDV 백신 제제에서 사용되었다.

실시예 10

단일 투여 응급 백신으로서 다성분 B 및 T 에피토프 기반 FMDV 백신 제제가 제공된 후의 FMDV 바이러스 시험감염으로 부터의 돼지 및 소 동물의 보호

a. 돼지에서 수행된 시험감염 연구:

최초 면역화 후 3주에 수집된 혈청에서 유의한 중화 항체 역가를 생성시키는 단일 투여 응급 백신용으로 디자인된 최적화된 다성분 B 및 T 에피토프 기반 FMDV 백신 제제로, 실시예 9에서 이전에 시험된 선택된 대표적인 제제에 대한 보호 효능을 평가 및 입증하기 위해 6개의 추가적인 시험감염 연구가 타이완 탐수이에서 수행되었다.

특히, FMDV O_타이완 균주를 사용하는 FMDV 시험감염 연구를 백신 접종 동물에서 수행하였다. 유사한 프로토콜/방법에 따라 시험감염 연구들이 수행되었다. 한 대표적/예시적인 시험감염 연구가 본 실시예 (하기)에서 상세하게 기술된다. 구체적으로, 표 20에 제시된 바와 같은 시험감염 연구 (표 25에서 제시된 바와 같은 연구 II의 군 5, 6, 및 7; 연구 IV의 군 12, 13, 및 14; 및 연구 V의 군 15, 16, 17, 18, 및 19에 상응함)가 표 20 내지 24에서 상세하게 기술/평가된다. 돼지 및 소에서 수행된 이같은 시험감염 연구에서 수반된 다른 군들이 각각 표 25 및 26에서 요약 형태로 제시되었다.

동물: 32마리의 (0 wpi에) 8주령인 SPF 잡종 돼지를 시험감염 연구에서 사용하였다. 돼지는 FMD가 없었고, 이전에 FMD 백신으로 면역화되지 않았다 (즉, 나이브했다). 돼지를 행정원 농업 위원회 동물 건강 연구소 (Animal Health Research Institute (AHRI), Council of Agriculture, Executive Yuan)에 거주시켰다. 초기 면역화부터 시험감염 연구를 완료할 때까지 AHRI에서 연구가 수행되었다.

특수 사육 조건: 실제 상황에 따라 상이한 군들을 공동 우리에 거주시켰다. 대조군은 독방에 거주시켰다. 감염 징후를 나타내는 동물들을 별도의 방으로 이동시켰다.

바이러스: FMDV O_{TAW / 97 K} 균주.

키트: FMDV 비구조 단백질 ELISA 키트 및 FMD 펩티드 2570a EIA 적정 키트를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 사용하였다.

군 분류: 32마리의 돼지를 무작위로 11개의 군으로 나눴다. 동물 ID 번호, 용량 부피, 주사 경로 및 주사 부위가 표 20에서 요약되었다.

채혈 일정: 0, 2, 4주(들)의 백신 접종 후 주수 (WPV) 및 14일의 시험감염 후 일수 (DPC).

백신 접종: 백신 접종이 각각의 지정 용량으로 0 WPV에 제공되었다.

시험감염 일정: 면역화 4주 후에, 백신 접종 돼지 및 대조군 돼지에 SC 경로를 통해 오른쪽 앞다리의 제구 내로 FMDV O-타이완 (돼지-계대 바이러스)를 시험감염하였다. 바이러스의 양은 0.5 ㎖ (10⁵ TCID₅₀)였다.

모니터링 검정법(들): 바이러스 시험감염 후, 체온을 매일 기록하면서 돼지에서의 FMD의 임상 징후 및 증후군의 발달을 14일 동안 모니터링하였다.

바이러스 시험감염 후의 돼지의 체온이 표 21에서 기록되었다. 모니터링된 시험감염 후의 14일 (DPC) 동안, 돼지의 체온이 약간 상승하였지만, 대부분 40℃ 미만이었다.

중화 역가: 백신 접종 후 0, 2 및 4주 (WPV), 및 14일 (DPC)에 돼지에서 혈액을 채취하였다. 각각의 동물로부터의 혈청을 원심분리에 의해 응고 샘플로부터 수집하였고, 바이러스 중화 검정법에 적용하였다. 중화 역가 및 기하 평균이 계산되었고, 표 22에서 제시되었다. 유의한 중화 항체 (NA) 역가가 모든 제제에 대해 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. NA 역가의 기하 평균이 특정 군의 경우 4 WPV에 16 미만이었지만, 14 DPC에 모든 실험 군에서는 모든 동물이 보호된 반면 (100%), 위약 대조군 또는 음성 대조군에서는 2마리의 동물 중 2마리가 양쪽 모두 감염되었고, 이때 빠르게는 제2일에 임상 징후가 검출되었다. 연구 V의 군 19는 FMDV 바이러스 용해물 기반 혈청형 O 백신 (러시아)를 양성 대조군으로서 사용하였고, 이때 3마리 동물 모두가 단일 투여 시 보호되었다.

FMDV NS ELISA: FMDV 비구조 단백질 ELISA로 AHRI에서 혈청 샘플을 검정하였고, 결과가 표 23에서 제시된다. 시험감염 전에는, 시험된 전체 군이 나이브하여, FMDV NS 단백질에 대한 반응성을 나타내지 않았다. 위약 음성 대조군의 동물만이 14 DPC에 NS 단백질에 대한 양성 반응성을 나타냈고, 이는 이들의 감염성 성질을 가리킨다.

항-VP1 (펩티드 2570a) ELISA 적정: 항-VP1 항체 역가의 결과를 실시예 1에 기술된 바와 같은 VP1 펩티드 2570a 기반 ELISA로 시험하였고, 결과가 표 24에서 제시된다. 면역화 2주 후에도 대부분의 돼지에서 유의한 면역 반응이 발달되었다.

FMDV 펩티드 백신 제제가 이들 각각의 제제에서 나타난 바와 같이 내인성 FMDV Th 펩티드를 포함했을 때, 음성 위약 대조군으로부터의 1마리를 제외한 실험 군으로부터의 모든 동물이 이들의 NA 역가와 관계 없이 FMDV 시험감염으로부터 보호되었다.

실험 군에서의 4 WPV의 중화 항체 역가의 기하 평균 중 일부가 16 미만이었지만, 돼지가 모두 보호되었다. 이는 중화 항체에 더하여, 바이러스 시험감염 시 동물 보호에서 수반되는 다른 요인이 있다는 것을 명확하게 가리킨다. 짧은 카세트 또는 긴 카세트 양식의 내인성 FMDV Th 펩티드의 포함은 모두 펩티드 백신 제제의 단일 투여 시 세포 면역을 도출하는 것에서의 이들의 결정적인 역할을 실연하였다. VP1 루프화 펩티드(들)와 조합되었을 때 이같은 보호를 제공하는 돼지에서의 이같은 세포 면역을 제시하는 많게는 30개의 FMDV Th (서열 34-63) 또는 적게는 3개의 앞서 정련 및 선택된 Th (서열 61-63)가 있을 수 있다. FMDV VP1 O 상동체로부터의 서열들이 혼입된 조합 백신이 O_타이완 균주에 의한 FMDV 시험감염으로부터 더 많지는 않더라도 동등하게 효과적인 돼지 보호를 제공하였다. 모니터링 기간 전반에 걸쳐 각각의 백신 제제가 제공된 실험 군에서 FMDV NS 단백질에 대한 항체가 검출되지 않았고, 이는 고용량 FMDV 바이러스 시험감염 (10× OIE 요구 바이러스 투여량)에 직면해서도 FMDV 감염으로부터 이러한 동물들을 철저하게 보호하는 것을 추가로 나타낸다. 시험된 모든 제제에서, 용량 당 0.5 ㎖만 제공된 돼지도 용량 당 2 ㎖가 제공된 돼지에 비교했을 때 동등하게 보호되었다.

13개의 군 (군 1-3, 5-7, 8-10, 12-15)이 FMDV VP1 유래 B 에피토프 면역원으로서 FMDV O_컨센서스 (서열 25)를 사용하였다. 군 16은 FMDV O_컨센서스, O_오즈크, O_미얀마 (서열 25, 28, 및 27)를, 군 17은 FMDV O_컨센서스, O_오즈크, O_미얀마 및 아시아 1_지앙수 (서열 25, 28, 27, 및 29)를 각각 FMDV VP1 유래 B 에피토프 면역원으로서 사용하였다 (동일한 중량비). 나머지 군들은 위약 대조군을 사용하였다.

위약 대조군을 제외한 모든 이러한 제제에서, 내인성 FMDV Th 에피토프 클러스터 펩티드가 표 25에서 나타난 바와 같이 상세하게 지시된 바와 같이 모든 군에서 FMDV VP1 B 에피토프 성분에 첨가되었다. 연구 II 및 IV는 각각의 백신 제제의 효능 (PD₅₀)을 시험하기 위해 각각의 연구 내의 군에 용량 당 2 ㎖, 1 ㎖, 0.5 ㎖가 투여되면서 수행되었다. 모든 실험 동물을 14일 관찰 기간에 걸쳐 FMD의 임상 징후에 대해 모니터링하였다. 1:1, 5:1 및 10:1의 다양한 비의 FMDV VP1 O_컨센서스 (서열 25) 및 UBITh® 강화 FMDV Th 카세트 펩티드 (서열 90)가 연구 III에서 군 8 내지 10에 대해 또한 시험되었다. 다양한 비의 유사한 연구가 군 15 및 16에 대해 각각 5:1 및 10:1로 FMDV VP1 콤보 펩티드 면역원 및 UBITh® 강화 FMDV Th 카세트 펩티드 (서열 90)로 연구 V에 대해 또한 수행되었다.

요약하면, 모든 위약 대조군 또는 음성 군 (주사하지 않음) 내의 모든 동물이 시험감염 시 빠르게는 제2일에 FMDV O_타이완 균주로 감염되어, 모든 시험감염 시험의 유효성을 가리켰다. 이러한 시험감염 연구에서 OIE가 요구하는 양보다 10× 더 높은 용량의 FMDV 바이러스 단리물의 적용에도 불구하고, 모니터링 기간 전반에 걸친 음성 임상 징후 및 FMDV NS ELISA에 의한 음성 신호로 실연되는 바와 같이, 모든 실험 군 내의 모든 돼지의 완전한 보호가 관찰되었다. 투약 연구 동안의 PD₅₀의 계산은 군 II 및 IV 양쪽 모두에서 적어도 >11.23의 PD₅₀을 가리켰다.

30개의 FMDV Th 에피토프 펩티드 (서열 34-63) 중에서, 3개의 FMDV Th 펩티드가 FMDV 바이러스 시험감염으로부터의 돼지의 효과적인 보호를 위해 선택되었다 (서열 61-63). 서열 90에 나타난 바와 같이 N-말단에서 UBITh® (서열 24)에 추가로 연결되는 리신 스페이서를 통해 이러한 3개의 펩티드를 연결시킴으로써 카세트-유사 디자인을 사용하는 것에 의해 이러한 3개의 FMDV 돼지 Th 에피토프 펩티드의 제시가 강화되었다. 이같은 FMDV Th 에피토프 펩티드는 FMDV 바이러스 시험감염에 대한 보호를 제공하기 위해 B 펩티드 면역원에 대한 다양한 비로 FMDV VP1 유래 B 에피토프 펩티드 면역원에 보충될 수 있다. 시험감염 시험의 연구 V에서, B 에피토프 펩티드 조성물이 1가 O 혈청형 펩티드 (서열 25, 2570kb)로서, 또는 O 혈청형 콤보 제제 (서열 25, 28, 및 27)으로서, 또는 다가 혈청형 O 및 아시아 1 조합 제제 (서열 25, 28, 27 및 29)으로서 제시되었을 때 10% 내인성 Th 에피토프 펩티드의 존재 하에 완전한 보호가 달성되었고, 이는 VP1 B 에피토프 펩티드의 면역원성에서의 적응성을 가리킨다.

b. 소에서 수행된 시험감염 연구:

소에서, 1×10⁴ TCID₅₀의 FMDV (소 감염 단위(Bovine Infectious Unit) 또는 BIU)의 동물의 목 뒤에서의 변형된 근육내 주사에 의해 바이러스 시험감염이 도입되었다. OS/99 균주가 혈청형 O 시험감염에 사용되었고, 아시아 1 고-병독성 균주가 혈청형 아시아 1 시험감염에 사용되었다. 각각의 FMDV 백신 제제의 단일 투여가 제공되고 나서 28일 후 바이러스를 시험감염시켰을 때 동물을 매일 검사하였고, 직장 온도를 모니터링하였으며, 병변의 출현 시간 및 개수 및 중증도를 기초로 하는 보호 점수를 결정하였다. 살아 있는 동물을 이용하는 모든 실험을 PRC 농업부의 가이드라인 하에 수행하였다. 투약에 대한 변형 예컨대 2×, 1×, 및 0.5× 용량의 시험 백신을 사용하는 것이 특정 제제의 효능을 평가하는데 또한 사용되었다. 보호 효능이 있는 제제의 신속한 스크리닝을 위해, 1×가 사용되었다. 백신 제제 효능의 평가를 위해, 실험 디자인 및 연구 시점의 동물의 이용가능성에 따라 동물을 군 당 3 내지 5마리의 동물로 나눴다.

연구 I에서, 내인성 FMDV Th 에피토프 펩티드의 부재 하에 또는 DT, TT, 및 PT 톡소이드(toxoid) 단백질로부터 유래된 10% 외인성 Th 에피토프 펩티드의 존재 하에 최적화된 FMDV VP1 유래 B 세포 에피토프 클러스터 펩티드 면역원 (서열 25)을 백신 제제의 주요 성분으로 함유하는 펩티드 백신 제제의 군 1 내지 4 (표 26에 제시된 바와 같음)의 동물은 FMDV 혈청형 O_{OS /99} 균주 시험감염으로부터 동물을 보호할 수 없었다. 단일 투여 응급 백신용의 최적화된 다성분 B 및 T 에피토프 기반 FMDV 백신 제제로, 표 26에서 제시된 바와 같이 이전에 실시예 9에서 시험된 선택된 대표적인 제제에 대한 보호 효능을 평가하기 위해 4개의 추가적인 시험감염 연구가 수행되었다.

8개의 군 (연구 II 및 III의 군 6-8 및 10-14)이 FMDV VP1 유래 B 에피토프 면역원으로서 FMDV O_컨센서스 (서열 25)를 사용하였다. 연구 IV (군 16)는 FMDV VP1 유래 B 에피토프 면역원으로서 FMDV O_컨센서스, O_오즈크, O_미얀마 (서열 25, 28, 및 27)를 사용하였다 (동일한 중량비). 연구 V (군 18)는 FMDV VP1 유래 B 에피토프 면역원으로서 FMDV O_컨센서스, O_오즈크, O_미얀마, 아시아1_지앙수, 및 A_간수 (서열 25, 28, 27, 29, 및 31)를 사용하였다 (동일한 중량비).

위약 대조군 및 연구 I에서의 실험 군을 제외한 모든 이러한 제제에서, 연구 III의 군 10에 대한 서열 34-63의 내인성 FMDV Th 에피토프 클러스터 펩티드 (30개의 Th); 연구 III의 군 11에 대한 서열 34-39, 44, 46-51, 및 53-60의 펩티드 (21개의 Th); 연구 II의 군 6 내지 8에 대한 서열 88 및 89의 UBITh® 강화 FMDV Th 카세트 펩티드의 혼합물, 및 연구 IV의 군 16 및 연구 V의 군 18에 대한 서열 91, 93, 94, 및 95의 또 다른 4개의 카세트 FMDV Th 펩티드의 혼합물이 표 26에 나타난 바와 같이 상세하게 지시된 바와 같이 FMDV VP1 B 에피토프 성분에 첨가되었다.

연구 II의 군 6, 7, 및 8에서는 용량 당 2 ㎖, 1 ㎖, 0.5 ㎖의 백신 제제가 각각의 군의 동물에게 투여되면서 백신 제제 효능이 시험되었고, 이때 각각의 군에서 5마리 중 4마리, 5마리 중 4마리 및 5마리 중 3마리의 동물이 보호되어 백신 제제의 유의한 효능을 가리켰다.

요약하면, 모든 위약 대조군 내의 모든 동물이 시험감염 시 빠르게는 제2일에 시험감염 연구에 사용된 FMDV O_{OS /99} 또는 아시아 1 균주로 감염되어, 모든 시험감염 시험의 유효성을 가리켰다. 모니터링 기간 전반에 걸친 보호된 동물에서의 음성 임상 징후에 의해 실연되는 바와 같이, 모든 실험 군에서 유의한 보호 (5마리 중 4마리, 또는 5마리 중 3마리) 또는 완전한 보호가 달성되었다. 본 발명가들은 소의 다양한 유전학적 배경에 걸친 효과적인 보호를 위해 30개의 FMDV Th 에피토프 펩티드 (서열 34-63) 중에서, 동일한 비 (중량 기준)의 21개 (서열 34-39, 44, 46-51, 53-60 (21개의 Th), 동일한 비 (중량 기준)의 15개의 Th (서열 34, 36, 37, 40-43, 45, 48, 52, 53, 60-63) (15개의 Th) 및 동일한 비 (중량 기준)의 6개의 FMDV Th 펩티드 (서열 34, 36, 37, 48, 50, 53) (6개의 Th)를 선택할 수 있었다. FMDV Th 카세트 펩티드 (서열 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95)와 같이 3개의 Th 펩티드를 리신 스페이서를 통해 연결시킨 후 이를 N-말단에서 UBITh® (서열 24)에 연결시킴으로써 카세트-유사 디자인을 제조하는 것에 의해 이러한 15개 및 추가로 낮게는 6개까지의 FMDV 소 Th 에피토프 펩티드의 제시가 강화되었다. 이같은 FMDV Th 에피토프 카세트 펩티드는 매우 필요한 FMDV T 세포 면역을 개시시키는 것을 돕기 위해 10 또는 20%로 FMDV VP1 유래 B 에피토프 펩티드 면역원에 보충될 수 있다. 연구 IV 및 V에서, B 에피토프 펩티드 조성물이 콤보 O 혈청형 제제 (서열 25, 28, 및 27)으로서, 또는 다가 혈청형 O, 아시아 1 및 A_간수 제제 (서열 25, 28, 27, 29, 및 31)으로서 제시되었을 때 4개의 UBITh® 강화 펩티드 (서열 91, 93, 94, 95) 상의 카세트 형태로 제시된 12개의 FMDV Th 에피토프로부터 선택된 10% 내인성 Th 에피토프 펩티드의 존재 하에 각각 FMDV 혈청형 O_{OS /99} 균주 (연구 IV) 또는 고-병독성 FMDV 아시아 1 균주 (연구 V)에 의한 군 16 및 18에 대해 5마리 중 4마리의 동물의 보호가 달성되었고, 이는 VP1 B 에피토프 펩티드의 면역원성에서의 적응성을 가리킨다.

실시예 11

소에서의 FMD 브라질 유형 O 바이러스/A ₂₄ / C _인다이알 바이러스 감염을 예방하기 위한 UBITh® FMDV 다가 백신 UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 (브라질)용 샘플 제품 삽입물

하기는 브라질 및 중국에서의 UBITh® FMDV 다가 백신 UBITh® 구제역 (FMD) 합성 펩티드 백신용 샘플 제품 삽입물이다.

a. 브라질

주사용 멸균 유중수 에멀젼

주의: 수의학 용도 전용

설명: UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 (브라질)은 3개의 UBITh® FMD VP1 합성 펩티드 구축물을 함유하는 유중수 에멀젼 3가 백신이다. 각각의 펩티드 구축물은 항원으로서의 UBITh® 에피토프 (인공 T 헬퍼 (Th) 세포 펩티드)에 합성에 의해 연결된 특정 남미 지역의 요구를 기초로 하는 혈청형 브라질 O, A₂₄ 및 C_{인다 이알} 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 면역우세 VP1 에피토프가 있는 합성 펩티드로 구성된다. 이러한 3개의 FMDV 혈청형에 대한 세포-매개 면역을 추가로 강화하기 위해 4개의 추가적인 Th 펩티드가 포함된다. 3개의 UBITh® FMD VP1 구축물은 동일한 비로 혼합되고, 소량의 4개의 Th 구축물의 혼합물이 보충된다. 그 후, FMDV B 및 T 에피토프 관련 합성 구축물 혼합물이 오일 아주반트와 혼합되어 유중수 에멀젼이 형성된다.

사용하기 위한 적응증: UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 (브라질)은 소의 구제역 바이러스 혈청형 브라질 O, A₂₄ 및 C인다이알 감염의 보호에 사용된다.

투여량 및 투여: UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 ( 브라질) 어깨 앞쪽의 목 부분 내로 근육내 주사를 통해 백신 제제가 투여된다. 바늘과 피부 표면 사이에 가능하면 가깝게 45도 각도를 유지하여, 바늘을 뺄 때 바늘 구멍에서 백신이 흘러나오는 것을 방지한다. 1회의 단일 용량이 응급 용도에 권장된다. 어떠한 사전 FMD 백신도 접종되지 않은 소의 경우, 면역을 증가시키고, 면역 반응을 연장시키며, 따라서 FMDV 감염에 대한 더 나은 보호를 제공하기 위해 4-5주 간격의 2 ㎖의 2회 면역화가 투여되어야 한다. 그 후 6개월마다 추가적인 면역화가 수행될 수 있다. FMDV 감염 동물이 있는 지역에서는, 6개월마다 백신을 다시 접종하는 것이 권장된다. 전달되는 투여량은 2.0 ㎖이다.

사용법

ㆍ 사용 전에, 백신 제품을 실온으로 가온한다.

ㆍ 사용하기 전에 백신 내용물을 철저하게 혼합한다.

ㆍ 멸균 주사기 및 바늘로 내용물을 제거한다.

ㆍ 병이 개봉된 후에는 모든 내용물을 즉각적으로 사용한다.

용기 및 모든 미사용 내용물을 정부 규정이 허용하는 절차에 의해 처분한다.

b. 중국

소에서의 FMD 차이나 유형 O / 아시아 1 / A _간수 바이러스 감염을 예방하기 위한 UBITh® 구제역 (FMD) 합성 펩티드 3가 백신 (중국)

주사용 멸균 유중수 에멀젼

주의: 수의학 용도 전용

설명: UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 (중국)은 3개의 UBITh® FMD VP1 합성 펩티드 구축물을 함유하는 유중수 에멀젼 3가 백신이다. 각각의 펩티드 구축물은 항원으로서의 UBITh® 에피토프 (인공 T 헬퍼 (Th) 세포 펩티드)에 합성에 의해 연결된 중국 및 아시아 지역의 요구를 기초로 하는 혈청형 차이나 유형 O, 아시아 1 및 A_간수 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 면역우세 VP1 에피토프가 있는 합성 펩티드로 구성된다. 이러한 3개의 FMDV 혈청형에 대한 세포-매개 면역을 추가로 강화하기 위해 4개의 추가적인 Th 펩티드가 포함된다. 3개의 UBITh® FMD VP1 구축물은 동일한 비로 혼합되고, 소량의 4개의 Th 구축물의 혼합물이 보충된다. 그 후, FMDV B 및 T 에피토프 관련 합성 구축물 혼합물이 오일 아주반트와 혼합되어 유중수 에멀젼이 형성된다.

사용하기 위한 적응증: UBITh ® 구제역 ( FMD ) 합성 펩티드 3가 백신 (중국)은 소의 구제역 혈청형 차이나 유형 O/아시아 1/A 간수 바이러스 감염의 보호에 사용된다.

투여량 및 투여: 어깨 앞쪽의 목 부분 내로 근육내 주사를 통해 UBITh ® 구제역 (FMD) 합성 펩티드 3가 백신 (중국)이 투여된다. 바늘과 피부 표면 사이에 가능하면 가깝게 45도 각도를 유지하여, 바늘을 뺄 때 바늘 구멍에서 백신이 흘러나오는 것을 방지한다. 1회의 단일 용량이 응급 용도에 권장된다. 어떠한 사전 FMD 백신도 접종되지 않은 소의 경우, 면역을 증가시키고, 면역 반응을 연장시키며, 따라서 FMDV 감염에 대한 더 나은 보호를 제공하기 위해 4-5주 간격의 2 ㎖의 2회 면역화가 투여되어야 한다. 그 후 6개월마다 추가적인 면역화가 수행될 수 있다. FMDV 감염 동물이 있는 지역에서는, 6개월마다 백신을 다시 접종하는 것이 권장된다. 전달되는 투여량은 2.0 ㎖이다.

사용법

ㆍ 사용 전에, 백신 제품을 실온으로 가온한다.

ㆍ 사용하기 전에 백신 내용물을 철저하게 혼합한다.

ㆍ 멸균 주사기 및 바늘로 내용물을 제거한다.

ㆍ 병이 개봉된 후에는 모든 내용물을 즉각적으로 사용한다.

ㆍ 용기 및 모든 미사용 내용물을 정부 규정이 허용하는 절차에 의해 처분한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7-1]

[표 7-2]

[표 7-3]

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

[표 12]

[표 13]

[표 14]

[표 15]

[표 16]

[표 17]

[표 18-1]

[표 18-2]

[표 18-3]

[표 19-1]

[표 19-2]

[표 19-3]

[표 19-4]

[표 19-5]

[표 19-6]

[표 19-7]

[표 19-8]

[표 20]

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24-1]

[표 24-2]

[표 25-1]

[표 25-2]

[표 25-3]

[표 25-4]

[표 25-5]

[표 26-1]

[표 26-2]

[표 26-3]

[표 26-4]

SEQUENCE LISTING <110> United Biomedical, Inc. Wang, Chang-Yi <120> Synthetic Peptide-Based Emergency Vaccine Against Foot And Mouth Disease (FMD) <130> 1004263.209WO <140> TBD <141> 2012-11-15 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UBI Foot-and-mouth disease virus (FMDV) O Consensus sequence VP1 134-158, cyclized. <400> 1 Cys Lys Tyr Gly Glu Asn Ala Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln 1 5 10 15 Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys 20 25 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot-and-mouth disease virus (FMDV) O Consensus VP1 129-168, (2570A), Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 2 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Asn Ala Val Thr Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 3 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) O Consensus VP1 129-168, (2570A), Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 3 Val Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Ser Arg Asn Ala Val Pro Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV Taiwan 2956a VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 4 Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O O1K/O1BFS, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 5 Val Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV China (Gd/86) VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 6 Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O Swine/Cattle/O/MYA/7/02 VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 7 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O/Ozk/93, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 8 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Asp Arg Ala Val Ser Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) O/A/58, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O/A/58, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 9 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Val Gly Pro Val Thr Lys Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O/OZK/93, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 10 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Asp Arg Pro Val Thr Lys Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(41) <223> UBI FMDV O Lanzhou, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 11 Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Cys Leu Pro 20 25 30 Ser Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) Asia 1 Consensus, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 12 Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Gln Pro Ser Arg Arg Gly 1 5 10 15 Asp Met Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Arg Cys Leu Pro Thr Ser 20 25 30 Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(39) <223> UBI FMDV Asia 1 Yunnan PRC, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 13 Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Glu Ser Thr Arg Arg Gly 1 5 10 15 Asp Phe Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Arg Cys Leu Pro Thr Ser 20 25 30 Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(39) <223> UBI FMDV Asia 1 KZC-2/10 PRC, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 14 Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala Arg Arg Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Gly Cys Leu Pro Thr Ser 20 25 30 Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(39) <223> UBI FMDV Asia 1 JiangSu/China/2005, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 15 Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly 1 5 10 15 Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Val Asn Asn Cys Leu Pro Thr Ser 20 25 30 Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 35 <210> 16 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) A consensus, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A consensus, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 16 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Lys Tyr Thr Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 17 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A24 Cruzeiro California, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 17 Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Met Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A Gansu/China/60Y, VP1. Peptide with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 18 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Gln Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Arg Val Ala Ala Gln Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg 35 40 <210> 19 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A XinJiang/China/58Y, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 19 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Thr Tyr Ser Thr Gly Ser Ala Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Asn Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg 35 40 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A22 A Mahmatli/Tur/65Y, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 20 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Thr Gly Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln 35 40 <210> 21 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> UBI FMDV A Argentina 2001Y, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 21 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Lys Tyr Thr Val Ser Gly Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 22 <211> 38 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(38) <223> UBI FMDV C3 Indaial/Brazil/84Y, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 22 Thr Tyr Thr Gly Thr Cys Ala Tyr Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Ala His Leu Ala Ala Ala His Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Phe Gly Ala Val Lys 35 <210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(38) <223> UBI FMDV C3 Argentina/83c, VP1. Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 23 Thr Tyr Thr Gly Thr Cys Thr Tyr Thr Thr Ser Ala Arg Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Ala His Leu Ala Thr Ala His Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Phe Gly Ala Val Lys 35 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial modified T helper peptide from Measles virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 24 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 25 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(61) <223> UBI FMDV VP1 2570a, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 25 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Asn Ala 20 25 30 Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala 35 40 45 Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 26 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(61) <223> UBI FMDV VP1 O Campos/Brazil/58Y, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 26 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Ser Arg Asn Ala 20 25 30 Val Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala 35 40 45 Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 27 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(61) <223> UBI FMDV VP1 O swine/Cattle/O/MYA/7/02, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 27 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala 35 40 45 Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 28 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer K(20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(61) <223> UBI FMDV VP1 O/Ozk/93, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 28 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Asp Arg Ala 20 25 30 Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala 35 40 45 Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 29 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(59) <223> UBI FMDV VP1 Asia 1 JiangSu/China/2005, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 29 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Glu Ser 20 25 30 Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Val Asn Asn Cys 35 40 45 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 50 55 <210> 30 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon k. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(60) <223> UBI FMDV VP1 A24 Cruzeiro California, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 30 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys 35 40 45 Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 31 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(60) <223> UBI FMDV VP1 A Gansu/China/60Y, with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 31 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Thr Cys Gln Tyr Ser Thr Gly Asn 20 25 30 Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Arg Val Ala Ala Gln 35 40 45 Cys Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg 50 55 60 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(58) <223> UBI FMDV VP1 C3 Indaial/Brazil/84Y, with VP1 both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 32 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Thr Tyr Thr Gly Thr Cys Ala Tyr Thr Ala Ser Ala 20 25 30 Arg Arg Gly Asp Leu Ala His Leu Ala Ala Ala His Ala Arg Cys Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Val Lys 50 55 <210> 33 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Linked spacer, K (20) is epsilon K. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(60) <223> UBI FMDV VP1 A Argentina 2001, with VP1 both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized. <400> 33 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Thr Val Ser Gly 20 25 30 Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys 35 40 45 Ala Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (S221-M235) [FMDV VP4 20-35]. <400> 34 Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I223-T237)[FMDV VP4 22-36]. <400> 35 Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P369-K374)[FMDV VP2 74-88]. <400> 36 Pro Phe Gly Arg Cys Tyr Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (D582-A596) [FMDV VP3 78-92]. <400> 37 Asp Leu Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala 1 5 10 15 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (E745-V7964)[FMDV VP1 21-40]. <400> 38 Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu 1 5 10 15 Asp Arg Phe Val 20 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I759-N773) [VP1 35-49]. <400> 39 Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn 1 5 10 15 <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I759-L777)[FMDV VP1 35-53]. <400> 40 Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (V786-L800)[FMDV VP1 62-76]. <400> 41 Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (G808-P828)[FMDV VP1 84-104]. <400> 42 Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp 1 5 10 15 Asn Thr Thr Asn Pro 20 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P835-G856)[FMDV VP1 111-132]. <400> 43 Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu 1 5 10 15 Ala Thr Val Tyr Asn Gly 20 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (T895-C911)[FMDV VP1 167-183]. <400> 44 Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P912-V933)[FMDV VP1 188-209]. <400> 45 Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Ser Lys Ala Arg His Lys Gln 1 5 10 15 Lys Ile Val Ala Pro Val 20 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (R924-L937)[FMDV VP1 200-213]. <400> 46 Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P954-V968) [FMDV 2B 1-15]. <400> 47 Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val 1 5 10 15 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (F1093-K1106) [FMDV 2B 140-153]. <400> 48 Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (L1108-N1122) [FMDV 2C 1-15]. <400> 49 Leu Lys Ala Arg Asp Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (S1143-I1157) [FMDV 2C 36-50]. <400> 50 Ser Glu Glu Lys Phe Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (V1148-R1162) [FMDV 2C 41-55]. <400> 51 Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Leu Glu Lys Gln Arg 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (A1446-K1450) [FMDV 3A 21-35]. <400> 52 Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (N1516-K1529) [FMDV 3A 91-104]. <400> 53 Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Ser Ile Thr Thr Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (T1551-L1564) [FMDV 3A 101-114]. <400> 54 Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Asn Pro Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (E1551-N1564) [FMDV 3A 126-139]. <400> 55 Glu Lys Thr Leu Pro Gly His Lys Ala Ser Asp Asp Val Asn 1 5 10 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (G1579-K1592) [FMDV 3B1 1-14]. <400> 56 Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P1584-L1597) [FMDV 3B1 6-19]. <400> 57 Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P1607-A1620) [FMDV 3B2 6-19]. <400> 58 Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Val Lys Ala 1 5 10 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P1631-N1644) [FMDV 3B3 6-19]. <400> 59 Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (M1878-F1892) [FMDV 3D 16-30]. <400> 60 Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I1918-D1932)[FMDV 3D 56-70]. <400> 61 Ile Phe Ser Lys His Lys Gly Asn Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (A2108-V2122)[FMDV 3D 246-260]. <400> 62 Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met Phe Glu Glu Val 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (L2248-K2262)[FMDV 3D 386-400]. <400> 63 Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I1918-D1932) as homologue of [FMDV 3D 56-70]. <400> 64 Leu Phe Ser Arg His Arg Gly Asn Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (A2108-V2122) as homologue of [FMDV 3D 246-260]. <400> 65 Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Leu Met Phe Glu Glu Val 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (L2248-K2262) as homologue of [FMDV 3D386-400]. <400> 66 Ile Arg Lys His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (F1093-K1106) as homologue of [FMDV 2B 140-153]. <400> 67 Phe Phe Lys Ser Thr Pro Glu Asp Val Glu Lys Ala Glu Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (F1093-K1106) as homologue of [FMDV 2B 140-153]. <400> 68 Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Ala Glu Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (N1516-K1529) as homologue of [FMDV 3A 91-104]. <400> 69 Asn Asp Tyr Leu Glu Arg Ala Asn Leu Thr Thr Asp Pro Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (N1516-K1529) as homologue of [FMDV 3A 91-104]. <400> 70 Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ile Thr Thr Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (M1878-F1892) as homologue of [FMDV 3D 16-30]. <400> 71 Met Lys Arg Thr Arg Ile Ala Pro Thr Leu Ala His Gly Ile Phe 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (M1878-F1892) as homologue of [FMDV 3D 16-30]. <400> 72 Met Arg Lys Thr Lys Val Ala Pro Thr Ile Ala His Gly Leu Phe 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (S221-M235) as homologue of [FMDV VP4 20-34]. <400> 73 Ser Leu Leu Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (S221-M235) as homologue of [FMDV VP4 20-34]. <400> 74 Ser Val Val Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374) as homologue of [FMDV VP2 74-88]. <400> 75 Pro Phe Gly Lys Cys Tyr Ile Ile Glu Ile Pro Thr Asp His Arg 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374) as homologue of [FMDV VP2 74-88]. <400> 76 Pro Phe Gly Arg Cys Tyr Val Val Glu Val Pro Thr Asp His Lys 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (D582-A596) as homologue of [FMDV VP3 78-92]. <400> 77 Asp Val Ser Ile Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (D582-A596) as homologue of [FMDV VP3 78-92]. <400> 78 Asp Val Ser Val Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Val 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (I1918-D1932)[FMDV 3D 56-70]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> K or R <400> 79 Xaa Phe Ser Xaa His Xaa Gly Asn Thr Xaa Met Ser Glu Glu Asp 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O strain TAW/2/99 (A2108-V2122)[FMDV 3D 246-260]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> I or L <400> 80 Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Xaa Met Phe Glu Glu Val 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (L2248-K2262)[FMDV 3D386-400]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> K or R <400> 81 Xaa Xaa Xaa His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Xaa 1 5 10 15 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (F1093-K1106) [FMDV 2B 140-153]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> K or R <400> 82 Phe Phe Xaa Ser Thr Pro Glu Xaa Xaa Glu Xaa Ala Glu Xaa 1 5 10 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (N1516-K1529) (FMDV 3A 91-104) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> D or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> K or R <400> 83 Asn Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Ala Xaa Xaa Thr Thr Asp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (M1878-F1892) [FMDV 3D 16-30]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> V or L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> V or I or L <400> 84 Met Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (S221-M235) [FMDV VP4 20-34]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> I or L or V <400> 85 Ser Xaa Xaa Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374)[FMDV VP2 74-88]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> K or R <400> 86 Pro Phe Gly Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Glu Xaa Pro Thr Asp His Xaa 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (D582-A596) [FMDV VP3 78-92]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> A or S or V <400> 87 Asp Xaa Ser Leu Ala Ala Xaa His Met Ser Asn Thr Xaa Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 88 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial modified T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(65) <223> UBITh(R) 3-K- [FMDV 2B 140-153]-K- [FMDV 3A 91-104]-K-[FMDV 3D 16-30] from AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> K is linked spacer. <400> 88 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala 20 25 30 Glu Lys Lys Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Ser Ile Thr Thr Asp Asp 35 40 45 Lys Lys Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val 50 55 60 Phe 65 <210> 89 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Combinatorial modified T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(67) <223> UBITh(R) 3-K- [FMDV VP4 20-34]-K-[FMDV VP2 74-88]-K-[FMDV VP378-92] from AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> k is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> k is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> K is linked spacer. <400> 89 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Lys Pro Phe Gly Arg Cys Tyr Leu Leu Glu Leu Pro Thr 35 40 45 Asp His Lys Lys Asp Leu Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr 50 55 60 Phe Leu Ala 65 <210> 90 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial modified T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(67) <223> UBITh(R) 3-K-[FMDV 3D 56-70]-K-[FMDV 3D 248-260]-K-[FMDV 3D 386-400] AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> K or R <400> 90 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Xaa Phe Ser Xaa His Xaa Gly Asn Thr Xaa Met Ser 20 25 30 Glu Glu Asp Lys Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Xaa Met Phe 35 40 45 Glu Glu Val Lys Xaa Xaa Xaa His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly 50 55 60 Phe Tyr Xaa 65 <210> 91 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial modified T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(65) <223> UBITh(R) 3-K- [FMDV 2B 140-153]-K-[FMDV 3A 91-104]-K-[FMDV 3D 16-30] from AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> D or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> V or L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> V or I or L <400> 91 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Phe Phe Xaa Ser Thr Pro Glu Xaa Xaa Glu Xaa Ala 20 25 30 Glu Xaa Lys Asn Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Ala Xaa Xaa Thr Thr Asp Asp 35 40 45 Xaa Lys Met Xaa Lys Thr Xaa Xaa Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val 50 55 60 Phe 65 <210> 92 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(67) <223> UBITh(R) 3-K- [FMDV VP420-34]-K-[FMDV VP2 74-88]-K- [FMDV VP3 78-92] from AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> H or R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> L or C or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> E or H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> T or A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> H or K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> K or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> A or S or V <400> 92 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ser Xaa Xaa Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Lys Xaa Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Pro Xaa 35 40 45 Xaa His Xaa Lys Asp Xaa Ser Ile Ala Ala Xaa His Met Ser Asn Thr 50 55 60 Xaa Leu Xaa 65 <210> 93 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(67) <223> UBITh(R) 3-K- FMDV Th library from polyprotein type O, A, C and Asia-1 and type O-1 (ABR19839) sequence based construct [S221-M235]-K-[P360-K374]-K-[D582-A596]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> P or N or S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> R or H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> C or M or I or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Y or H or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> T or S or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> H or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> K or R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> A or S <400> 93 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ser Xaa Xaa Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Lys Xaa Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Pro Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Lys Asp Xaa Ser Xaa Ala Ala Xaa His Met Xaa Asn Thr 50 55 60 Xaa Leu Xaa 65 <210> 94 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(84) <223> UBITh(R) 3-K- FMDV Th library from polyprotein type O, A, C and Asia-1 and type O-1 (ABR19839) sequence based construct [I759-L777]-K-[G808-P828]-K-[P912-V933]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> L or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> K or Q or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> V or L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> T or Q or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> P or V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> K or S or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> D or S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Q or N or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> I or T or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> N or H or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> V or T or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> D or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> L or V or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> N or K or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> L or V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> P or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> E or V or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> D or E or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> T or Q or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> T or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> I or L or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> H or D or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> P or T or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> S or T or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> K or Q or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> A or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> K or E or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> V or E or A <400> 94 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Xaa Xaa Asp Arg Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Gly Xaa Xaa Thr Trp Val Pro Asn 35 40 45 Gly Xaa Pro Xaa Xaa Ala Leu Xaa Asn Xaa Xaa Asn Pro Lys Pro Arg 50 55 60 Pro Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Lys Gln Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Ala Pro Xaa <210> 95 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus (FMDV) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(74) <223> UBITh(R) 3-K- FMDV Th library from polyprotein type O, A, C and Asia-1 and type O-1 (ABR19839) sequence based construct [V786-L800]-K-[P835-G856]-K-[A1446-K1460]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> L or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> T or A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> K is linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> L or V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> N or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> K is lined spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> I or V <400> 95 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Gly Ala Xaa Leu Arg Xaa Xaa Thr Tyr Tyr Phe 20 25 30 Xaa Asp Leu Lys Pro Xaa Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro 35 40 45 His Arg Val Leu Ala Thr Xaa Tyr Xaa Gly Lys Ala Ala Ile Glu Phe 50 55 60 Phe Xaa Gly Met Val His Asp Ser Xaa Lys 65 70 <210> 96 <211> 24 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(24) <223> A12 (134-159) from FMDV VP1. <400> 96 Asn Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Gln 20 <210> 97 <211> 35 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(35) <223> A12 (134-169) from FMDV VP1. <400> 97 Asn Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly 20 25 30 Ala Ile Lys 35 <210> 98 <211> 35 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(35) <223> A12 [134(N-C) -158(Q-C) -169] from FMDV VP1, cyclized. <400> 98 Cys Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Cys Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly 20 25 30 Ala Ile Lys 35 <210> 99 <211> 40 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> A12 [129-134(N-C)-158(Q-C)-169] from FMDV VP1, cyclized. <400> 99 Val Tyr Asn Gly Thr Cys Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg 1 5 10 15 Gly Asp Phe Gly Ser Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Cys Leu Pro Ala 20 25 30 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 35 40 <210> 100 <211> 60 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is epsilon K as a linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(60) <223> A12 [129-134(N-C)-158(Q-C)-169] from FMDV VP1, cyclized. <400> 100 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Thr Cys Lys Tyr Ser Ala Ser Gly 20 25 30 Ser Gly Val Arg Gly Asp Phe Gly Ser Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg 35 40 45 Cys Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 101 <211> 56 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(56) <223> UBITh-K - O library [134-158 (T-C)-169], cyclized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is epsilon K as a linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> A or E <400> 101 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Cys Lys Tyr Xaa Xaa Asn Ala Val Thr Asn Val Arg 20 25 30 Gly Asp Leu Xaa Val Leu Ala Gln Lys Ala Xaa Arg Cys Leu Pro Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 50 55 <210> 102 <211> 59 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Combinatorial T helper sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> K is epsilon K as a linked spacer. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(59) <223> Asia library [129-134(T-C)-158(R-C)-169] from FMDV VP1, cyclized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> R or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> R or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Q or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> T or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> F or N <400> 102 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Val Tyr Asn Gly Lys Cys Thr Tyr Gly Glu Gln Pro 20 25 30 Ser Xaa Xaa Gly Asp Met Ala Ala Leu Ala Xaa Arg Leu Ser Arg Cys 35 40 45 Leu Pro Xaa Ser Xaa Asn Tyr Gly Ala Val Lys 50 55 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374) as homologue of [FMDV VP2 74-88]. <400> 103 Pro Phe Gly Lys Ser Tyr Ile Ile Glu Ile Pro Thr Asp His Arg 1 5 10 15 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374) as homologue of [FMDV VP2 74-88]. <400> 104 Pro Phe Gly Arg Ser Tyr Val Val Glu Val Pro Thr Asp His Lys 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> AJ539137 FMDV O, strain TAW/2/99 (P360-K374)[FMDV VP2 74-88]. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> L or I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> K or R <400> 105 Pro Phe Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Glu Xaa Pro Thr Asp His Xaa 1 5 10 15 <210> 106 <211> 211 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(211) <223> NCBI Reference Sequence: NP_740460.1 <400> 106 Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu 1 5 10 15 Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile 20 25 30 Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Lys Pro Lys Glu Gln Val 35 40 45 Asn Val Leu Asp Leu 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Val 65 70 75 80 Glu Ala Ile Arg Gln Leu Glu Gly Leu Thr Gly Leu Glu Leu His Glu 85 90 95 Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu His 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp 115 120 125 Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys 130 135 140 Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asp Gly Trp Phe 145 150 155 160 Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser Asp 165 170 175 Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn Gly Asp Trp 180 185 190 Lys Ala Lys Val Gln Arg Arg Leu Lys Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro 195 200 205 Ala Thr Trp Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn 210 215 220 Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly 225 230 235 240 Asp Asn Ala Thr Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr 245 250 255 Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp Xaa Phe Ser Lys Leu 260 265 270 Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys 275 280 285 Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg 290 295 300 Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr 305 310 315 320 Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly 325 330 335 Leu Glu Thr Arg Val Ala Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Thr His Leu 340 345 350 Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Xaa Phe Gly Arg Cys His Leu Leu Glu 355 360 365 Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Ile Tyr Gly Gly Leu Ile Asp Ser Tyr 370 375 380 Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn 385 390 395 400 Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu Leu Cys 405 410 415 Ser Ile Gln Lys Arg Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln 420 425 430 Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val Pro Phe 435 440 445 Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Lys Pro Trp Thr 450 455 460 Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala 465 470 475 480 Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn Val His Val 485 490 495 Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser 500 505 510 Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro 515 520 525 Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg 530 535 540 Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu His 545 550 555 560 Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg 565 570 575 Val Leu Thr Gln Phe Asp Leu Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn 580 585 590 Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr 595 600 605 Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg 610 615 620 Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ala His Cys Ile His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn 645 650 655 Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala 660 665 670 Tyr Thr Ala Ser Ser Thr Ala Glu Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val 675 680 685 Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val 690 695 700 Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe Asp Leu Arg Leu Pro Val Asp 705 710 715 720 Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Pro Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr 725 730 735 Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Val Thr Gln Ala Gln Arg Arg Gln 740 745 750 His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro 755 760 765 Gln Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr 770 775 780 Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ser Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu 785 790 795 800 Glu Leu Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly 805 810 815 Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Val Tyr His 820 825 830 Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg 835 840 845 Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Gly Ser Ser 850 855 860 Ala Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Arg Ala Ala 865 870 875 880 Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg 885 890 895 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 900 905 910 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 915 920 925 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu 930 935 940 Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val 945 950 955 960 Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu 965 970 975 Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala 980 985 990 Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp 995 1000 1005 Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu 1010 1015 1020 Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu 1025 1030 1035 Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu Glu Ile Leu Asp Ser 1040 1045 1050 Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser Leu Ser Ser Leu Phe 1055 1060 1065 His Val Pro Ala Pro Ala Phe Ser Phe Gly Ala Pro Leu Leu Leu 1070 1075 1080 Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser Thr Pro 1085 1090 1095 Glu Glu Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln Leu Lys Ala Arg Asp Ile 1100 1105 1110 Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn Gly Glu Trp Leu Val Lys 1115 1120 1125 Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala Trp Ile Ala Ser 1130 1135 1140 Glu Glu Lys Phe Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Leu 1145 1150 1155 Glu Lys Gln Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser Lys Tyr Lys Glu Ala 1160 1165 1170 Lys Glu Trp Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser Gly 1175 1180 1185 Asn Val His Ile Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala Pro 1190 1195 1200 Ser Arg Ser Arg Pro Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly Lys 1205 1210 1215 Ser Gly Gln Gly Lys Ser Phe Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln Ala 1220 1225 1230 Ile Ser Thr His Phe Thr Gly Arg Thr Asp Ser Val Trp Tyr Cys 1235 1240 1245 Pro Pro Asp Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr Val 1250 1255 1260 Val Val Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Phe 1265 1270 1275 Lys Tyr Phe Ala Gln Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro Pro 1280 1285 1290 Met Ala Ser Leu Glu Asp Lys Gly Lys Pro Phe Asn Ser Lys Val 1295 1300 1305 Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Arg Thr 1310 1315 1320 Met Val Cys Pro Asp Ala Leu Asn Arg Arg Phe His Phe Asp Ile 1325 1330 1335 Asp Val Ser Ala Lys Asp Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Lys Leu Asp 1340 1345 1350 Ile Ile Lys Ala Leu Glu Asp Thr His Thr Asn Pro Val Ala Met 1355 1360 1365 Phe Gln Tyr Asp Cys Ala Leu Leu Asn Gly Met Ala Val Glu Met 1370 1375 1380 Lys Arg Met Gln Gln Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro Pro Leu Gln 1385 1390 1395 Asn Val Tyr Gln Leu Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val Glu Leu 1400 1405 1410 His Glu Lys Val Ser Asn His Pro Ile Phe Lys Gln Ile Ser Ile 1415 1420 1425 Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln 1430 1435 1440 His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser 1445 1450 1455 Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Val Gln Gln Thr Ser Phe Val 1460 1465 1470 Lys Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Ile Val Ala 1475 1480 1485 Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg Glu 1490 1495 1500 Thr Arg Lys Arg Gln Gln Met Val Asp Asp Ala Val Asn Glu Tyr 1505 1510 1515 Ile Glu Lys Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu 1520 1525 1530 Ala Glu Lys Asn Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val Gly 1535 1540 1545 Phe Arg Glu Arg Thr Leu Pro Gly Gln Lys Ala Ser Asp Asp Val 1550 1555 1560 Asn Ser Glu Pro Ala Lys Pro Val Asp Glu Gln Pro Gln Ala Glu 1565 1570 1575 Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val 1580 1585 1590 Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met 1595 1600 1605 Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val 1610 1615 1620 Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu 1625 1630 1635 Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro 1640 1645 1650 Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val 1655 1660 1665 Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr 1670 1675 1680 Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala 1685 1690 1695 Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp 1700 1705 1710 Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln 1715 1720 1725 Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn 1730 1735 1740 Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met 1745 1750 1755 Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala Asp Val 1760 1765 1770 Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile 1775 1780 1785 Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr 1790 1795 1800 Arg Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala 1805 1810 1815 Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly 1820 1825 1830 Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu 1835 1840 1845 Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro His His Glu Gly 1850 1855 1860 Leu Ile Ile Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met 1865 1870 1875 Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn 1880 1885 1890 Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg Leu 1895 1900 1905 Asn Glu Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser Lys His Lys 1910 1915 1920 Gly Asp Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe Arg Arg 1925 1930 1935 Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Glu Leu Gly Thr 1940 1945 1950 Ala Asn Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp 1955 1960 1965 Gly Leu Asp Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp 1970 1975 1980 Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn 1985 1990 1995 Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Thr Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu 2000 2005 2010 Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu 2015 2020 2025 Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg Ile Val 2030 2035 2040 Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr Arg Met Met Ile 2045 2050 2055 Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ala Asn Asn Gly Pro Arg Ile 2060 2065 2070 Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln Arg Phe 2075 2080 2085 Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp Tyr 2090 2095 2100 Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met 2105 2110 2115 Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro Asn Ala 2120 2125 2130 Glu Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr Glu 2135 2140 2145 Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser 2150 2155 2160 Ala Thr Ser Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu 2165 2170 2175 Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr 2180 2185 2190 Thr Met Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp Tyr 2195 2200 2205 Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly 2210 2215 2220 Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu 2225 2230 2235 Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His Phe His 2240 2245 2250 Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys Pro Val Met Ala Ser Lys 2255 2260 2265 Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg Arg Gly Thr Ile Gln 2270 2275 2280 Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val His Ser Gly Pro 2285 2290 2295 Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly Leu Phe Glu 2300 2305 2310 Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn Ala Val 2315 2320 2325 Cys Gly Asp Ala 2330

Claims (30)

1. a) FMDV VP1 루프화(looped) B 세포 에피토프 서열 및 Th 에피토프 서열을 포함하는 합성 면역원성 펩티드;
   b) 합성 FMDV T 헬퍼 에피토프 서열을 포함하는 별도의 펩티드; 및
   c) 수의학상 허용되는 전달 비히클 또는 아주반트
   를 포함하며, 여기서 (a)에서의 합성 면역원성 펩티드는
   i) 서열 1 또는 2;
   ii) (a)의 상동체; 및
   iii) (a) 또는 (b)의 임의의 조합
   으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 구제역 (FMD) 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 FMD 백신.
3. 제1항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 FMD 백신.
4. 제1항에 있어서, (b)에서의 상동체가 서열 3 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 서열 2의 상동체인 FMD 백신.
5. 제1항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 Th 에피토프 서열의 카르복실-말단에 공유결합으로 연결된 것인 FMD 백신.
6. 제5항에 있어서, Th 에피토프 서열이 서열 24인 FMD 백신.
7. 제5항에 있어서, T 헬퍼 에피토프가 엡실론 리신 잔기를 포함하는 스페이서를 통해 펩티드 항원에 공유결합으로 연결된 것인 FMD 백신.
8. 제5항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 25 내지 33 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FMD 백신.
9. 제5항에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34 내지 95 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FMD 백신.
10. 제1항에 있어서, (a)에서의 펩티드 항원의 총량이 용량 당 약 10 ㎍ 내지 약 1 ㎎인 FMD 백신.
11. 제1항에 있어서, 전달 비히클 또는 아주반트가 몬타니드(Montanide) ISA 50V, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, 에멀시젠(Emulsigen), 에멀시젠 D, 및 CpG 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FMD 백신.
12. 제8항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 25, 27, 28, 29, 및/또는 이들의 조합인 FMD 백신.
13. 제9항에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34-63, 90, 및/또는 이들의 조합인 FMD 백신.
14. 제1항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 25, 27, 28, 29 및/또는 이들의 조합이고, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 34-63, 90, 및 이들의 조합인 FMD 백신.
15. 제약상 유효량의 제14항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.
16. 제15항에 있어서, 동물이 돼지인 방법.
17. 제약상 유효량의 제14항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 동물이 돼지인 방법.
19. 제8항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 25, 27, 28, 29, 31, 및/또는 이의 조합인 FMD 백신.
20. 제약상 유효량의 제19항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.
21. 제20항에 있어서, 동물이 소인 방법.
22. 제약상 유효량의 제19항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 동물이 소인 방법.
24. 제8항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 26, 30, 32, 33, 및/또는 이의 조합인 FMD 백신.
25. 제9항에 있어서, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 91-95, 및 이의 조합인 FMD 백신.
26. 제1항에 있어서, (a)에서의 합성 면역원성 펩티드가 서열 26, 30, 32, 33, 및/또는 이의 조합이고, (b)에서의 FMDV T 헬퍼 에피토프 펩티드가 서열 91-95, 및 이의 조합인 FMD 백신.
27. 제약상 유효량의 제26항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, 동물에서 면역 반응을 도출시키는 방법.
28. 제27항에 있어서, 동물이 소인 방법.
29. 제약상 유효량의 제26항의 백신의 단일 투여를 동물에게 제공하는 것을 포함하는, FMD 감염으로부터 동물을 보호하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 동물이 소인 방법.

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