CN111803626A - 猪口蹄疫o型和a型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用，涉及合成肽疫苗技术领域；包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联，所述口蹄疫毒株包括O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒；所述O型口蹄疫病毒包括OZK/93和O/MYA98/BY/2010口蹄疫病毒毒株；所述A型口蹄疫病毒包括A/GDMM/2013口蹄疫病毒毒株。试验表明该二价合成肽疫苗具有生物安全性好，易于大规模合成，可以有效预防目前国内流行的O型及A型猪口蹄疫流行毒株的感染。

Description

猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及合成肽疫苗技术领域，具体涉及一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种针对流行的猪O型口蹄疫病毒和猪A型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的二价合成肽疫苗及其制备方法和与应用。

背景技术

口蹄疫病毒(FMDV)在偶蹄类动物(包括牛和猪)中引起高度传染性疾病，发病率很高。FMDV可以通过使用化学灭活的全病毒疫苗来控制；但是，一些缺点与灭活疫苗的使用有关。例如，疫苗提供了短期保护，因此需要重新接种，并且在疫苗生产过程中有污染性NS蛋白质被释放的风险，免疫动物除了产生病毒结构蛋白外，还产生了对污染蛋白的抗体反应，这使得用目前认可的诊断试验很难可靠地区分免疫动物与感染或恢复期动物。因此，一些拥有大型畜牧业的国家已经放弃了疫苗接种。但这一政策使得畜群容易突然爆发口蹄疫，对牲畜养殖和国家民生经济产生巨大影响，正如2001年英国所见反过来导致了对替代疫苗接种策略的深入研究。

FMD病毒颗粒由一个正链RNA基因组、一个编码四种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的开放阅读框(ORF)和十一种不同的成熟非结构蛋白(NSP)组成。多肽疫苗是一种依靠短肽片段来设计高靶向诱导免疫反应，从而避免过敏或反应性序列。位于FMDVVP1蛋白G-H环(约129-169残基)中的B细胞结合位点被鉴定为一个主要表位，可在自然宿主和动物模型中诱导对该病毒的中和抗体,各种基于FMDVVP1G-H环的合成肽或重组蛋白疫苗在猪中已显示出有效性。

上述策略为接种的动物提供了有限的病毒免疫原子集，尽管它们经常诱导中和抗体的高滴度，但它们并不总能在家畜中实现对病毒挑战的保护，主要原因是并非所有宿主物种可以识别这些表位。所以一种有效的多肽疫苗需要一个B细胞表位来激发高中和抗体反应，需要一个T细胞表位来提供T细胞和B淋巴细胞之间的充分合作。

那么诱导保护性免疫的另一机制即刺激表位特异性T细胞就显得尤为重要。在感染性疾病的情况下，T细胞的募集可导致病原体本身或受感染宿主细胞的迅速破坏和清除，从而阻止感染的传播。通用的辅助性T细胞表位，可与表位肽或蛋白质序列串联融合以刺激抗体反应，从而对关键中和表位更集中的免疫反应。本发明采用的T细胞辅助多肽表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白(MVF 288-302)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg19-33)，并进行了组合突变进行了优化，并在不同的遗传背景下进行了广泛的反应性筛选显示出良好的免疫原性。

所以通过T细胞表位来提供T细胞和B淋巴细胞之间的充分合作形成的合成肽是特别有吸引力的FMDV疫苗候选，它们是高度纯净，结构明确，稳定和使用安全，并且由于它们可以模块化方法制备，并且可以合并融合不同的T细胞辅助多肽。

FMDV具有A型、O型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型七种不同的血清型，并且每一种血清型之间没有交叉保护作用，口蹄疫病毒极易发生变异，一次口蹄疫暴发其病毒估计有50～100个位置的核苷酸发生突变，如果在免疫压力下其发生变异的频度会更高，并可能发生主要抗原位点变异而导致病毒抗原性的改变，从而使交叉保护不完全，即同型疫苗不能对同一血清型的某些毒株起到保护作用。目前在我国牲畜养殖种主要存在A型和O型二种血清型的流行。

公开号为CN108273054A的中国发明专利公开了一种即对血清型O型又对血清型A有防治作用的疫苗，其利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，通过原核表达系统表达重组蛋白形成疫苗免疫动物，但其存在着一些难于克服的缺点，如表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害，同时过量表达可能导致非生理反应，并且目的抗原常以包涵体形式表达，导致后续产物纯化困难；表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性一般较低，这也使得专利中表达出的多肽用量较高在100ug-200ug/头份。

发明内容

为解决现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种针对流行的猪血清O型口蹄疫病毒和猪血清A型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法和与应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。

所述T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽是通过化学合成方法得到；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过化学合成方法相串联；

所述合成肽疫苗还包括免疫佐剂，T细胞辅助表位混合多肽、B细胞抗原表位串联多肽与免疫佐剂混合形成油包水或水包油包水乳液疫苗；

优选的，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA 50V形成油包水乳液疫苗；

优选的，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA 206形成水包油包水乳液疫苗。

优选的，所述串联的方法具体包括将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少一个赖氨酸相连接；更加优选的，赖氨酸含有两个氨基(ɑ-氨基和ε-氨基)，所述串联的方法具体为将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过ε-N-赖氨酸或ε-N-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸相连接，ε-N-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸代表N-末端的赖氨酸再连接其它分子时是连接在ε-氨基上。

优选的，所述T细胞辅助表位混合多肽的T细胞辅助表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白(MVF 288-302)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg19-33)，并经过人工组合突变改造优化所得。

所述人工组合突变改造优化的方法具体为：通过串联外源“混杂性”Th表位可有效增强或刺激机体对其免疫应答能力，这与生物广泛趋异进化的MHC基因型有关；像这类表位通常具有T细胞表位的共性特征，如Berzofsky认为的具有两性α螺旋二级结构共性，其中疏水性氨基酸占据螺旋一面，带电荷残基和极性氨基酸占周围面，这类结构在亲水环境中，疏水性残基有助于α螺旋形成；Rothbard等分析比较了一些已知的T细胞表位序列的一级结构，得出MHC-Ⅱ类分子与抗原肽结合位点的氨基酸共有的模式特征Rothbard规则。这些规则和共性都有助于构建人造通用Th表位，根据这些规则构建的Th2表位已成功用于猪口蹄疫O型合成肽疫苗，根据这类规则构建Th1表位。

T细胞表位特异性由T细胞受体(TCR)介导，TCR将I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)的“肽结合沟”中的肽与抗原提呈细胞(APC)结合。整个抗原被APCs内化并蛋白水解，然后短肽(I类为8-11个残基，II类为11-30个残基)被装载到MHC(或HLA)中并呈现在APC表面。然后肽表位特异性的TCR去结合那些肽-MHC复合物(pMHCs或pHLA)，T细胞/APC界面上的各种蛋白质协调T细胞克隆的扩展。通常I类MHC中呈现的肽通常较短；设计的肽遵循X-(L/I)-X(6-7)-(V/L)的序列模式，其中，L/I和V/L代表其侧链将肽锚定到pMHC，从而使朝向肽结合槽的内部远离TCR的残基，其他位置指向TCR，与这些残基的相互作用介导了表位特异性。II类MHC肽的序列变化较大，但也包含锚定位置，从而使表位肽主链紧密地结合在具有延伸主链构象的肽结合槽中，形成较长的肽可容纳鼓包，同时抗原肽的识别需要有一个游离的N-末端胺基。

因此，T细胞表位骨架构象受到结合到多肽结合槽的空间限制，但抗体表位的构象可能更加异构。特异的线性肽抗体序列通常在结合部位含有一个凹槽，而那些结合跨越多个二级结构元件的蛋白质表面的抗体通常较平坦。近些年，科学家按照T细胞肽表位骨架构象的设计原理筛选出了众多T细胞辅助表位多肽，有基于乙肝病毒表面和核心抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T辅助细胞表位、镰状疟原虫环孢子体T辅助细胞表位、曼森氏吸虫三糖磷酸盐异构酶T辅助细胞表位，及大肠杆菌TraTT辅助细胞表位等；本发明所用的T辅助细胞肽表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白(MVF 288-302)和乙型肝炎病毒表面抗(HBsAg19-33)，这些表位中的位点通过组合突变进行了优化，序列表1所示，并在不同的遗传背景下进行了广泛的反应性筛选显示出良好的免疫原性。

优选的，如下表1所示所述T细胞辅助表位混合多肽包括Th1、Th2、Th3中的一种；

表1 T细胞表位肽序列

其中，

Th1的序列为GILES/T(1:1)R/K(1:1)GIK/R(1:1)AR/K(1:1)IT/G(1:1)H/R(1:1)TELIF；

Th2的序列为ISIS/T(1:1)EIG/R(1:1)K/T(1:1)VIVK/R(1:1)H/T(1:1)IEG/T(1:1)IFLL；

Th3的序列为LSEIKGVIVHRLEGV。

如S/T(1:1)表示序列中这个位置在合成时采用S和T两个氨基酸以相同摩尔比投料，采用N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合从而保证产物中双氨基酸占比各占50％，得到混合肽中这两个条肽的比例为1:1。

优选的，所述口蹄疫毒株包括O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒；

所述O型口蹄疫病毒包括OZK/93、O/MYA98/BY/2010口蹄疫病毒毒株；所述A型口蹄疫病毒包括A/GDMM/2013口蹄疫病毒毒株。

其中一种O型多肽是依据OZK/93毒株设计，OZK/93归属于旧猪毒(Cathy拓朴型病毒(古典中国型)分为3个进化分支，旧猪毒为3个进化分支主要在1970—1993年间流行，OZK/93为Cathy型病毒的主要流行分支，临床仍主要以猪发病为主)，为我国最近10多年来猪口蹄疫O型疫苗的经典制苗毒株。该毒株抗原谱广，对乳鼠、细胞、本动物适应性好，为疫苗毒株优秀代表；另一种O型多肽是依据O/MYA98/BY/2010毒株设计，O/MYA98/BY/2010归属Mya98谱系，为2009年7月以来造成我国O型口蹄疫流行的新传入毒株；A型多肽是依据A/GDMM/2013毒株设计，A/GDMM/2013归属Sea-97谱系，是2013年3月首次大规模引发我国猪A型口蹄疫疫情的毒株。这三种特异性多肽抗原配伍应用覆盖了目前国内对猪群危害最大的主要的流行口蹄疫O型流行毒株和A型流行毒株。

通过对VP1蛋白的三维结构及高变异区的氨基酸序列比较得知，若想设计合成出能广泛覆盖VP1抗原位点的合成肽，必须包含该环状构造上更多的片段、考虑关键位点氨基酸的变异。我们前期豚鼠免疫实验发现，长的VP1多肽抗原免疫性能较强，VP1氨基酸序列中包含129～169位或129～171位氨基酸的多肽最具免疫效力。结合国家口蹄疫参考实验室和国际口蹄疫参考实验室所提供的口蹄疫氨基酸序列数据库，我们对所得到的O型口蹄疫病毒各拓扑型的VP1序列(129～169)以及A型口蹄疫病毒各拓扑型的VP1序列(129～171)逐一比较。最终我们选择了O型口蹄疫病毒OZK/93株、O/MYA98/BY/2010和A型口蹄疫病毒A/GDMM/2013株的VP1序列作为疫苗多肽抗原的B细胞表位模板，具体序列如表2所示。同时我们根据Chou and Fasman和Garnier and Robson两种方法进行二级结构预测三种抗原多肽的B细胞表位二级结构也与1990年Francis发表于Nature上口蹄疫病毒G-H环的结构一致。

如下表2和下图1所示：

优选的，所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列(VP1序列129～169，SEQ ID NO.4)为VYNGSCKYSDARVSNVRGDLQVLAQKAERCLPTSFNYGAIK；所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列的158位C与134位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

优选的，所述O/MYA98/BY/2010相关的B细胞抗原表位序列(VP1序列129～169，SEQID NO.5)为VYNGNCKYAGGSLTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK；所述O/MYA98/BY/2010相关的B细胞抗原表位序列的158位C与134位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

优选的，所述A/GDMM/2013相关的B细胞抗原表位序列(VP1序列129～171，SEQ IDNO.6)为VYSGCSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPCSFNFGAIRATEI，所述A/GDMM/2013相关的B细胞抗原表位序列的159位C与133位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

表2多肽2700，2800，MM13的B细胞表位序列

多肽抗原表位可以结合α螺旋、β链/延伸或环构象的抗体。抗原-抗体复合物中肽表位的精确构象对抗体的活性很重要。所以我们采用了一些方法来限制肽表位，这些方法包括共价侧链即通过形成包含二硫键的共价限制进行侧链交联，或将表位整合到包含诱导相关肽构象的元素的较大支架中，以构象相关的方式呈现肽疫苗。本发明中所用的是形成二硫键的共价限制进行侧链交联的方式限制肽表位，为此我们将OZK/93和O/Mya VP1序列的158A、P均由C取代，与134位C形成二硫键；A/GDMM/2013 VP1序列的159A由C取代，与133位C形成二硫键，这一方法的成效在前期猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果试验中得到证实。

如下图2所示，本发明最终采用以O型口蹄疫病毒毒株的129～169位、A型口蹄疫病毒毒株的129～171位VP1序列多肽为B细胞表位，以ε-N赖氨酸(ε-N-Lys)连接Th细胞表位，并通过两个半胱氨酸形成环状结构，其免疫原性最好，使免疫原性弱的抗原产生强效免疫应答反应，能在表现遗传多样性MHC种群的大多数个体中诱导T细胞应答，并且合成这类多肽的产率和纯度更高，是工业化大规模生产FMD合成肽疫苗的最佳选择，得到的T+B细胞表位肽序列如下表3所示。

表3.T+B细胞表位肽序列

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：

A、在固相载体上用化学合成的方法合成B细胞抗原表位多肽，然后继续连接至少一个赖氨酸，然后在多肽的最N端赖氨酸的ε-氨基上连接T细胞辅助表位混合多肽，T细胞表位中涉及到的双氨基酸位点(如S/T(1:1)、R/K(1:1)等)的两个氨基酸以相同摩尔比投料，采用二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合从而保证产物中双氨基酸占比各占50％，最终得到连接在固相载体上的T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽；

B、通过混合有机酸液将串联多肽从固相载体上切除下来，以醚类沉淀，洗涤得到T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品；所述混合有机酸液包括三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯酚、水；所述醚类包括乙醚、叔丁基甲醚；

C、通过DMSO氧化T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品上的氨基酸巯基环化形成分子内的二硫键，并以Ellman’s试剂检测巯基的残余量；

D、环化结束后，通过阳离子交换树脂去除溶液中的有机酸，收集流出液；

E、通过切向流膜包系统浓缩流出液，并去除串联多肽中的小分子杂质；

F、浓缩液通过0.22um的滤芯过滤除菌；

G、在一定剪切力下，将无菌液与油佐剂混合形成乳液，装瓶，贴签形成疫苗。

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，其特征在于，用于制备预防和治疗O型和A型口蹄疫的制剂或用于制备区分感染动物和被免疫动物的制剂的应用。

综上所述，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)相较于市场上针对猪口蹄疫的灭活疫苗，本发明所述的合成肽疫苗具有以下优势(i)合成肽疫苗不是传染性因子，在制备过程中没有病毒释放的风险；(ii)合成肽疫苗没有导致毒力的逆转，也没有遗传整合或重组的风险；(iii)在设计起始可以排除掉引起动物过敏、炎症等不良反应的有害序列；(iv)合成肽疫苗的免疫原性可以通过设计时的结构精细调节得到优化；(v)合成肽设计抗原可以以简单、直接的方式被纯化和表征；(vi)合成肽疫苗可以以较低的成本大规模生产；(vii)传统的灭活疫苗从合成到运输都需要特别的预防措施，而合成肽疫苗与传统的灭活疫苗相比更易于储存和运输；

(2)相较于专利CN108273054A公开的猪口蹄疫基因工程表达疫苗，本发明所述的合成肽疫苗具有以下优势：基因工程表达疫苗利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，通过原核表达系统表达重组蛋白形成疫苗免疫动物，但其存在着一些难于克服的缺点，如表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害，同时过量表达可能导致非生理反应，并且目的抗原常以包涵体形式表达，导致后续产物纯化困难；表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性一般较低，这也使得专利中表达出的多肽用量较高在100ug-200ug/头份。合成肽疫苗较其来讲存在着明显的优势，其分子结构小而稳定，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题；同时其可精确定位，化学合成T、B细胞抗原表位后可进行不同组合，制成针对多种病原体的疫苗，并且其用量一般较少，一般每种抗原成分在25ug/头左右。而本发明提供了一种针对流行的猪血清O型口蹄疫病毒和猪血清A型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的二价合成肽疫苗，拓宽了合成肽疫苗的抗原谱，并起到免疫效力相互叠加的作用，具有更良好的交叉保护力和抗原广谱性，可以完全能抵抗国内现有的多种O型流行毒株和A型流行毒株的攻击。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为抗原表位肽链构建形成二硫键示意图；

图2为Th表位与B细胞抗原表位以ε-N赖氨酸连接示意图。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例1

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，包括如下步骤：

A、使用全自动合成肽合成仪，多肽抗原的合成是采用Merrifield固相合成法合成。采用25％哌啶对合成树脂进行去保护反应，运行全自动合成仪将Fmoc/tBu保护氨基酸和反应缩合剂加至反应器中进行耦合反应，当耦合反应完全后，用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链生成。然后再次执行去保护反应去除肽树脂N末端F-moc保护基，进入下一个反应循环。合成过程由合成序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行；

步骤A的具体过程如下：

A1、制备B细胞抗原表位多肽：使用EST-150全自动合成肽合成仪，应用Merrifield固相合成法合成。起始采用Rink amide MBHA树脂作为合成用固相载体，以N-甲基2-吡咯烷酮作为溶胀树脂溶剂及洗涤溶剂，采用25％哌啶对合成树脂进行去保护反应，运行全自动合成仪将Fmoc/tBu保护氨基酸和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂加至反应器中进行耦合反应，当每步耦合反应完全后，用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链生成。然后再次执行25％哌啶去保护反应去除肽树脂N末端Fmoc保护基，进入下一个反应循环。合成过程由合成序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行，由此得到一系列多肽(OZK/93(129～169)、O/MYA98/BY/2010(129～169)、A/GDMM/2013(129～171))；

A2、制备T细胞辅助表面多肽：

Th1的获得方法如下：在合成的B细胞抗原表位多肽树脂上连接ε-N赖氨酸，具体是采用Boc-Lys(Fmoc)-OH保护氨基酸，采用N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合，N-甲基2-吡咯烷酮洗涤后以25％哌啶去除ε-氨基上的Fmoc从而暴露出ε-氨基，然后按照T细胞辅助表面多肽的序列顺序继续合成，在单氨基酸位置采用Fmoc/tBu保护氨基酸和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂进行耦合反应，在双氨基酸位置(如H和R、T和G、R和K、S和T)采用Fmoc/tBu保护氨基酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合从而保证产物中双氨基酸占比各占约50％。合成过程由T细胞辅助表面多肽序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行直至合成Th1-K-(OZK/93(129～169))、Th1-K-(O/MYA98/BY/2010(129～169))、Th1-K-(A/GDMM/2013(129～171))。

Th2的获得方法如下：在合成的B细胞抗原表位多肽树脂上连接ε-N赖氨酸，具体是采用Boc-Lys(Fmoc)-OH保护氨基酸，采用N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合，N-甲基2-吡咯烷酮洗涤后以25％哌啶去除ε-氨基上的Fmoc从而暴露出ε-氨基，然后按照T细胞辅助表面多肽的序列顺序继续合成，在单氨基酸位置采用Fmoc/tBu保护氨基酸和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂进行耦合反应，在双氨基酸位置(如T和G、H和T、R和K、K和T、G和R、S和T)采用Fmoc/tBu保护氨基酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合从而保证产物中双氨基酸占比各占约50％。合成过程由T细胞辅助表面多肽序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行直至合成Th2-K-(OZK/93(129～169))、Th2-K-(O/MYA98/BY/2010(129～169))、Th2-K-(A/GDMM/2013(129～171))。

Th3的获得方法如下：在合成的B细胞抗原表位多肽树脂上连接ε-N赖氨酸，具体是采用Boc-Lys(Fmoc)-OH保护氨基酸，采用N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合，N-甲基2-吡咯烷酮洗涤后以25％哌啶去除ε-氨基上的Fmoc从而暴露出ε-氨基，然后按照T细胞辅助表面多肽的序列顺序继续合成，采用Fmoc/tBu保护氨基酸和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂进行耦合反应，合成过程由T细胞辅助表面多肽序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行直至合成Th3-K-(OZK/93(129～169))、Th3-K-(O/MYA98/BY/2010(129～169))、Th3-K-(A/GDMM/2013(129～171))

A3、取少量上述含双氨基酸位点的肽－树脂混合物加入90％三氟乙酸(TFA)、4％三异丙基硅烷、5％苯酚和1％注射用水的反应溶液，室温匀速搅拌4小时，过滤去除废树脂，然后用醚沉淀获得肽固体，醚洗涤后干燥。取样测定氨基酸组成分析和氨基酸序列测定,确定抗原多肽氨基酸组成及N端多肽序列与设计一致，具体见表4、5、6。

表4：双氨基酸位点合成抗原多肽的氨基酸组成分析结果统计(1)

表5：合成抗原多肽的氨基酸组成分析结果统计(续)

表6：合成抗原多肽的N端Edman多肽序列测定(1-20氨基酸)结果统计

B、多肽与固相载体的分离 配制含90％三氟乙酸(TFA)、4％三异丙基硅烷、5％苯酚和1％注射用水的反应溶液，加入肽－树脂与其匀速搅拌反应4小时，然后用醚溶液沉淀获得肽树脂混合物，用砂芯漏斗分离多肽溶液与树脂颗粒；

C、环化反应 测定多肽溶液pH值，用氨水溶液和醋酸溶液调整pH值至6.0～8.0，采用DMSO进行环化反应，使得OZK/93(129～169)对应抗原多肽的(Cys158-Cys134)位点、O/MYA98/BY/2010(129～169)对应抗原多肽的(Cys158-Cys134)位点、A/GDMM/2013(129～171)对应抗原多肽的(Cys159-Cys133)位点形成二硫键，并以Ellman’s试剂检测巯基的残余量直至反应完成；

D、去盐纯化 环化的多肽溶液用强碱型阴离子交换树脂处理去除溶液中的盐及有机酸，收集流出液；

E、浓缩纯化 通过切向流膜包系统浓缩流出液，并去除串联多肽中的小分子杂质，浓缩液取样检测浓度；

F、多肽的除菌 多肽经纯化处理后再在净化工作台内，使用孔径为0.22μm的无菌过滤器对浓缩纯化多肽进行过滤除菌，即可获得表7所示的无菌的抗原多肽1、2、3、4、5、6、7、8、9。

表7.T+B细胞表位肽序列

实施例2

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 50 V2与实施例1中抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：

1、水相制备 使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽1、2、3、4、5、6、7、8、9稀释至50μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。

2、油相制备 油相佐剂Montanide ISA 50 V2在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。

3、乳化 先将油相加入乳化罐内，然后以80～100r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再以8500r/min搅拌6分钟，使其乳化形成油包水乳剂，即得本发明的口蹄疫病毒疫苗，记为疫苗2700、7309、6309、2800、7312、6312、MM13、TT026、TT-027。

实施例3

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 206与实施例1中抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：

1、水相制备 使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽1、2、3、4、5、6、7、8、9稀释至50μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。

2、油相制备 油相佐剂Montanide ISA 206在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。

3、乳化 先将油相加入乳化罐内，然后以40～60r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再在31℃下以350r/min搅拌5分钟，使其乳化形成油包水乳剂，20℃恒温1hr，即得本发明的口蹄疫病毒疫苗，记为疫苗2700’、7309’、6309’、2800’、7312’、6312’、MM13’、TT026’、TT-027’。

实施例4

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，以实施例2中Montanide ISA50V2与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；

1.选取45头猪(体重40kg左右的健康架子猪，ELISA效价不高于1∶8)作为免疫试验组，每头注射由25μg合成肽与矿物油佐剂乳化而成的疫苗即实施例2获得的疫苗。免疫后分别于第0、7、14、21和28日采血备用。

2.将采集的血清分别使用3种检测方法进行抗体检测，严格按照试剂盒使用说明书进行检测。口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(FMDV-O-LpB-ELISA)购自中国农业科学院兰州兽医研究所；口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(FMDV-A-LpB-ELISA)购自中国农业科学院兰州兽医研究所；猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒购自上海优耐特生物医药有限公司。

3.检测结果见表8，通过表8试验结果表明，无论是Th1还是Th2或Th3与VP1抗原串联后都能有效改善口蹄疫病毒弱免疫原性，增强其免疫应答，其中以Th1效果最为明显，这用VP1-ELISA和LpB-ELISA试验都得到证实。

表8不同Th表位与FMDV VP1嵌合多肽对猪的免疫效果比较

注：抗体检测分别采用O型或A型LpB-ELISA方法。

实施例5

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，以实施例3中Montanide ISA 206与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；

1.选取45头猪(体重40kg左右的健康架子猪，ELISA效价不高于1∶8)作为免疫试验组，每头注射由25μg合成肽与矿物油佐剂乳化而成的疫苗即实施例3获得的疫苗。免疫后分别于第0、7、14、21和28日采血备用。

2.将采集的血清分别使用3种检测方法进行抗体检测，严格按照试剂盒使用说明书进行检测。口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(FMDV-O-LpB-ELISA)购自中国农业科学院兰州兽医研究所；口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(FMDV-A-LpB-ELISA)购自中国农业科学院兰州兽医研究所；猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒购自上海优耐特生物医药有限公司。

3.检测结果见表9，通过表9试验结果表明，无论是Th1还是Th2或Th3与VP1抗原串联后都能有效改善口蹄疫病毒弱免疫原性，增强其免疫应答，其中以Th1效果最为明显。

表9不同Th表位与FMDV VP1嵌合多肽对猪的免疫效果比较

注：抗体检测分别采用O型或A型LpB-ELISA方法。

实施例6

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用的效力试验；

试验样品：实施例2中制备获得的疫苗2700、2800、MM13。

试验动物：口蹄疫阴性的健康架子猪，体重约40kg/头，4月龄左右。

试验毒种：OZK/93 MF6毒株、O/MYA98/BY/2010 MF8毒株、A/GDMM/2013 MF8毒株强毒，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

试验方法：用体重40kg左右的健康易感架子猪(ELISA抗体效价不高于1∶8)15头，分为3组，每组5头。将2700、2800、MM13抗原多肽分别乳化配制成疫苗，每头按1.0ml分别于耳根后肌肉注射，接种28日后，连同条件相同的对照猪2头，每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀的猪口蹄疫病毒OZK/93 MF6、O/MYA98/BY/2010 MF8、A/GDMM/2013 MF8强毒。连续观察10日。对照猪均应至少一蹄出现水疱病变。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。

试验结果如表10和表11。

表10.含O型抗原多肽免疫28日抗体效价及免疫效果

表11.含A型抗原多肽免疫28日抗体效价及免疫效果

实施例7

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 50 V2与实施例1混合抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：

1、水相制备 使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽1、4、7(2700、2800、MM13)稀释至混合浓度150μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。

2、油相制备 油相佐剂Montanide ISA 50 V2在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。

3、乳化 先将油相加入乳化罐内，然后以80～100r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再以8500r/min搅拌6分钟，使其乳化形成油包水乳剂，这样每头份疫苗含多肽2700、2800、MM13各25μg，即得本发明的口蹄疫病毒疫苗，记为疫苗猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

实施例8：猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗效力检验试验

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，以实施例7中Montanide ISA 50V2与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；

试验样品：实施例7中制备获得的含有2700、2800、MM13的混合抗原多肽猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

试验动物：口蹄疫阴性的健康架子猪，体重约40kg/头，4月龄左右。

试验毒种：OZK/93 MF6毒株、O/MYA98/BY/2010 MF8毒株、A/GDMM/2013 MF8毒株强毒，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

实验猪筛选 利用LpB-ELISA和3ABC-ELISA方法进行阴性猪筛选检测，所筛选出的实验动物应符合LpB-ELISA检测口蹄疫O型、A型血清抗体均为阴性(ELISA抗体效价不高于1∶8)，3ABC-ELISA检测3ABC血清抗体为阴性的标准。

ID₅₀测定 用体重40kg左右的健康易感架子猪(液相阻断ELISA抗体效价不高于1∶8)12头，分为3组，每组4头。将乳鼠毒称重，用PBS溶液(0.04mol/L，pH值7.6～7.8)稀释、研磨、浸毒，制成1∶10的组织悬液，进行10倍系列稀释，取3个稀释度，每个稀释度分别于耳根后肌肉注射4头猪，每头猪注射3ml。注射后观察10日，凡鼻镜、四蹄任一部位出现口蹄疫特异性水疱或溃疡者判为感染，根据感染猪数按照Reed-Muench法计算ID₅₀。

分组免疫和攻毒 将每个批次疫苗分别分为1头份，1/3头份，1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后深层肌肉注射5头猪，接种后28日，每个剂量组15头。每个攻毒株各设对照2头。免疫后28日第一组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀OZK/93MF6；免疫后28日第二组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀O/MYA98/BY/2010MF8；第三组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀A/GDMM/2013 MF8，对照组用同样毒株攻毒，连续观察10日，具体分组及攻毒情况见表8。对照猪均应至少一蹄出现水疱或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。出现发病猪后要及时进行隔离。

试验结果如表12所示，非免疫对照组猪于攻毒后48小时全部发病，试验对照成立。免疫组猪于攻毒后2～8日陆续发病，发病高峰在第3～5日。结果显示，疫苗使用OZK/93MF6、O/MYA98/BY/2010及A/GDMM/2013进行攻毒后，每头份疫苗PD₅₀在9.00～13.59之间，高于国家质量标准。

表12猪口蹄疫O、A二价疫苗效力检测结果

实施例9：猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗对不同O型、A型口蹄疫毒株的交叉保 护试验

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，试验样品：实施例7中制备获得的含有2700、2800、MM13的猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

试验动物：口蹄疫阴性的健康架子猪，体重约40kg/头，4月龄左右。

试验毒种：攻毒毒株为O/0834 MF11、O/0718 MF8、A/HuBWH/09 MF8，，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

实验猪筛选 利用LpB-ELISA和3ABC-ELISA方法进行阴性猪筛选检测，所筛选出的实验动物应符合LpB-ELISA检测口蹄疫O型、A型血清抗体均为阴性(ELISA抗体效价不高于1∶8)，3ABC-ELISA检测3ABC血清抗体为阴性的标准。

ID₅₀测定 用体重40kg左右的健康易感架子猪(液相阻断ELISA抗体滴度不高于1∶8)12头，分为3组，每组4头。将乳鼠毒称重，用PBS溶液(0.04mol/L，pH值7.6～7.8)稀释、研磨、浸毒，制成1∶10的组织悬液，进行10倍系列稀释，取3个稀释度，每个稀释度分别于耳根后肌肉注射4头猪，每头猪注射3ml。注射后观察10日，凡鼻镜、四蹄任一部位出现口蹄疫特异性水疱或溃疡者判为感染，根据感染猪数按照Reed-Muench法计算ID₅₀。

分组免疫和攻毒 将猪口蹄疫O、A二价疫苗分为1头份，1/3头份，1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别与耳根后深层肌肉注射15头猪，接种后28日，每个剂量组分为3小组，每一小组5头。每个攻毒株各设对照2头。

免疫后28日第一小组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀O/0834MF11；第二小组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀O/0718MF8；第三小组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀A/HuBWH/09MF8对照组用同样毒株攻毒，连续观察10日。对照猪均应至少一蹄出现水疱或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。出现发病猪后要及时进行隔离。

PD₅₀计算方法 根据免疫猪的保护数，按Reed-Muench法计算疫苗PD₅₀。

疫苗免疫期间临床观察结果 猪口蹄疫O、A二价疫苗分别免疫51头试验猪后，和对照组比较，各组猪均未见异常，健康状况良好。结果见表13。

表13猪口蹄疫O、A二价疫苗对不同O型及A型口蹄疫病毒流行毒株交叉攻毒保护结果

实施例10

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 50 V2与实施例1混合抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：

1、水相制备 使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽3、4、8(6309、2800、TT-026)稀释至混合浓度150μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。

2、油相制备 油相佐剂Montanide ISA 50 V2在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。

3、乳化 先将油相加入乳化罐内，然后以80～100r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再以8500r/min搅拌6分钟，使其乳化形成油包水乳剂，这样每头份疫苗含多肽6309、2800、TT-026各25μg，即得本发明的口蹄疫病毒疫苗，记为疫苗猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

实施例11：猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗效力检验试验

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，以实施例10中Montanide ISA 50V2与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；

试验样品：实施例10中制备获得的含有6309、2800、TT-026的混合抗原多肽猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

试验动物：口蹄疫阴性的健康架子猪，体重约40kg/头，4月龄左右。

试验毒种：OZK/93 MF6毒株、O/MYA98/BY/2010 MF8毒株、A/GDMM/2013 MF8毒株强毒，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

实验猪筛选 利用LpB-ELISA和3ABC-ELISA方法进行阴性猪筛选检测，所筛选出的实验动物应符合LpB-ELISA检测口蹄疫O型、A型血清抗体均为阴性(ELISA抗体效价不高于1∶8)，3ABC-ELISA检测3ABC血清抗体为阴性的标准。

ID₅₀测定 用体重40kg左右的健康易感架子猪(液相阻断ELISA抗体效价不高于1∶8)12头，分为3组，每组4头。将乳鼠毒称重，用PBS溶液(0.04mol/L，pH值7.6～7.8)稀释、研磨、浸毒，制成1∶10的组织悬液，进行10倍系列稀释，取3个稀释度，每个稀释度分别于耳根后肌肉注射4头猪，每头猪注射3ml。注射后观察10日，凡鼻镜、四蹄任一部位出现口蹄疫特异性水疱或溃疡者判为感染，根据感染猪数按照Reed-Muench法计算ID₅₀。

分组免疫和攻毒 将每个批次疫苗分别分为1头份，1/3头份，1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后深层肌肉注射5头猪，接种后28日，每个剂量组15头。每个攻毒株各设对照2头。免疫后28日第一组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀OZK/93 MF6；免疫后28日第二组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀O/MYA98/BY/2010 MF8；第三组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀A/GDMM/2013 MF8，对照组用同样毒株攻毒，连续观察10日，具体分组及攻毒情况见表14。对照猪均应至少一蹄出现水疱或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。出现发病猪后要及时进行隔离。

试验结果将表14.非免疫对照组猪于攻毒后48小时全部发病，试验对照成立。免疫组猪于攻毒后2～8日陆续发病，发病高峰在第3～5日。结果显示，疫苗使用OZK/93MF6、O/MYA98/BY/2010及A/GDMM/2013进行攻毒后，每头份疫苗PD₅₀在7.05～11.84之间，高于国家质量标准。

表14猪口蹄疫O、A二价疫苗效力检测结果

实施例12

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 50 V2与实施例1混合抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：

1、水相制备 使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽3、5、9(6309、7312、TT-027)稀释至混合浓度150μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。

2、油相制备 油相佐剂Montanide ISA 50 V2在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。

3、乳化 先将油相加入乳化罐内，然后以80～100r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再以8500r/min搅拌6分钟，使其乳化形成油包水乳剂，这样每头份疫苗含多肽6309、7312、TT-027各25μg，即得本发明的口蹄疫病毒疫苗，记为疫苗猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

实施例13：猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗效力检验试验

一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，以实施例10中Montanide ISA50V2与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；

试验样品：实施例12中制备获得的含有6309、7312、TT-027的混合抗原多肽猪口蹄疫O型、A型二价疫苗。

试验动物：口蹄疫阴性的健康架子猪，体重约40kg/头，4月龄左右。

试验毒种：OZK/93 MF6毒株、O/MYA98/BY/2010 MF8毒株、A/GDMM/2013 MF8毒株强毒，均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

实验猪筛选 利用LpB-ELISA和3ABC-ELISA方法进行阴性猪筛选检测，所筛选出的实验动物应符合LpB-ELISA检测口蹄疫O型、A型血清抗体均为阴性(ELISA抗体效价不高于1∶8)，3ABC-ELISA检测3ABC血清抗体为阴性的标准。

ID₅₀测定 用体重40kg左右的健康易感架子猪(液相阻断ELISA抗体效价不高于1∶8)12头，分为3组，每组4头。将乳鼠毒称重，用PBS溶液(0.04mol/L，pH值7.6～7.8)稀释、研磨、浸毒，制成1∶10的组织悬液，进行10倍系列稀释，取3个稀释度，每个稀释度分别于耳根后肌肉注射4头猪，每头猪注射3ml。注射后观察10日，凡鼻镜、四蹄任一部位出现口蹄疫特异性水疱或溃疡者判为感染，根据感染猪数按照Reed-Muench法计算ID₅₀。

分组免疫和攻毒 将每个批次疫苗分别分为1头份，1/3头份，1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后深层肌肉注射5头猪，接种后28日，每个剂量组15头。每个攻毒株各设对照2头。免疫后28日第一组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀OZK/93 MF6；免疫后28日第二组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀O/MYA98/BY/2010 MF8；第三组每头猪耳根后肌肉注射1000ID₅₀A/GDMM/2013 MF8，对照组用同样毒株攻毒，连续观察10日，具体分组及攻毒情况见表15。对照猪均应至少一蹄出现水疱或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。出现发病猪后要及时进行隔离。

试验结果将表15.非免疫对照组猪于攻毒后48小时全部发病，试验对照成立。免疫组猪于攻毒后2～8日陆续发病，发病高峰在第3～5日。结果显示，疫苗使用OZK/93MF6、O/MYA98/BY/2010及A/GDMM/2013进行攻毒后，每头份疫苗PD₅₀在7.05～9.00之间，高于国家质量标准。

表15猪口蹄疫O、A二价疫苗效力检测结果

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 申联生物医药（上海）股份有限公司

<120> 猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用

<130> DD09172

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ile Phe

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Ile Ser Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys His Ile Glu Gly

1 5 10 15

Ile Phe Leu Leu

20

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val

1 5 10 15

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Cys Leu Pro

20 25 30

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys

35 40

<210> 5

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val

1 5 10 15

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro

20 25 30

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys

35 40

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Tyr Ser Gly Cys Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly

1 5 10 15

Asp Ser Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Cys Ser

20 25 30

Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile

35 40

Claims (10)

1.一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，包括T细胞辅助表位混合多肽、口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。

2.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述串联的方法具体包括将T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少一个赖氨酸相连接。

3.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述T细胞辅助表位混合多肽的T细胞辅助表位来源于高抗原性麻疹病毒融合蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原，并经过人工组合突变改造优化所得。

4.根据权利要求3所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述T细胞辅助表位混合多肽包括Th1、Th2、Th3中的一种；

Th1的序列为：GILES/T(1:1)R/K(1:1)GIK/R(1:1)AR/K(1:1)IT/G(1:1)H/R(1:1)TELIF；

Th2的序列为：ISIS/T(1:1)EIG/R(1:1)K/T(1:1)VIVK/R(1:1)H/T(1:1)IEG/T(1:1)IFLL；

Th3的序列为LSEIKGVIVHRLEGV。

5.根据权利要求1所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述口蹄疫毒株包括O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒；

所述O型口蹄疫病毒包括OZK/93和O/MYA98/BY/2010口蹄疫病毒毒株；所述A型口蹄疫病毒包括A/GDMM/2013口蹄疫病毒毒株。

6.根据权利要求5所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列为VYNGSCKYSDARVSNVRGDLQVLAQKAERCLPTSFNYGAIK；所述OZK/93相关的B细胞抗原表位序列的158位C与134位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

7.根据权利要求5所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述O/MYA98/BY/2010相关的B细胞抗原表位序列为VYNGNCKYAGGSLTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK；所述O/MYA98/BY/2010相关的B细胞抗原表位序列的158位C与134位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

8.根据权利要求5所述的猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗，其特征在于，所述A/GDMM/2013相关的B细胞抗原表位序列为VYSGCSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPCSFNFGAIRATEI，所述A/GDMM/2013相关的B细胞抗原表位序列的159位C与133位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。

9.一种根据权利要求1-8所述的任意一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、在固相载体上用化学合成的方法合成B细胞抗原表位多肽，然后继续连接至少一个赖氨酸，然后在多肽的最N端赖氨酸的ε-氨基上连接T细胞辅助表位混合多肽，T细胞表位中涉及到的双氨基酸位点的两个氨基酸以相同摩尔比投料，采用二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合从而保证产物中双氨基酸占比各占50％，最终得到连接在固相载体上的T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽；

B、通过混合有机酸液将串联多肽从固相载体上切除下来，以醚类沉淀，洗涤得到T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品；所述混合有机酸液包括三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯酚、水；所述醚类包括乙醚、叔丁基甲醚；

C、通过DMSO氧化T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品上的氨基酸巯基环化形成分子内的二硫键，并以Ellman’s试剂检测巯基的残余量；

D、环化结束后，通过阳离子交换树脂去除溶液中的有机酸，收集流出液；

E、通过切向流膜包系统浓缩流出液，并去除串联多肽中的小分子杂质；

F、浓缩液通过0.22um的滤芯过滤除菌；

G、在一定剪切力下，将无菌液与油佐剂混合形成乳液，装瓶，贴签形成疫苗。

10.一种根据权利要求1-8所述的任意一种猪口蹄疫O型和A型二价合成肽疫苗的应用，其特征在于，用于制备预防和治疗O型和A型口蹄疫的制剂或用于制备区分感染动物和被免疫动物的制剂的应用。

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