CN104277097A - 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法 - Google Patents

固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104277097A
CN104277097A CN201410568334.9A CN201410568334A CN104277097A CN 104277097 A CN104277097 A CN 104277097A CN 201410568334 A CN201410568334 A CN 201410568334A CN 104277097 A CN104277097 A CN 104277097A
Authority
CN
China
Prior art keywords
resin
peptide
seq
reagent
fluorenylmethyloxycarbonyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410568334.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104277097B (zh
Inventor
张震
姬明放
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shen Lian Biological Medicine (shanghai) Co Ltd
Original Assignee
Shen Lian Biological Medicine (shanghai) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shen Lian Biological Medicine (shanghai) Co Ltd filed Critical Shen Lian Biological Medicine (shanghai) Co Ltd
Priority to CN201410568334.9A priority Critical patent/CN104277097B/zh
Publication of CN104277097A publication Critical patent/CN104277097A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104277097B publication Critical patent/CN104277097B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，以树脂为起始原料，依次连接具有9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，制备保护的肽段片段，期间依次脱去Fmoc基团，用缩合剂进行接肽反应，以稀酸或弱酸切断得到保护的肽段片段；将片段逐步连接上4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基类树脂，再与T辅助细胞表位连接；以浓酸或强酸切除保护基团及树脂，得到合成肽抗原2700粗肽；经过离子交换树脂以及切向流膜包系统纯化、浓缩系统去除小分子及盐后得到合成肽抗原2700。本发明的方法具有工艺稳定、生产周期短、原辅料来源方便、三废少、生产成本低、收率高等特点。

Description

固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法
技术领域
本发明涉及到一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法。
背景技术
猪O型口蹄疫合成肽抗原2700结构式如下：
猪口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。近年来，口蹄疫在我国的江苏，四川，东北三省，内蒙古大面积的爆发，造成了巨大的经济损失。目前，免疫接种仍然是控制该病的主要手段。传统的灭活疫苗仍然是国内外口蹄疫防治的主导方法，但容易引发过敏等副反应，而且还有生物安全方面的问题。因此国内外对新疫苗进行了大量的研究，近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，口蹄疫病毒(FMD)基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。但这些新技术疫苗都只针对口蹄疫抗原蛋白的一级结构，同时对细胞免疫考虑不足，使其不能对口蹄疫病毒这样依赖于抗原空间结果和T细胞苗裔的病毒产生良好的免疫效果。
VP1是口蹄疫病毒的四种结构蛋白之一。VP1氨基酸序列中包含129～169位氨基酸的多肽最具免疫效力。结合国家口蹄疫参考实验室和英国Pirbright世界口蹄疫参考实验室所提供的口蹄疫氨基酸序列数据库，我们对所得到的O型口蹄疫病毒各拓扑型的VP1序列(129～169)逐一比较。免疫试验结果表明，所有VP1都具有相同的免疫效力。多肽抗原2700是依据OZK/93毒株设计，OZK/93归属于老猪毒，为我国最近10多年来猪O型口蹄疫疫苗的经典制苗毒株。该毒株抗原谱广，对细胞、本动物适应性好，为疫苗毒株的优秀代表。同时为了使设计的疫苗适用于大、中型动物，在VP1序列(129～169)上结合T细胞辅助表位(T-helper)结构形成猪O型口蹄疫2700多肽抗原。
T辅助细胞表位(T-helper)是指一抗原上供T辅助细胞识别的氨基酸序列。T辅助细胞是指一类特定的T细胞，其作用是辅助T杀伤细胞从而使T杀伤细胞与目标抗原或细胞结合而消灭或杀死该目标抗原或细胞。T辅助细胞表位的实例包括但不限于，乙肝病毒表面和核心抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T辅助细胞表位、镰状疟原虫环孢子体T辅助细胞表位、曼森氏吸虫三糖磷酸盐异构酶T辅助细胞表位，及大肠杆菌TraT T辅助细胞表位。在猪O型口蹄疫2700多肽抗原的设计中最常用的是基于麻疹病毒的T辅助细胞表位。
通常在合成肽疫苗生产过程中，生产周期最长的是2700多肽抗原的合成，目前国内合成肽疫苗生产企业均采用二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基-1H苯并三唑(HOBt)作为缩合剂，起始采用Rink amide MBHA树脂，采用Fmoc/tBu策略通过固相线性逐一缩合法最终得到目的抗原，尽管此种方法较液相合成有诸多优点，但是其在所有合成步骤中都存在不可逆副反应的风险，每个重复的合成循环中，反应不完全造成了错误序列和不完全的核心序列。假设每一个循环的产率为99.0％，10个循环以后的最高产率是90.4％，50个循环后混合物中则只有60.5％的产品。假如每一个循环的产率为95.0％，10个循环以后的最高产率是59.9％，50个循环后混合物中则只有7.69％的产品。在过去数年内尽管对大部分可能的副反应及其机制进行了大量的研究，但是，单步循环的产率还是达不到99.5％以上，每一步剩余的0.5％累积为污染产品的副产物。因此，目标肽很容易被一系列结构和化学性质类似的化合物污染，如差向异构形成的非对应异构体、错误序列和不完全的核心序列等。
近年来，随着国际国内多肽药物行业的发展，出现了大量新的合成技术以及新的缩合剂，用固相法合成大的保护片段，然后继之以固相法组装，此种方法被称为固相片段缩合法。例如，如果每一个肽键的形成得率为80％，一个逐步缩合的8肽的总得率为21％，而用片段缩合策略，将4个二肽成对缩合为2个四肽，最终组装成目标8肽，总得率可达51％。虽然固相片段缩合策略有时会受到消旋、片段溶解性及低缩合得率的影响，但是，其在合成保护基和缩合方法的选择上有更大的灵活性。所以，对目标序列进行合理的分段能大大改善结果。如为了消除或减少消旋，以甘氨酸(Gly)或脯氨酸(Pro)作为保护的肽片段的C末端残基，或使用脲鎓盐(如2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)等)或磷鎓盐(如苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBroP)等)类型的缩合试剂都是有利的措施。
所以，合理的选择和优化合成多肽片段为生产复杂序列开辟了一种新的途径。虽然此种方法在合成肽抗原中还没有得到广泛应用，但它在商业规模的其他大肽生产方面显示了广阔的前景。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其充分利用抗原肽段中含有较多的甘氨酸(Gly)或脯氨酸(Pro)的特点，合理的进行多肽片段的设计合成，以克服固相线性逐一缩合法技术存在的抗原生产时程长、风险大、消旋性等问题，显著提高合成效果。
本发明是通过以下方案实现的：
以2-氯-3-苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl resin)、三苯甲基醇树脂(TGT alcohol resin)或4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂(HMPB-AM resin)为起始原料，依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，制备保护的肽段片段，期间依次脱去Fmoc基团，用缩合剂进行接肽反应，以稀酸或弱酸溶液切断得到保护的肽段片段。之后将片段逐步连接上4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基类树脂(如Rink amide MBHA resin或Rink amide AM resin)后连接全保护的T-helper，以浓酸或强酸切除保护基团及树脂，得到合成抗原肽2700粗品。
本发明提供一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，所述方法包括如下步骤(如图1所示)：
步骤1、将2-氯-3-苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl resin)、三苯甲基醇树脂(如TGT alcohol resin)或4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂(HMPB-AM resin)置于二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中10～120min，充分溶胀，所得溶胀树脂溶液中树脂的浓度为0.05～0.2g/ml；
步骤2、向步骤1所得溶胀树脂溶液中加入9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸与二异丙基乙基胺(DIEA)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸与缩合剂，于10～45℃反应15～60min；抽干，加入封闭试剂反应15～30min以封闭未反应的基团，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸上的9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，洗涤后加入接肽试剂进行接肽反应得肽树脂链，具体为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5，即Fmoc-SEQ ID No:3-树脂，Fmoc-SEQ ID No:4-树脂，Fmoc-SEQID No:5-树脂；
SEQ ID No:3Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro；
SEQ ID No:4Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly；
SEQ ID No:5Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly；
步骤3、将步骤2所得肽树脂链加入到稀酸或弱酸溶液中，于10～45℃反应60～90min，加入2,4,6-三甲基吡啶(TMP)或二异丙基乙基胺(DIEA)中和，过滤；滤液浓缩，加入醇类、醚类或烷类析出溶剂析出保护肽固体，过滤收集滤饼真空干燥得到肽段，具体为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5，即Fmoc-SEQ ID No:3、Fmoc-SEQ ID No:4、Fmoc-SEQ ID No:5；
步骤4、将4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基类树脂置于二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中30～60min，充分溶胀，溶胀树脂溶液中树脂的重量体积浓度为0.05～0.2g/ml；所述4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基类树脂如Rink amide MBHA resin、Rink amide AM resin等；
步骤5、在步骤4所得溶胀树脂中加入脱除试剂，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤数次，加入9-芴甲氧羰基保护基(Fmoc)保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的接肽试剂全溶物连接第一个氨基酸到树脂上，于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤树脂数次，加入脱除试剂进行脱除反应脱除9-芴甲氧羰基，用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤后，加入9-芴甲氧羰基保护基(Fmoc)保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的接肽试剂进行接肽反应，得到肽树脂，具体为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2，即Fmoc-SEQ ID No:2-树脂；所述树脂为Rink amide MBHA resin或Rink amide AM resin树脂。
SEQ ID No:2Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)；
步骤6、将肽树脂用溶胀剂充分溶胀后，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤数次，再依次加入氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)全溶物；于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，每加入一个肽段都要用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除保护基，得全保护肽树脂，具体为羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的氨基酸序列，即SEQ ID No:5-SEQ ID No:4-SEQ ID No:3-SEQ ID No:2-树脂：
H-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-树脂。
步骤7、向步骤6所得全保护肽树脂中加入T辅助细胞表位(T-helper)、缩合剂的全溶物，于10～45℃反应0.5～6.0h，抽干，依次以二氯甲烷(DCM)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、甲醇(MeOH)洗涤树脂数次得到全保护的抗原肽2700树脂，具体为氨基端经T辅助细胞表位修饰、羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的氨基酸序列，即T-helper-SEQ ID No:5-SEQ ID No:4-SEQ ID No:3-SEQ ID No:2-树脂：
T-helper-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-树脂；所述树脂为Rink amide MBHA resin或Rink amide AM resin树脂。
步骤8、将预冷的-10～10℃的切断液加入到步骤7的抗原2700肽树脂中切除所有保护基团及树脂载体，于10～45℃反应1～4h，过滤，浓缩滤液后加入甲基叔丁基醚(MTBE)析出沉淀，用甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤沉淀数次后干燥得到未环化的抗原肽2700粗品：氨基端经T辅助细胞(T-helper)表位修饰的SEQ ID No:1；
SEQ ID No:1Val-Tyr-Asn-Gly-Ser-Cys-Lys-Tyr-Ser-Asp-Ala-Arg-Val-Ser-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala-Gln-Lys-Ala-Glu-Arg-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys-NH2。
步骤9、将步骤8所得抗原肽2700粗品溶于二甲亚砜(DMSO)溶液，调节pH值至6.0～8.0的条件下进行完全环化，即得环化的合成肽抗原2700，即环化的氨基端经T辅助细胞(T-helper)表位修饰的SEQ ID No:1：
T-helper-Val-Tyr-Asn-Gly-Ser-[Cys-Lys-Tyr-Ser-Asp-Ala-Arg-Val-Ser-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala-Gln-Lys-Ala-Glu-Arg-Cys]-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys-NH2；SEQ ID No:1的6位Cys和30位Cys形成二硫键。
优选地，步骤2中，所述9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸包括Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH；所述9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～3倍。
优选地，步骤2中，二异丙基乙基胺(DIEA)的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～7.5倍。
优选地，步骤2中，所述的缩合剂包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)中的一种；所述缩合剂的摩尔量是溶胀树脂溶液中树脂的1～5倍。
优选地，步骤2中，所述封闭试剂为体积比为5:4:1的二氯甲烷(DCM)、甲醇(MeOH)、二异丙基乙基胺(DIEA)混合溶液或9:1的甲醇(MeOH)、二异丙基乙基胺(DIEA)混合溶液。
优选地，步骤2中，所述脱除试剂为六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合溶液，二者的体积比为1:2～10；所述脱除试剂加入溶胀树脂溶液后的浓度为5～15ml/g；所述脱除试剂的反应温度为0～45℃，时间为10～60min。
优选地，步骤2中，所述接肽试剂为9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)全溶物或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)全溶物；所述接肽试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；所述接肽试剂接肽反应温度为10～45℃，时间为0.5～3h。
优选地，步骤3中，所述稀酸或弱酸溶液包括三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)、三氟乙醇(TFE)和二氯甲烷(DCM)混合溶液、乙酸(AcOH)和甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)混合溶液中的一种；所述三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)混合溶液中三氟乙酸(TFA)体积比例为0.5～5％；所述三氟乙醇(TFE)和二氯甲烷(DCM)混合溶液中三氟乙醇(TFE)体积比例为10～50％；所述乙酸(AcOH)和甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)混合溶液中乙酸(AcOH)体积比例5～20％，DCM不少于50％；所述稀酸或弱酸溶液与肽树脂的用量比为6～20ml/g。
优选地，步骤3中，所述中和稀酸或弱酸溶液用的2,4,6-三甲基吡啶(TMP)或二异丙基乙基胺(DIEA)与稀酸或弱酸的摩尔比为1～2.5。
优选地，步骤3中，所述醇类包括甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、异丙醇(IPA)等；所述醚类包括乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、石油醚等；所述烷类包括正己烷、正庚烷等。
优选地，步骤5中接肽试剂为9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺(DIEA)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的全溶物；所述二异丙基乙基胺(DIEA)的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的2.25～7.5倍；所述接肽试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；接肽反应温度为10～45℃，时间为0.5～3h。
优选地，步骤5中，所述9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸包括Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；所述9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～3倍。
优选地，步骤5中，所述缩合剂包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)中的一种；所述缩合试剂的摩尔量是溶胀树脂溶液中树脂的1～5倍。
优选地，步骤5中，所述脱除试剂包括六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合液，二者体积比为1:(2～10)；所述脱除试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；所述脱除试剂的反应温度为0～45℃，时间为10～60min。
优选地，步骤6中，所述溶胀剂包括二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的一种或几种的混合物。
优选地，步骤6中，所述氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3、氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4、氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5的摩尔数均为肽树脂的1～1.5倍。
优选地，步骤6中，所述缩合剂包括二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基-1H苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑(HOAt)中的一个组合，或2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)中的一种；所述缩合剂的摩尔量是肽树脂的1～5倍。
优选地，步骤6中，所述二异丙基乙基胺(DIEA)的摩尔数为肽树脂的1.5～7.5倍。
优选地，步骤7中，所述T-helper的摩尔数为全保护肽树脂的1.0～2.0倍；
优选地，步骤7中，所述缩合剂包括二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基-1H苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑(HOAt)中的一个组合；所述缩合剂的摩尔量是全保护肽树脂的1～5倍。
优选地，步骤8中，所述切断液试剂为三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):苯酚(Phenol):水质量比为90:5:4:1的混合物；所述切断液与抗原肽2700树脂的用量比为5～50ml/g。
优选地，步骤9中，二甲亚砜水溶液中二甲亚砜的体积分数为5～15％。
优选地，步骤9中，调节pH用氨水、乙酸；所述氨水溶液的浓度为0.5～5％；所述乙酸溶液浓度为0.5～5％；所述百分数表示体积比。
本步骤测定抗原肽溶液环化度的方法为标准的Ellman方法；所说的环化完全认为是环化度大于等于92.5％为止。
为提高所得抗原肽2700的纯度，本发明制备方法还包括使用强碱性阴离子交换树脂对环化抗原肽2700进行脱盐处理；使用正切向流超滤系统在适宜温度下对环化多肽进行超滤；高效液相(HPLC)测得合成肽抗原2700的纯度；所述正切向流超滤系统为PallCentrasette，所述正切向流超滤系统用膜为Omega系列膜；
所述强碱性阴离子交换树脂包括AG 1、AG 2、AG MP-1等氯型树脂；所述超滤使用的膜包为Omega 1KD到Omega 3KD超滤膜包；所述适宜的温度为20～28℃；所述高效液相分析方法为吸收波长：226nm；流动相A:0.05％TFA/H2O；流动相B:0.05％TFA/ACN；流动相梯度：0～30min 5～58％B；30～35min 58～95％B。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)具备规模化生产能力、工艺稳定、生产周期短、质量稳定、生产成本低、收率高等特点；
(2)采用片段法合成肽段，然后肽段再连接成目的抗原，大大规避了目前工艺中的逐一连接61个氨基酸的接错风险，并使抗原生产的整个工艺周期由原来的45天左右缩短为30天左右，提高了车间的产能；
(3)本发明方法使用如脲鎓盐(如2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)等)或磷鎓盐(如苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐(PyBroP)等)类型的缩合试剂，缩短了每个氨基酸的缩合时间，提高了合成效率；并且以甘氨酸(Gly)或脯氨酸(Pro)作为保护的肽片段的C末端残基，有效减少甚至避免了消旋性问题；
(4)本发明采用对肽树脂有良好溶胀性、对片段有良好溶解性的二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)为溶剂，大大改善了O型口蹄疫合成肽抗原2700的合成效果，缩短了抗原的生产周期、提高产品收率至79.7％。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施过程中采用的原物料列表如下：
实施例1
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3的制备，包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Pro-2-chlorotrityl树脂
称取2-chlorotrityl树脂100g(100～200目，1.1mmol/g，110mmol)装入EST-50多肽合成仪内，以1L的DCM溶胀30min，滤干，加入1L溶解37.1g的Fmoc-Pro-OH(110mmol，1.0eq)和14.2g的DIEA(18.7ml,110mmol)的DCM溶液，20～25℃反应60min。滤干，加入1L的MeOH/DIEA(9:1)溶液进行封闭反应30min，滤干后树脂依次以NMP、MeOH、NMP各洗涤数次，抽干，得到Fmoc-Pro-2-chlorotrityl树脂。取少量树脂以MeOH洗涤数次后以脱除Fmoc法测定载量，测定载量为0.70mmol/g。
(2)制备Fmoc-Leu-Pro-2-chlorotrityl树脂
在步骤(1)树脂中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，以NMP洗涤数次，每次均滤干。加入44.5g的Fmoc-Leu-OH(126mmol)、65.6g的PyBOP(126mmol)、24.4g的DIEA(189mmol)，以1L的NMP溶解上述混合物，20～25℃反应60min。以NMP洗涤树脂数次，每次均滤干，得到Fmoc-Leu-Pro-2-chlorotrityl树脂。
(3)制备Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-2-chlorotrityl树脂
与步骤(2)类似操作，树脂中加入20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，依次加入Fmoc-AA-OH(126mmol)、PyBOP(126mmol)、DIEA(189mmol)的NMP溶液进行氨基酸缩合反应，每个氨基酸缩合之后以NMP洗涤树脂数次，再以20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应进行，依次类推，最终得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-2-chlorotrityl树脂，以MeOH洗涤数次后干燥，得到315g肽树脂固体。
(4)制备氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3
称取步骤(3)中肽树脂315g，加入配制的1％TFA/DCM溶液3.2L，室温(20～25℃)搅拌下反应90min。滴加入DIEA中和反应液至pH7～7.5。过滤，滤液浓缩至700ml，加入1.0L异丙醇后继续浓缩去除DCM至体积800ml，有大量白色沉淀析出，室温(20～25℃)低速搅拌2～3h使沉淀完全。过滤，滤饼以(-20℃)预冷异丙醇洗涤3次后干燥，得200.5g白色固体,通过HPLC分析纯度94.7％，MS分析分子量为2995.51(理论分子量为2997.69)，确定为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3，即Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-OH。
实施例2
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4的制备，包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂
称取2-chlorotrityl树脂100g(100～200目，1.1mmol/g，110mmol)装入EST-50多肽合成仪内，以1L的DCM溶胀30min，滤干，加入1L溶解32.7g的Fmoc-Gly-OH(110mmol)和14.2g的DIEA(18.7ml,110mmol)的DCM溶液，20～25℃反应60min。滤干，加入1L的MeOH/DIEA(9:1)溶液进行封头反应30min，滤干后树脂依次以NMP、MeOH、NMP各洗涤数次，抽干，得到Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂。取少量树脂以MeOH洗涤数次后以脱除Fmoc法测定载量，测定载量为0.65mmol/g。
(2)制备Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂
在步骤(1)树脂中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，以NMP洗涤数次，每次均滤干。加入73.0g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(112.5mmol)、58.5g的PyBOP(112.5mmol)、21.8g的DIEA(168.75mmol)，以1L的NMP溶解上述混合物，20～25℃反应60min。以NMP洗涤树脂数次，每次均滤干，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
(3)制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂
与步骤(2)类似操作，树脂中加入20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，依次加入Fmoc-AA-OH(112.5mmol)、PyBOP(112.5mmol)、DIEA(168.75mmol)的NMP溶液进行氨基酸缩合反应，每个氨基酸缩合之后以NMP洗涤树脂数次，再以20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应进行，依次类推，最终得到Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂，以MeOH洗涤数次后干燥，得到320g肽树脂固体。
(4)制备氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4
称取步骤(3)中肽树脂320g，加入配制的1％TFA/DCM溶液3.2L，室温(20-25℃)搅拌下反应90min。滴加入DIEA中和反应液至pH7～7.5。过滤，滤液浓缩至800ml，加入1.0L乙醇后继续浓缩去除DCM至体积800ml，有大量白色沉淀析出，室温(20～25℃)低速搅拌2～3h使沉淀完全。过滤，滤饼以(-20℃)预冷乙醇洗涤3次后干燥，得180g白色固体,通过HPLC分析纯度95.1％，MS分析分子量为3131.56(理论分子量为3133.86)，确定为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4，即Fmoc-SEQ ID No:4：Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH。
实施例3
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5的制备，包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂
称取2-chlorotrityl树脂100g(100-200目，1.1mmol/g，110mmol)装入EST-50多肽合成仪内，以1L的DCM溶胀30min，滤干，加入1L溶解49.1g的Fmoc-Gly-OH(165mmol)和14.2g的DIEA(21.3ml,165mmol)的DCM溶液，20～25℃反应60min。滤干，加入1L的MeOH/DIEA(9:1)溶液进行封头反应30min，滤干后树脂依次以NMP、MeOH、NMP各洗涤数次，抽干，得到Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂。取少量树脂以MeOH洗涤数次后以脱除Fmoc法测定载量，测定载量为0.80mmol/g。
(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Gly-2-chlorotrityl树脂
在步骤(1)树脂中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，以NMP洗涤数次，每次均滤干。加入89.5g的Fmoc-Asn(Trt)-OH(150mmol)、78.1g的PyBOP(150mmol)、29.1g的DIEA(225mmol)，以1L的NMP溶解上述混合物，20～25℃反应60min。以NMP洗涤树脂数次，每次均滤干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
(3)制备Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-2-chlorotrityl树脂
与步骤(2)类似操作，树脂中加入20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，依次加入Fmoc-AA-OH(150mmol)、PyBOP(150mmol)、DIEA(225mmol)的NMP溶液进行氨基酸缩合反应，每个氨基酸缩合之后以NMP洗涤树脂数次，再以20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应进行，依次类推，最终得到的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-2-chlorotrityl树脂，以MeOH洗涤数次后干燥，得到180g肽树脂固体。
(4)制备氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5
称取步骤(3)中肽树脂180g，加入配制的1％TFA/DCM溶液1.8L，室温(20～25℃)搅拌下反应90min。滴加入DIEA中和反应液至pH7～7.5。过滤，滤液浓缩至300ml，加入600ml异丙醇后继续浓缩去除DCM至体积400ml，然后加入2L的MTBE有大量白色沉淀析出，室温(20～25℃)低速搅拌2～3h使沉淀完全。过滤，滤饼以MTBE洗涤3次后干燥，得70g白色固体,通过HPLC分析纯度98.9％，MS分析分子量为971.45(理论分子量为972.13)，确定为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5，即Fmoc-SEQ ID No:5：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-OH。
实施例4
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2的制备，包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂
称取100g Rink amide MBHA树脂(100～200目，0.4mmol/g，40mmol)装入EST-50多肽合成仪内，以1L的NMP溶胀60min，滤干，加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解28.1g的Fmoc-Lys(Boc)-OH(60mmol)、31.2g的PyBOP(60mmol)、11.6g的DIEA(90mmol)的NMP溶液，20～25℃反应60min。滤干，树脂以NMP洗涤数次得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink amideMBHA树脂。
(2)制备Fmoc-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂
上述步骤1中Fmoc-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂，加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解21.2g的Fmoc-Ile-OH(60mmol)、31.2g的PyBOP(60mmol)、11.6g的DIEA(90mmol)的NMP溶液，20～25℃反应60min。滤干，树脂以NMP洗涤数次得到Fmoc-Ile-Lys(Boc)-Rinkamide MBHA树脂。
(3)制备氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2
与步骤2类似操作，树脂中加入20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，依次加入Fmoc-AA-OH(60mmol)、PyBOP(60mmol)、DIEA(90mmol)的NMP溶液进行氨基酸缩合反应，每个氨基酸缩合之后以NMP洗涤树脂数次，再以20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应进行，依次类推，最终得到的氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2，即Fmoc-SEQ ID No:2-树脂：Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。
实施例5
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的依次包括SEQ IDNo:3、SEQ ID No:2的制备，包括如下步骤：
在实施例4的步骤(3)Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂(32～48mmol)中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解143.9g的Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-OH(48mmol)、18.2g的HATU(48mmol)、9.3g的DIEA(72mmol)的NMP溶液，20～25℃反应2.5h，滤干，树脂以NMP洗涤数次得Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amideMBHA树脂。取少量树脂以浓TFA混合物切断，通过LC-MS确认为产物氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的依次包括SEQ ID No:3、SEQ ID No:2，即Fmoc-SEQID No:3-SEQ ID No:2-树脂：Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。
实施例6
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的以次包括SEQ IDNo:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2序列的制备，包括如下步骤：
在实施例5的Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂(32～48mmol)中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解150.4g的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH(48mmol)、18.2g的HATU(48mmol)、9.3g的DIEA(72mmol)的NMP溶液，20～25℃反应2.5h，滤干，树脂以NMP洗涤数次得到Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。取少量树脂以浓TFA混合物切断，通过LC-MS确认为产物为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的以次包括SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2序列，即Fmoc-SEQ ID No:4-SEQ ID No:3-SEQ ID No:2-树脂：Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂的制备。
实施例7
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的以次包括SEQ IDNo:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2序列的制备，包括如下步骤：
在实施例6的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂(32～48mmol)中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解46.7g的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-OH(48mmol)、18.2g的HATU(48mmol)、9.3g的DIEA(72mmol)的NMP溶液，20～25℃反应2.5h，滤干，树脂以NMP洗涤数次得到Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)
-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。取少量树脂以浓TFA混合物切断，通过LC-MS确认为产物为氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的以次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2序列，即Fmoc-SEQ IDNo:5-SEQ ID No:4-SEQ ID No:3-SEQ ID No:2-树脂：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。
实施例8
本实施例涉及氨基端经T辅助细胞表位(T-helper)修饰、羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2序列的制备，包括如下步骤：
在实施例7的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-
Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂(24～48mmol)中加入1L的20％哌啶/NMP进行脱除Fmoc反应，20～25℃反应30min，滤干，树脂以NMP洗涤数次。加入1L溶解148.8g的T-helper(48mmol)、6.1g的DIC(48mmol)、9.8g的HOAt(72mmol)的NMP溶液，20～25℃反应6.0h，滤干，树脂以NMP洗涤数次得到氨基端经T辅助细胞表位(T-helper)修饰、羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:6、SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:3和SEQ ID No:2，即T-Helper-SEQ ID No:5-SEQ ID No:4-SEQ ID No:3-SEQ IDNo:2-树脂：T-Helper-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)-Rink amide MBHA树脂。树脂再以MeOH洗涤数次，以氮气吹扫过夜后干燥得肽树脂419.3g，收率92.9％。
实施例9
本实施例涉及氨基端经T辅助细胞表位(T-helper)修饰的SEQ ID No:1序列的制备，包括如下步骤：
将4.2L预冷的-10～10℃的TFA:TIS:Phenol:H2O(90:5:4:1)混合液加入实施例8的419gT-Helper-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gln(Trt)-Val-Leu-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Leu-Pro-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Ala-Ile-Lys(Boc)--Rink amide MBHA树脂中，10～25℃反应4.0h，过滤，滤液浓缩至约1.5L，加入4.5L的MTBE析出产物，室温(20～25℃)搅拌2～3h使析出完全。过滤，滤饼以MTBE洗涤数次后干燥得2700粗肽215.8g，收率79.7％。取少量固体通过LC-MS测定分子量为6767.6(理论Mw.6769.17)确认为2700产物氨基端经T辅助细胞表位(T-helper)修饰的SEQ ID No:1，即T-helper-SEQ ID No:1，T-Helper-Val-Tyr-Asn-Gly-Ser-Cys-Lys-Tyr-Ser-Asp-Ala-Arg-Val-Ser-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala-Gln-Lys-Ala-Glu-Arg-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys-NH2的制备。
实施例10
本实施例涉及制备合成肽抗原2700抗原液。
(1)抗原多肽2700的环化
将实施例9的2700粗肽用10％二甲亚砜(DMSO)水溶液配置成浓度为2mg/ml的溶液，并用磁力搅拌器在室温下搅拌均匀。然后用1％的氨水溶液或者1％乙酸溶液将多肽溶液调节至pH值约6.0～8.0。每隔24小时测定pH值1次，并根据情况调节pH使其始终维持在约6.0～8.0。连续环化反应192小时后中止反应，并收集反应产物，即得环化多肽。用标准的Ellman方法测定抗原多肽2700的环化度均大于等于92.5％。
(2)抗原多肽2700的脱盐及纯化
使用强碱性阴离子交换树脂对环化抗原多肽2700进行脱盐处理。使用PallCentrasette正切向流超滤系统及Omega系列膜包(膜包分子量3000Da)在20～28℃条件下对环化多肽进行超滤浓缩纯化。并以高效液相(HPLC)测得抗原多肽2700的纯度。HPLC分析条件为：仪器型号：Waters1525/2707/2998；谱柱：Vydac C185μm 4.6×100mm；吸收波长：226nm；动相A:0.05％TFA/H2O；流动相B:0.05％TFA/ACN；流动相梯度：0～30min 5～58％B；0～35min 58～95％B。
(3)抗原多肽2700的除菌
抗原多肽2700经纯化处理后再在净化工作台内，使用孔径为0.2μm的囊式滤器无菌过滤后分装到无菌塑料瓶内，取样测定浓度，贴签，置-20℃以下保存备用。
实施例11
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3的制备，技术方案与实施例1相同，不同之处仅在于：
肽链延长时，树脂为三苯甲基醇树脂，所得溶胀树脂中树脂的浓度为0.05g/ml；Fmoc保护的氨基酸的摩尔数是树脂的1.5倍；DIEA的摩尔数是树脂的3倍；封闭试剂为DCM/MeOH/DIEA(5:4:1)并且反应15min；缩合剂为2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)，缩合剂的摩尔数是树脂的2倍；脱除试剂为六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)体积比为1:2的混合物；脱除试剂反应的温度为0～5℃，反应时间60min；所述接肽试剂与树脂的用量比为5ml/g；所述接肽试剂接肽反应温度为10～15℃，时间为3h；
酸切时，弱酸溶液为三氟乙醇(TFE)和二氯甲烷(DCM)混合溶液，三氟乙醇(TFE)体积比为50％；弱酸与树脂的用量的摩尔比为6ml/g；中和弱酸用2,4,6-三甲基吡啶(TMP)于弱酸的摩尔比为1。
实施例12
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4的制备，技术方案与实施例2相同，不同之处在于：
肽链延长时，树脂为4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂，所得溶胀树脂中树脂的浓度为0.2g/ml；Fmoc保护的氨基酸的摩尔数是树脂的3倍；DIEA的摩尔数是树脂的4.5倍；封闭试剂为DCM/MeOH/DIEA(5:4:1)反应30min；缩合剂为或2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，缩合剂的摩尔数是树脂的3倍；脱除试剂为六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)体积比为1:5的混合物；脱除试剂反应的温度为5～15℃，反应时间40min；所述接肽试剂与树脂的用量比为10ml/g；所述接肽试剂接肽反应温度为15～30℃，时间为2h；
酸切时，弱酸溶液为乙酸(AcOH)和甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)混合溶液，其中乙酸(AcOH)体积比为20％，DCM 60％；弱酸与树脂的用量为18ml/g；中和弱酸用的二异丙基乙基胺(DIEA)与弱酸的摩尔比为1.5。
实施例13
本实施例涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5的制备，技术方案与实施例3相同，不同之处在于：
肽链延长时，树脂为4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂，所得溶胀树脂中树脂的浓度为0.18g/ml；Fmoc保护的氨基酸的摩尔数是树脂的1.8倍；DIEA的摩尔数是树脂的7.5倍；封闭试剂反应15min；缩合剂为或2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，缩合剂的摩尔数是树脂的5倍；脱除试剂为六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)体积比为1:10的混合物；脱除试剂反应的温度为15～45℃，反应时间55min；所述接肽试剂与树脂的用量比为15ml/g；所述接肽试剂接肽反应温度为25～45℃，时间为0.5h；
酸切时，弱酸溶液为乙酸(AcOH)和甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)混合溶液，其中乙酸(AcOH)体积比为20％，DCM 60％；弱酸与树脂的用量为20ml/g；中和弱酸用的二异丙基乙基胺(DIEA)与弱酸的摩尔比为2.5。
实施例14
本实施涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2，即Fmoc-SEQ ID No:2-树脂的制备，技术方案及实施例4相同，不同之处仅在于：
树脂为Rink amide AM resin树脂，树脂的浓度为0.2g/ml；DIEA的摩尔数为树脂的4.5倍；所述接肽试剂与树脂的用量比为5ml/g；接肽反应温度为10～30℃，时间为30min；所述Fmoc保护的氨基酸的摩尔数为树脂的3倍；缩合剂的摩尔量是树脂的2倍；脱除Fmoc保护基的脱除试剂包括六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合液，二者体积比为1:2，反应温度为0～25℃，时间为10min；所述脱除Fmoc试剂与树脂的重量比为5ml/g。
实施例15
本实施涉及氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2即Fmoc-SEQ ID No:2-树脂的制备，技术方案及实施例4相同，不同之处仅在于：
树脂为Rink amide AM resin树脂，树脂的浓度为0.1g/ml；DIEA的摩尔数为树脂的3倍；所述接肽试剂与树脂的用量比为15ml/g；接肽反应温度为30～45℃，时间为3h；所述Fmoc保护的氨基酸的摩尔数为树脂的2.5倍；缩合剂的摩尔量是树脂的5倍；脱除Fmoc保护基的脱除试剂包括六氢吡啶(PIP)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的混合液，二者体积比为1:10，反应温度为20～45℃，时间为60min；所述脱除Fmoc试剂与树脂的重量比为15ml/g。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、将2-氯-3-苯甲基氯树脂、三苯甲基醇树脂或4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中10～120min，充分溶胀，所得溶胀树脂溶液中树脂的浓度为0.05～0.2g/ml；
步骤2、向步骤1所得溶胀树脂溶液中加入9-芴甲氧羰基保护的氨基酸与二异丙基乙基胺或9-芴甲氧羰基保护的氨基酸与缩合剂，于10～45℃反应15～60min；抽干，加入封闭试剂反应15～30min以封闭未反应的基团，以N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基保护基保护的氨基酸上的9-芴甲氧羰基保护基，洗涤后加入接肽试剂进行接肽反应，得肽树脂链，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5；
步骤3、将步骤2所得肽树脂链加入到稀酸或弱酸溶液中，于10～45℃反应60～90min，加入2,4,6-三甲基吡啶或二异丙基乙基胺中和，过滤；滤液浓缩，加入醇类、醚类或烷类析出溶剂析出保护肽固体，过滤收集滤饼真空干燥得到肽段，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5；
步骤4、将4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基树脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中30～60min，充分溶胀，溶胀树脂溶液中树脂的重量体积浓度为0.05～0.2g/ml；
步骤5、在步骤4所得溶胀树脂溶液中加入脱除试剂，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤数次，加入9-芴甲氧羰基保护的的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的接肽试剂全溶物连接第一个氨基酸到树脂上，于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂进行脱除反应脱除Fmoc保护基，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤后，加入9-芴甲氧羰基保护基保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的接肽试剂进行接肽反应得到肽树脂，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2；
步骤6、将肽树脂用溶胀剂充分溶胀后，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤数次,再依次加入氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，每加入一个肽段都要用N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除保护基，得如下全保护肽树脂，即羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的序列；
步骤7、向步骤6所得全保护肽树脂中加入T辅助细胞表位、缩合剂的全溶物，于10～45℃反应0.5～6.0h，抽干，依次以二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇洗涤树脂数次得到全保护的抗原肽2700树脂，即氨基端经T辅助细胞表位修饰、羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的序列；
步骤8、将预冷的-10～10℃的切断液加入到步骤7的抗原肽2700树脂中切除所有保护基团及树脂载体，于10～45℃反应1～4h，过滤，浓缩滤液后加入甲基叔丁基醚析出沉淀，用甲基叔丁基醚洗涤沉淀数次后干燥得到未环化的抗原肽2700粗品，即氨基端经T辅助细胞表位修饰的SEQ ID No:1；
步骤9、将步骤8所得抗原肽2700粗品溶于二甲亚砜溶液，调节pH值至6.0～8.0的条件下进行完全环化，即得环化合成肽抗原2700。
2.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤2中，所述9-芴甲氧羰基保护的氨基酸的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～3倍；
所述二异丙基乙基胺的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～7.5倍；
所述的缩合剂包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐中的一种；所述缩合剂的摩尔量是溶胀树脂溶液中树脂的1～5倍；
所述封闭试剂为体积比为5:4:1的二氯甲烷、甲醇、二异丙基乙基胺混合溶液或9:1的甲醇、二异丙基乙基胺混合溶液；
所述脱除试剂为六氢吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液，二者的体积比为1:2～10；所述脱除试剂加入溶胀树脂溶液后的浓度为5～15ml/g；所述脱除试剂的反应温度为0～45℃，时间为10～60min；
优选地，步骤2中，所述接肽试剂为9-芴甲氧羰基保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺全溶物；所述接肽试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；所述接肽试剂接肽反应温度为10～45℃，时间为0.5～3h。
3.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤3中，所述稀酸或弱酸溶液包括三氟乙酸和二氯甲烷、三氟乙醇和二氯甲烷、乙酸和甲醇和二氯甲烷中的一种组合；所述稀酸或弱酸溶液与肽树脂的用量比为6～20ml/g；
所述中和稀酸或弱酸溶液用的2,4,6-三甲基吡啶或二异丙基乙基胺与稀酸或弱酸的摩尔比为1～2.5；
所述醇类包括甲醇、乙醇或异丙醇；所述醚类包括乙醚、甲基叔丁基醚或石油醚；所述烷类包括正己烷或正庚烷。
4.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤5中，接肽试剂为9-芴甲氧羰基保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮或N,N-二甲基甲酰胺的全溶物；所述二异丙基乙基胺的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的2.25～7.5倍；所述接肽试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；接肽反应温度为10～45℃，时间为0.5～3h；
所述9-芴甲氧羰基保护的氨基酸的摩尔数为溶胀树脂溶液中树脂的1～3倍；
所述缩合剂包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐中的一种；所述缩合试剂的摩尔量是溶胀树脂溶液中树脂的1～5倍；
所述脱除试剂包括六氢吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合液，二者体积比为1:2～10；所述脱除试剂与溶胀树脂溶液中树脂的用量比为5～15ml/g；所述脱除试剂的反应温度为0～45℃，时间为10～60min。
5.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤6中，所述溶胀剂包括二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮中的一种或几种的混合物；
所述氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3、氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4、氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5的摩尔数均为肽树脂的1～1.5倍；
所述缩合剂包括二异丙基碳二亚胺和1-羟基-1H苯并三唑、二异丙基碳二亚胺和1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑中的一个组合，或2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐中的一种；所述缩合剂的摩尔量是肽树脂的1～5倍；
所述二异丙基乙基胺的摩尔数为肽树脂的1.5～7.5倍。
6.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤7中，所述T辅助细胞表位的摩尔数为肽树脂的1.0～2.0倍；
所述缩合剂包括二异丙基碳二亚胺和1-羟基-1H苯并三唑、二异丙基碳二亚胺和1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑中的一个组合；所述缩合剂的摩尔量是树脂的1～5倍。
7.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤8中，所述切断液试剂为三氟乙酸:三异丙基硅烷:苯酚:水质量比为90:5:4:1的混合物；所述切断液与抗原肽2700树脂的用量比为5～50ml/g。
8.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，步骤9中，所述二甲亚砜水溶液中二甲亚砜的体积分数为5～15％；
所述调节pH用氨水、乙酸；所述氨水溶液的浓度为0.5～5％；所述乙酸溶液浓度为0.5～5％。
9.根据权利要求1所述的固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，所述方法还包括使用强碱性阴离子交换树脂对环化抗原肽2700进行脱盐处理；使用正切向流超滤系统在适宜温度下对环化多肽进行超滤；高效液相测得合成肽抗原2700的纯度。
CN201410568334.9A 2014-10-22 2014-10-22 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法 Active CN104277097B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410568334.9A CN104277097B (zh) 2014-10-22 2014-10-22 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410568334.9A CN104277097B (zh) 2014-10-22 2014-10-22 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104277097A true CN104277097A (zh) 2015-01-14
CN104277097B CN104277097B (zh) 2017-05-17

Family

ID=52252490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410568334.9A Active CN104277097B (zh) 2014-10-22 2014-10-22 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104277097B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111803626A (zh) * 2020-07-08 2020-10-23 申联生物医药（上海）股份有限公司 猪口蹄疫o型和a型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用
CN113929749A (zh) * 2021-11-18 2022-01-14 陕西未来多肽生物科技有限公司 一种十六肽化合物及其制备方法
CN114933634A (zh) * 2021-11-18 2022-08-23 陕西未来多肽生物科技有限公司 一种乙酰基十六肽的合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102731643A (zh) * 2012-06-26 2012-10-17 深圳翰宇药业股份有限公司 一种治疗骨质疏松多肽的制备方法
CN103087156A (zh) * 2012-08-10 2013-05-08 申联生物医药（上海）有限公司 口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102731643A (zh) * 2012-06-26 2012-10-17 深圳翰宇药业股份有限公司 一种治疗骨质疏松多肽的制备方法
CN103087156A (zh) * 2012-08-10 2013-05-08 申联生物医药（上海）有限公司 口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANG YI WANG ET AL.,: "Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine", 《VACCINE》 *
LUIS L. RODRIGUEZ ET AL.,: "A synthetic peptide containing the consensus sequence of the G–H loop region of foot-and-mouth disease virus type-O VP1 and a promiscuous T-helper epitope induces peptide-specific antibodies but fails to protect cattle against vi", 《VACCINE》 *
卢清侠等: "猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定", 《河南农业科学》 *
马丽娜等: "口蹄疫合成肽疫苗研究进展", 《中国农学通报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111803626A (zh) * 2020-07-08 2020-10-23 申联生物医药（上海）股份有限公司 猪口蹄疫o型和a型二价合成肽疫苗及其制备方法与应用
CN113929749A (zh) * 2021-11-18 2022-01-14 陕西未来多肽生物科技有限公司 一种十六肽化合物及其制备方法
CN114933634A (zh) * 2021-11-18 2022-08-23 陕西未来多肽生物科技有限公司 一种乙酰基十六肽的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104277097B (zh) 2017-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU723268B2 (en) Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
DK2757107T3 (en) A process for the solid phase synthesis of liraglutide
CN103497245B (zh) 一种合成胸腺法新的方法
CN104974237B (zh) 一种片段法固相合成齐考诺肽的方法
EP0667786A1 (en) Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
CN101357938B (zh) 固相多肽合成Exenatide的制备方法
CN103145827A (zh) 一种乌拉力肽的固相合成方法
CN104277097A (zh) 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法
CN104177491B (zh) 一种替莫瑞林的制备方法
CN108059667B (zh) 一种兰瑞肽的固相合成方法
CN104311673A (zh) 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2800的方法
CN109021087A (zh) 一种固液相结合制备齐考诺肽的方法
CN104311640B (zh) 一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用
CN106432468A (zh) 一种制备艾塞那肽的固相合成方法
CN110922453B (zh) 一种戈舍瑞林的合成方法
CN104277098B (zh) 固相片段法制备猪o型口蹄疫合成肽抗原2600的方法
CN103992401B (zh) 一种制备艾塞那肽的方法
CN112175066A (zh) 一种制备舍莫瑞林的方法
CN104558149B (zh) 胸腺素α1的固相片段合成方法
JP2008534639A (ja) Ｐｅｇ樹脂上におけるアルファ−ヘリックスのペプチド合成
CN105153286B (zh) 一种利用微波固相合成法合成药物多肽那法瑞林的方法
DK150145B (da) Antigeniske peptider indeholdende 10-11 aminosyrerester
CN107417786B (zh) 一种胸腺肽α1的制备方法
CN108059663A (zh) 一种来考诺肽的制备方法
CN102731647B (zh) 一种制备来匹卢定的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 200240 Jiangchuan East Road, Shanghai, No. 48, No.

Applicant after: Shen Lian biological medicine (Shanghai) Limited by Share Ltd

Address before: 200241 Jiangchuan East Road, Shanghai, No. 48, No.

Applicant before: Shen Lian biological medicine (Shanghai) Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant