CN109021087A - 一种固液相结合制备齐考诺肽的方法 - Google Patents

一种固液相结合制备齐考诺肽的方法 Download PDF

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CN109021087A CN201811078797.1A CN201811078797A CN109021087A CN 109021087 A CN109021087 A CN 109021087A CN 201811078797 A CN201811078797 A CN 201811078797A CN 109021087 A CN109021087 A CN 109021087A
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Abstract

本发明公开了一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。本发明包括如下步骤：（1）固液相结合制备带修饰的多肽片段A；（2）固相法制备多肽片段B；（3）通过自然链接法，在液相条件下将修饰的多肽片段A链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液；（4）在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。

Description

一种固液相结合制备齐考诺肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽化合物合成技术领域，尤其涉及一种固液相结合制备齐考诺肽的方法。
背景技术
齐考诺肽英文名称Ziconotide，是一种含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。分子式：C102H172N36O32S7，分子量：2639.13，序列和结构如式I所示
式1
齐考诺肽是一种非阿片类镇痛药物，适用于鞘内注射并且对其他治疗(如全身镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或无效的严重慢性疼痛患者。齐考诺肽为含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。本品与位于脊髓背角浅层的初级伤害性传入神经上的N-型钙通道结合，抑制初级传人神经末梢兴奋性递质的释放，具有抗伤害感受作用。本品不与阿片受体结合，其药理作用也不被阿片受体拮抗剂所阻断。在动物模型中，本品可改变阿片引起的胃肠动力降低，但不能改善吗啡引起的呼吸抑制。给大鼠鞘内注射本品，同时给予吗啡、巴氯芬或可乐定，镇痛作用增强。本品与吗啡合用，不能防止大鼠对吗啡的耐受性。
现有的齐考诺肽的制备方法合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于齐考诺肽的大规模生产。CN200710301598，CN201110139661，CN201610947996公开了三种不同的合成齐考诺肽的方法，都是逐一偶联25个不同保护的氨基酸，随着肽链的延伸，偶联难度的增加，会导致多肽粗品纯度降低，纯化困难，收率降低的问题。CN201310202089和CN20150421787公开了一种全保护片段合成齐考诺肽的方法，其中CN201310202089选择了3个两肽片段来避免残肽的产生，CN20150421787则选择了全保护片段B（12-18）、C（6-11）、D（1-5）逐一偶联到片段A（19-25）树脂上，此类片段合成法都需要过量的全保护片段，而且制备大量片段也会造成成本提高，不利于后期工业化放大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，包括如下步骤：
1.固液相结合制备带修饰的多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}；
2.固相法制备多肽片段B：{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}；
3.通过自然链接法,在液相条件下将修饰的多肽片段A 链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2；
4.在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。
其中：步骤1以Fmoc-Asp(otbu)-二氯树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Boc-Cys(trt)-OH,得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-二氯树脂，经一次裂解得到全保护多肽Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH，再液相缩合苄硫醇，得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-SBzl，再经二次裂解去除保护基，得到多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}。
步骤2以Rnik Amide AM 树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(tbu)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH,得到NH2-Cys(trt)-Cys(trt)-Thr(tbu)-Gly-Ser(tbu)-Cys(trt)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Gly-Lys(boc)-Cys(trt)- RnikAmide AM树脂，裂解去除保护基，得到去保护多肽片段B：{ Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}。
步骤3将等摩尔比的多肽片段A和多肽片段B溶于pH=6.5-7.5的PBS溶液中，搅拌反应0.5-2小时，LCMS检测反应终点，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2。
步骤4在齐考诺肽线性肽粗品溶液中加入氧化剂，搅拌反应2-12小时，HPLC监测反应终点，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，真空冻干得到齐考诺肽精品。
步骤5中，固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂；液相缩合苄硫醇，以DMF或NMP或DMF/NMP为溶剂，选择HBTU/NMM或HCTU/NMM中的一种为缩合剂，搅拌反应0.5-2小时；
步骤5中，一次裂解液的配比为体积百分配比2%TFA/DCM，二次裂解液的配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水；
步骤8中，固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂；裂解液的配比组成（V%）为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水。
步骤11中所述的氧化剂为DMSO，浓度为1%-5% v/v。
本发明中一些常用缩写具有以下含义：
HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；
HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；
NMM：N-甲基吗啉；
Cys：半胱氨酸；
Lys：赖氨酸；
Gly：甘氨酸；
Ser：丝氨酸;
Thr：苏氨酸；
Asp：天冬氨酸；
Met：蛋氨酸；
Tyr：酪氨酸；
Leu：亮氨酸；
Arg：精氨酸；
Ala：丙氨酸；
Fmoc：芴甲氧羰基；
Boc：叔丁氧羰基；
Trt：三苯甲基；
Tbu：叔丁基；
Sbzl：硫苄酯
TFA：三氟乙酸；
DCM:二氯甲烷；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
NMP: N-甲基吡咯烷酮；
DMSO：二甲亚砜。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种固液相法结合制备齐考诺肽的方法，既能大大缩短合成周期，又能提高粗肽的纯度和收率，降低纯化难度。该方法选择合成两条AB肽链，策略性的在A链的C端加一个硫苄酯修饰，通过自然链接法将两条肽链结合成一条肽链，反应条件温和，且在同一体系中完成氧化反应，氧化条件温和，步骤精简，便于操作，适合于后期工业化生产。
附图说明
图1为实施例2产品质谱图。
图2为实施例6产品质谱图。
图3为实施例7中间体产品质谱图。
图4为实施例7产品质谱图。
图5为实施例7产品色谱图。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1：Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH的制备；
称取Fmoc-Asp(otbu)-2Cl-Trt-Cl-树脂 20g（0.3mmol /g）置于反应柱中，加入150ml体积百分配比20%哌啶/DMF溶液，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，再称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应柱中，再加入100mlDMF，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，DMF洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-2Cl-Trt-Cl-树脂36g。
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Tyr(tbu)-OH 5.52g，
Fmoc-Met-OH 4.46g，
Fmoc-Leu-OH 4.24g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH 7.79g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH 4.6g，
Fmoc-Cys(trt)-OH 7.03g，
Fmoc-Lys(boc)-OH 5.62g，
Fmoc-Ala-OH 3.74g，
Fmoc-Gly-OH 3.57g，
Fmoc-Lys(boc)-OH 5.62g，
Fmoc-Gly-OH 3.57g，
Fmoc-Lys(boc)-OH 5.62g，
Boc-Cys(trt)-OH 5.56g；
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(4.32g)，NMM(2.72ml)；
取上述树脂36g置于烧瓶中，加入360ml一次裂解液，配比为体积百分配比2%TFA/DCM，置于摇床中常温震荡反应1小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，减压浓缩旋去溶剂，得到全保护多肽片段A：Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH 16.8g。
实施例2：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl的制备；
取实施例1中的全保护多肽片段A 4.2g置于烧瓶中，加入100ml DMF溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.24g HCTU， 5ml DIEA，反应1小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段A：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl 2.25g，MW：1666，产品质谱图见图1。
实施例3：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl的制备；
取实施例1中的全保护多肽片段A 4.2g置于烧瓶中，加入100ml NMP溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.24g HCTU， 5ml DIEA，反应2小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段A：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl 2.35g。
实施例4：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl的制备；
取实施例1中的全保护多肽片段A 4.2g置于烧瓶中，加入100ml DMF溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.14g HBTU， 5ml NMM，反应1小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段A：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl 2.32g。
实施例5：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl的制备；
取实施例1中的全保护多肽片段A 4.2g置于烧瓶中，加入100ml NMP溶解，再加入0.37g苄硫醇，1.14g HBTU， 5ml NMM，反应2小时，加水析出白色固体，过滤除去滤液，滤饼经干燥后再加入200ml二次裂解液，配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，反应2小时，加入800ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段A：Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl 2.4g。
实施例6：Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2的制备；
称取Rink Amide AM树脂 20g（0.3mmol /g）置于反应柱中，加入150ml 体积百分配比20%哌啶/DMF溶液，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，再称取保护氨基酸，缩合剂，加入到反应柱中，再加入100mlDMF，反应30-60分钟，茚三酮检测反应终点，反应结束后排干反应液，DMF洗涤3次，反复循环，直至连完最后一个氨基酸，再脱保护洗涤，得到Cys(trt)-Cys(trt)-Thr(tbu)-Gly-Ser(tbu)-Cys(trt)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Gly-Lys(boc)-Cys(trt)-RnikAmide AM树脂 35g。
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Cys(trt)-OH 7.03g，
Fmoc-Lys(boc)-OH 5.62g，
Fmoc-Gly-OH 3.57g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH 4.6g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH 7.79g，
Fmoc-Cys(trt)-OH 7.03g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH 4.6g，
Fmoc-Gly-OH 3.57g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH 4.77g，
Fmoc-Cys(trt)-OH 7.03g，
Fmoc-Cys(trt)-OH 7.03g；
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(4.32g)，NMM(2.72ml)；
取上述树脂35g置于500ml烧瓶中，加入350ml裂解液，配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水，置于摇床中常温震荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，加入1400ml乙醚结晶，析出白色固体，经干燥后得到多肽片段B：Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 6.6g，MW：1103，产品质谱图见图2。
实施例7
取实施2中的多肽片段A 2.25g和实施例6中的多肽片段B1.65g 溶于 500ml pH 7.0PBS溶液中，搅拌反应2小时，AB链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，MW：2645，产品质谱图见图3；再加入10ml DMSO，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.4g，MW：2639，纯度99.2%，收率61.5%，精品MS和HPLC见图4和图5。
实施例8
取实施3中的多肽片段A 2.35g和实施例6中的多肽片段B1.65g 溶于 500ml pH7.5PBS溶液中，搅拌反应1小时，AB链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入25ml DMSO，继续搅拌氧化反应2小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.5g，纯度99.5%，收率62.5%。
实施例9
取实施2中的多肽片段A 2.32g和实施例6中的多肽片段B1.65g 溶于 500ml pH 6.5PBS溶液中，搅拌反应2小时，AB链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入10ml DMSO，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.3g，纯度99.3%，收率58.0%。
实施例10
取实施2中的多肽片段A 2.4g和实施例6中的多肽片段B1.65g 溶于 500ml pH 7.0PBS溶液中，搅拌反应2小时，AB链耦合得到齐考诺肽线性肽粗品，再加入15ml DMSO，继续搅拌氧化反应6小时，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，冻干得到齐考诺肽精品2.6g，纯度99.5%，收率64.19%。

Claims (9)

1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于：包括以下步骤:
（1）固液相结合制备带修饰的多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}；
（2） 固相法制备多肽片段B：{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}；
（3） 通过自然链接法，在液相条件下将修饰的多肽片段A 链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2；
（4）在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤（1）以Fmoc-Asp(otbu)-二氯树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Boc-Cys(trt)-OH,得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-二氯树脂，经一次裂解得到全保护多肽Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH，再液相缩合苄硫醇，得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-SBzl，再经二次裂解去除保护基，得到多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂；液相缩合苄硫醇，以DMF或NMP为溶剂，选择HBTU/NMM或HCTU/DIEA中的一种为缩合剂，搅拌反应0.5-2小时。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：两次裂解中,一次裂解液配比为体积百分配比2%的TFA/DCM，二次裂解液的体积百分配比组成为87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）以Rnik Amide AM 树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Ser(tbu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(tbu)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH,得到NH2-Cys(trt)-Cys(trt)-Thr(tbu)-Gly-Ser(tbu)-Cys(trt)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Gly-Lys(boc)-Cys(trt)- Rnik Amide AM树脂，裂解去除保护基，得到多肽片段B:{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂，裂解液的体积百分配比组成为87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）将等摩尔比的多肽片段A和多肽片段B溶于pH=6.5-7.5的PBS溶液中，搅拌反应0.5-2小时，LCMS检测反应终点，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）在齐考诺肽线性肽粗品溶液加入氧化剂，搅拌反应2-12小时，HPLC监测反应终点，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，真空冻干得到齐考诺肽精品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的氧化剂为DMSO，浓度为1%-5% v/v。
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