CN108047324A - 一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种ω‑芋螺毒素GVIA的制备方法，解决了现有技术合成ω‑芋螺毒素GVIA的空白和合成多肽中二硫键连接的准确率低、易生成多种同分异构体产物，增加产物分离纯化难度，从而使产物收率低的技术问题。本发明提供了一种ω‑芋螺毒素GVIA的制备方法，以Fmoc‑氨基树脂为固相合成的载体，依次缩合27个全保护氨基酸，全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护，得到ω‑芋螺毒素GVIA的线性全保护肽树脂，再依次脱除Cys的侧链保护基并进行环化反应定向形成二硫键，提高二硫键连接的准确率，得到的粗肽经纯化、冻干，得到ω‑芋螺毒素GVIA精肽。本发明广泛应用于多肽药物制备方法技术领域。

Description

一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物合成制备技术领域，特别涉及一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法。
背景技术
芋螺毒素(conotoxin)是一类来源于芋螺毒液的生物活性多肽，由毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，可引起动物出现惊厥、麻痹；通常由10～41个氨基酸残基组成，分子中含有两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素多肽。芋螺毒素能够特异性作用于乙酰胆碱受体及其它神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道，可被用于受体和离子通道的鉴定与分类。这些特性使得芋螺毒素称为研究神经生物学和药理学的有效工具，并有助于新药的开发应用。
根据作用于生物体靶标的不同，可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。ω-芋螺毒素专一性的阻断神经末梢电压敏感型Ca2+通道，例如ω-芋螺毒素MVIIA和ω-芋螺毒素GVIA是N-型钙通道的强效、选择性阻滞剂。ω-芋螺毒素在抑制疼痛方面的作用，引起了研究人员的巨大兴趣，其中来源于幻芋螺(Conos magus)的ω-芋螺毒素MVIIA，具有很好的镇痛效果，已被成功的开发成治疗严重慢性疼痛的药物齐考诺肽(商品名Prialt)。
目前对齐考诺肽的合成研究已有很多报道，而对ω-芋螺毒素GVIA的合成则鲜有报道。ω-芋螺毒素GVIA是来自于地纹芋螺(C.geographus)的一种由27个氨基酸残基组成、C端酰胺化的多肽，其分子含有三对二硫键，其结构如下：
专利CN101709082A报道了固相合成含有三对二硫键的齐考诺肽的制备方法，将全保护的线性肽树脂裂解得到的粗肽脱除Cys的侧链保护基，在液相中经一步氧化同时生成三对二硫键。由于6个Cys均采用Acm保护，不能定向形成二硫键，导致二硫键连接的准确率低，易生成多种同分异构体产物，增加产物分离纯化难度，从而使产物收率低。
专利CN104974237A报道了固相合成三对二硫键的齐考诺肽的制备方法，首先将齐考诺肽分为A、B、C、D四个片段分别进行合成，再将四个片段依次连接得到全长的线性肽。在氨基酸缩合时氨基酸与树脂投料量的摩尔比值为2:1，在片段缩合时肽片段与肽树脂投料量的摩尔比值为3:1，导致原料的大量消耗，大大的增加了原料的投入成本；同时6个Cys均采用Trt保护，同样会导致二硫键连接的准确率低，产物收率低。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术的不足，依据ω-芋螺毒素GVIA自身结构特点，提供一种可定向生成ω-芋螺毒素的二硫键、合成产物副产物少、产物分离纯化简单且收率高的ω-芋螺毒素GVIA的制备方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，依次包括步骤如下：
1)缩合反应：在缩合体系中，采用固相合成法，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω-芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂；全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护；依次缩合保护氨基酸顺序为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH；合成的线性全保护肽树脂为：Cys(Mob)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Se r(tBu)-Hyp(tBu)-Thr(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Hyp(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(OtBu)-Lys(B oc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-氨基树脂；
2)脱除步骤1)制得的全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂；
3)脱除步骤2)制得的一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂；
4)脱除步骤3)制得的二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽；
5)对步骤4)制得的二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽；
6)将步骤5)制得的三环粗肽经纯化、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽。
优选的，氨基树脂为：RinkAmide树脂、RinkAmide MBHA树脂、RinkAmideAM树脂、RinkAmide BHA树脂或Sieber树脂其中任何一种，氨基树脂替代度为0.1～1.2mmol/g。
优选的，步骤1)中缩合体系为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP，D为DIC。
优选的，步骤2)中脱除Trt保护基的方法为：在体积分数1％TFA-DCM溶液中，10～30℃条件下反应30～60min；环化方法为：加入体积分数10～20％DMSO，在10～30℃条件下反应2～6h。
优选的，步骤3)中脱除Acm保护基环化方法为：加质量分数10％I2-MeOH溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。
优选的，步骤4)中裂解切割树脂的方法为：加入裂解切割试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤、乙醚沉降、冻干，得到二环粗肽；裂解切割试剂组成成分体积比为TFA:EDT:H2O:TIS＝94:2:2:2。
优选的，步骤4)中脱除Mob保护基环化方法为：用体积分数10％乙酸将二环肽配成1mM的溶液，加入0.2M乙酸汞，调节pH至4，在10～30℃条件下反应2～5h后，加入体积分数20％的H2O2溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。
优选的，步骤5)中纯化方法为：用反相高效液相色潽法对粗肽进行纯化。
优选的，纯化色潽法条件为：C18制备柱，流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，梯度洗脱，流速80ml/min，洗脱时间60min，洗脱梯度流动相中B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，收集所需的组分。
优选的，步骤1)中缩合步骤如下：
a)Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM或DMF将树脂溶胀0.5h后，再用DMF将树脂洗涤两次；
b)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤a)中溶胀后的氨基树脂中，加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7；第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的氨基树脂；
c)氨基酸活化：在10～30℃条件下，将全保护氨基酸和缩合体系混合后活化5min，得活化氨基酸；
d)缩合：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，以Fmoc-氨基树脂为固相合成的载体，依次缩合27个全保护氨基酸，全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护，得到ω-芋螺毒素GVIA的线性全保护肽树脂，再用液相氧化等方法依次脱除Cys的侧链保护基并进行环化反应定向形成二硫键，提高二硫键连接的准确率，得到的粗肽经纯化、冻干，得到ω-芋螺毒素GVIA精肽。
(2)本发明制备方法将固相氧化与液相氧化相结合，可定向可控生成二硫键，合成多肽中二硫键连接的准确率高，合成产品效率高，同分异构体副产物少，有利于产物分离纯化、产物收率高，适合工业化规模生产制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
实施例1
ω-芋螺毒素GVIA线性肽树脂的制备：
1)Fmoc氨基树脂的溶胀：取10g替代度为0.5mmol/g的RinkAmide AM树脂，加入100ml DCM或DMF将氨基树脂溶胀0.5h，抽干溶剂；再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂，得氨基树脂Ⅰ。
2)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤1)制得的氨基树脂Ⅰ中，加入100ml体积分数20％PIP-DMF溶液，在25℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂，得脱保护的氨基树脂。
3)氨基酸活化：取15mmol Fmoc全保护氨基酸与缩合体系：15mmol HOBT和15mmolDIC，用适量的DMF混合溶解，在25℃条件下搅拌活化反应5min，得活化氨基酸。
4)氨基酸缩合：将步骤3)活化后的氨基酸加至步骤2)脱保护的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h。
用茚三酮显色反应监控氨基酸缩合反应进程，在缩合体系中，以Fmoc氨基树脂为固相载体，用固相合成法，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω-芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，依次缩合保护氨基酸顺序为
Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、
Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、
Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH、
Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH；得线性全保护肽树脂粗品为
Cys(Mob)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Thr(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Hyp(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(OtBu)-Lys(B oc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-RinkAmideAM树脂。
上述茚三酮显色方法为：取少量树脂至于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶，于120℃条件下加热反应2min后，再用DMF洗涤两次后，观察树脂颜色。
实施例2
ω-芋螺毒素GVIA一环肽树脂的制备：
脱除实施例1制得的线性全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂，具体如下：
1)将实施例1制得的线性全保护肽树脂置于圆底烧瓶中，加入体积分数1％TFA-DCM溶液，在25℃条件下搅拌反应30min后，抽滤，得肽树脂Ⅰ；
2)用DCM、MeOH交替洗涤步骤1)制得的肽树脂Ⅰ，加入体积分数10～20％DMSO，在25℃条件下反应5h后，抽干溶剂，得肽树脂Ⅱ；
3)用DCM、MeOH交替洗涤步骤2)制得的肽树脂Ⅱ，抽干溶剂，得ω-芋螺毒素GVIA一环肽树脂。
实施例3
ω-芋螺毒素GVIA二环肽树脂的制备：
脱除实施例2制得的ω-芋螺毒素GVIA一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂，具体如下：
将实施例2制得的ω-芋螺毒素GVIA一环肽树脂置于2L圆底烧瓶中，加入质量分数10％I2-MeOH溶液，在25℃条件下反应3h，得肽树脂Ⅰ；用DCM、MeOH交替洗涤肽树脂Ⅰ，抽干溶剂，得ω-芋螺毒素GVIA二环肽树脂。
实施例4
ω-芋螺毒素GVIA二环粗肽的制备：
脱除实施例3制得的ω-芋螺毒素GVIA二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽，具体如下：
将实施例3制得的ω-芋螺毒素GVIA二环肽树脂置于圆底烧瓶中，加入ω-芋螺毒素GVIA二环肽树脂10倍体积的裂解切割试剂，裂解切割试剂组成成分体积比为TFA:EDT:H2O:TIS＝94:2:2:2，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中沉降，抽滤，用乙醚将沉淀洗涤三次后，离心、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA二环粗肽。
实施例5
ω-芋螺毒素GVIA三环粗肽的制备：
对实施例4制得的ω-芋螺毒素GVIA二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽，具体如下：
1)用体积分数10％乙酸将实施例4制得的ω-芋螺毒素GVIA二环粗肽配成浓度为1mM的溶液，加入0.2M的乙酸汞，调节pH至4，在25℃条件下反应3h；加入体积分数20％H2O2溶液，在25℃条件下反应3h，得ω-芋螺毒素GVIA三环粗肽产品溶液。
实施例6
ω-芋螺毒素GVIA粗品纯化：
将实施例5制得的ω-芋螺毒素GVIA三环粗肽经纯化、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽。
用反相高效液相色潽法对实施例5制得的ω-芋螺毒素GVIA三环粗肽进行纯化，纯化色潽法条件为：C18制备柱，流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，梯度洗脱，流速80ml/min，洗脱时间60min，洗脱梯度流动相B相体积百分数10％～60％，紫外检测波长220nm，收集所需的肽组分，得到ω-芋螺毒素GVIA精肽；经浓缩、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽纯品。
经检测ω-芋螺毒素GVIA精肽纯品纯度98.5％，总收率30.3％。
上述实施例中，改变氨基树脂种类为：RinkAmide树脂、RinkAmide MBHA树脂、RinkAmide BHA树脂或Sieber树脂其中任何一种；改变氨基树脂替代度为0.1～1.2mmol/g；改变原料的投料比例为：全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、改变反应温度10～30℃、反应时间；改变缩合体系为：A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP等，均可合成ω-芋螺毒素GVIA且均可定向可控生成二硫键，合成多肽中二硫键连接的准确率高，合成产品效率高，同分异构体副产物少，有利于产物分离纯化、产物收率高，适合工业化规模生产制备。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
<110> 润辉生物技术（威海）有限公司
<120> 一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法
<160> 1
<170>
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 幻芋螺(Conos magus)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4,10,21)
<223> Xaa=Aib
<400> 1
Cys Lys Ser Xaa Gly Ser Ser Cys Ser Xaa Thr Ser Tyr Asn Cys Cys
1 5 10 15
Arg Ser Cys Asn Xaa Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr
20 25

Claims (10)

1.一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，依次包括步骤如下：
1)缩合反应：在缩合体系中，采用固相合成法，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω-芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂；所述全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护；所述的依次缩合保护氨基酸顺序为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OHFmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH；所述合成的线性全保护肽树脂为：Cys(Mob)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Thr(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Hyp(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(OtBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-氨基树脂；
2)脱除步骤1)制得的全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂；
3)脱除步骤2)制得的一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂；
4)脱除步骤3)制得的二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽；
5)对步骤4)制得的二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽；
6)将步骤5)制得的三环粗肽经纯化、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽。
2.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，所述的氨基树脂为：RinkAmide树脂、RinkAmide MBHA树脂、RinkAmideAM树脂、RinkAmide BHA树脂或Sieber树脂其中任何一种，所述氨基树脂替代度为0.1～1.2mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述缩合体系为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP，D为DIC。
4.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述脱除Trt保护基的方法为：在体积分数1％TFA-DCM溶液中，10～30℃条件下反应30～60min；环化方法为：加入体积分数10～20％DMSO，在10～30℃条件下反应2～6h。
5.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述脱除Acm保护基环化方法为：加质量分数10％I2-MeOH溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。
6.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述裂解切割树脂的方法为：加入裂解切割试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤、乙醚沉降、冻干，得到二环粗肽；所述裂解切割试剂组成成分体积比为TFA:EDT:H2O:TIS＝94:2:2:2。
7.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述脱除Mob保护基环化方法为：用体积分数10％乙酸将二环肽配成1mM的溶液，加入0.2M乙酸汞，调节pH至4，在10～30℃条件下反应2～5h后，加入体积分数20％的H2O2溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。
8.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的纯化方法为：用反相高效液相色潽法对粗肽进行纯化。
9.根据权利要求8所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，所述纯化色潽法条件为：C18制备柱，流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，梯度洗脱，流速80ml/min，洗脱时间60min，洗脱梯度流动相中B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，收集所需的组分。
10.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述缩合步骤如下：
a)Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM或DMF将树脂溶胀0.5h后，再用DMF将树脂洗涤两次；
b)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤a)中溶胀后的氨基树脂中，加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护时间为5min，所述第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的氨基树脂；
c)氨基酸活化：在10～30℃条件下，将全保护氨基酸和缩合体系混合后活化5min，得活化氨基酸；
d)缩合：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
所述全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
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