CN110698553A - 芋螺抗皱素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽产品制备技术领域，特别涉及芋螺抗皱素的制备方法。本发明的所述方法采用固液相相结合的方法合成芋螺抗皱素产品。采用固相合成方法按照芋螺抗皱素主链从C端到N端依次偶联到树脂上，之后将肽从树脂上切割下来得到线性肽，然后采用自然氧化法将线性肽氧化得到三对二硫键的芋螺抗皱素粗肽环化液，粗肽环化液经纯化得到高纯度精肽。本发明所述工艺，以较简便的工艺步骤同时实现了在精肽质量和总收率方面的较高水平，与生物提取技术相比反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。

Description

芋螺抗皱素的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽产品制备技术领域，特别涉及芋螺抗皱素的制备方法。
背景技术
芋螺抗皱素，英文名为mu-conotoxin，具体肽序如下：
H-Pyr1-Gly2-Cys3-Cys4-Asn5-Gly6-Pro7-Lys8-Gly9-Cys10-Ser11-Ser12-Lys13-Trp14-Cys15-Arg16-Asp17-His18-Ala19-Arg20-Cys21-Cys22-CONH2(Disulfide Bridge:3-15,Disulfide Bridge:4-21; Disulfide Bridge:10-22)
芋螺抗皱素（mu-conotoxin）属于u-芋螺毒素家族，最开始从海洋蜗牛毒液分离得到，靶向多种电压敏感性钠通道，主要阻断Nav1.4通道。芋螺抗皱素可消除人面部上的表情皮肤皱纹，被用于化妆品领域。
芋螺抗皱素主链氨基酸有22个，其肽链较长且有三对二硫键形成其特定的空间立体结构。其特殊结构导致该产品目前只有文献报道其通过生物提取的方式得到，生物中含量极低，提取成本高；尚没有文献报道通过化学合成的方式得到高纯度的芋螺抗皱素产品。
如何通过化学合成的方法合成芋螺抗皱素线性肽，并根据芋螺抗皱素三对二硫键天然的稳定构象选择合适的缓冲盐体系及氧化浓度是工艺开发的重点。
发明内容
为了克服芋螺抗皱素目前只有生物提取获得的来源问题，本发明的目的在于：提供芋螺抗皱素制备工艺，本发明不仅合成周期短、总收率高、纯品纯度高，而且容易实现工业化放大生产。
其具体步骤如下：
步骤1：将固相载体依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH或其盐在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到全保护肽树脂。
步骤2：全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；
步骤3：将芋螺抗皱素线性肽用DMSO水溶液溶解澄清后，加入到缓冲盐体系中，最终线性肽反应浓度控制在较稀浓度。室温下环化24~48小时，得到芋螺抗皱素粗肽环化液；
步骤4：粗肽环化液经纯化、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素。
具体地，步骤1所述的固相载体选自Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHAResin、Sieber Amide Resin。同时，作为优选方案，步骤1所述的固相载体选自Rink AmideAM Resin和Rink Amide MBHA Resin的替代度0.4 mmol/g~1.5mmol/g。由于Sieber AmideResin相对较以上两种树脂，价格昂贵。
具体地，步骤1中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。作为优选方案，步骤1中的缩合剂选自HOBt、HBTU、DIC。由于HOBt、HBTU、DIC价格较便宜，在固相合成中应用较多。
作为优选方案，步骤1中所用的碱为DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠。
在实际生产应用中，氨基酸的投料量比为2.0 eq，氨基酸和缩合剂的比值以1：1.1为佳。
具体地，步骤2的肽树脂裂解时，不仅需要从肽树脂上切割，而且需要脱除侧链保护基，因此所选的裂解液是体积百分比为80%~95%的TFA、体积百分比1-10%的乙二硫醇、体积百分比1-10%的苯甲硫醚、余量为纯化水组成的混合酸液。
具体地，步骤3所述DMSO水溶液为采用体积百分比为5%~30%的DMSO,95%~70%的纯化水组成的混合溶液。作为优选方案，DMSO水溶液中DMSO的体积百分比采用10%。
具体地，步骤3所述缓冲盐体系为磷酸盐缓冲盐体系、氨水/碳酸氢铵缓冲盐体系、甲酸铵/甘氨酸缓冲盐体系。作为优选方案，缓冲盐体系为磷酸盐缓冲体系。
具体地，步骤3所述较稀浓度为按照线性肽称重配成0.1mg/mL~5mg/mL。作为优选方案，线性肽浓度为1mg/mL。
纯化芋螺抗皱素粗肽环化液的方法优选为：将粗肽环化液用0.45μm滤膜过滤。滤液经C18柱纯化，流动相：A为0.1%的三氟乙酸水溶液；B为乙腈；梯度：B相为28%-45%，流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰。
本发明根据芋螺抗皱素肽序情况，采用固液相结合的方法，解决了芋螺抗皱素只能通过生物提取，不能通过化学合成的窘境问题。本发明所述工艺，合成周期短、总收率高、纯品纯度高，而且容易实现工业化放大生产，具有广泛的市场前景。
本发明权利要求书及说明书中涉及的英文缩写对应的中文名称如下表：
英文名 中文名称 英文缩写 中文名称
tBu 叔丁基 Fmoc 9-芴甲氧羰基
Trt 三苯甲基 DPPA 叠氮化磷酸二苯酯
DIC 二异丙基碳二亚胺 Boc 叔丁氧羰基
DCM 二氯甲烷 HOBt 1-羟基苯并三氮唑
DMSO 二甲基亚砜 DCC 二环己基碳二亚胺
MeOH 甲醇 DMF N，N-二甲基甲酰胺
Py 吡啶 TFA 三氟乙酸
PyAOP (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 HBTU 苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
Pbf （2，3-二氢-2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-基）磺酰基 HCTU 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA 二异丙基乙胺 PIP 哌啶
TIS 三异丙基硅烷 EDT 乙二硫醇
附图说明
图1所示为实施例24芋螺抗皱素粗肽环化液的HPLC峰图。
图2所示为实施例25芋螺抗皱素精肽的HPLC峰图。
图3所示为实施例25芋螺抗皱素精肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1： Fmoc-Cys(Trt)-OH(第22个氨基酸)的偶联
称取Rink Amide AM Resin(100.00g，loading：0.6mmol/g)用1000mL 干燥DMF洗涤1次，抽干，1000mL DMF溶胀2 h，抽干。
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，1000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 1000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用1000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，1000 mL/次/min，抽干。
实施例2： Fmoc-Cys(Trt)-OH(第21个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，1000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 1000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用1000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，1000 mL/次/min，抽干。
实施例3： Fmoc-Arg(Pbf)-OH(第20个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，1000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 1000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取63.15 g Fmoc-Arg(Pbf)-OH，17.84 g HOBt用1000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，1000 mL/次/min，抽干。
实施例4： Fmoc-Ala-OH(第19个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，1000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 1000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取37.36 g Fmoc-Ala-OH，17.84 g HOBt用1000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，1000 mL/次/min，抽干。
实施例5： Fmoc-His(Trt)-OH(第18个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取74.37 g Fmoc-His(Trt)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干。
实施例6： Fmoc-Asp(OtBu)-OH (第17个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取49.37 g Fmoc-Asp(OtBu)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入 16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干。
实施例7： Fmoc-Arg(Pbf)-OH (第16个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取63.15 g Fmoc-Arg(Pbf)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干。
实施例8： Fmoc-Cys(Trt)-OH (第15个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干。
实施例9： Fmoc-Trp(Boc)-OH (第14个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取63.19 g Fmoc-Trp(Boc)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干。
实施例10： Fmoc-Lys(Boc)-OH (第13个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取56.22 g Fmoc-Lys(Boc)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干.
实施例11： Fmoc-Ser(tBu)-OH (第12个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取46.01 g Fmoc-Ser(tBu)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干
实施例12： Fmoc-Ser(tBu)-OH (第11个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，2000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 2000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取46.01 g Fmoc-Ser(tBu)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，2000 mL/次/min，抽干
实施例13： Fmoc-Cys(Trt)-OH (第10个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，3000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用3000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，3000 mL/次/min，抽干。
实施例14： Fmoc-Gly-OH (第9个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，3000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取35.68 g Fmoc-Gly-OH，17.84 g HOBt用3000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，3000 mL/次/min，抽干。
实施例15： Fmoc-Lys(Boc)-OH (第8个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，3000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取56.22 g Fmoc-Lys(Boc)-OH，17.84 g HOBt用2000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，3000 mL/次/min，抽干。
实施例16： Fmoc-Pro-OH (第7个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，3000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取40.48 g Fmoc-Pro-OH，17.84 g HOBt用3000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，3000 mL/次/min，抽干。
实施例17： Fmoc-Gly-OH (第6个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，3000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取35.68 g Fmoc-Gly-OH，17.84 g HOBt用3000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，3000 mL/次/min，抽干。
实施例18： Fmoc-Asn(Trt)-OH (第5个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，4000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 3000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.40 g Fmoc-Asn(Trt)-OH，17.84 g HOBt用4000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，4000 mL/次/min，抽干。
实施例19： Fmoc-Cys(Trt)-OH (第4个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，4000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 4000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用4000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，4000 mL/次/min，抽干。
实施例20： Fmoc-Cys(Trt)-OH (第3个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，4000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 4000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取70.29 g Fmoc-Cys(Trt)-OH，17.84 g HOBt用4000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，4000 mL/次/min，抽干。
实施例21： Fmoc-Gly-OH (第2个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，4000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 4000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取35.68 g Fmoc-Gly-OH，17.84 g HOBt用4000 mL DMF溶解，冰浴下加入16.67 g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，4000 mL/次/min，抽干。
实施例22： H-Pyr-OH (第1个氨基酸)的偶联
加入20%的哌啶/DMF溶液（DBLK溶液）脱保护两次，4000mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次， 4000mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取15.49 g H-Pyr-OH，17.84 g HOBt用4000 mL DMF溶解，冰浴下加入 16.67 gDIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2 h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，4000 mL/次/min，抽干; 用甲醇洗涤3次，4000 mL/次/min；二氯甲烷洗涤3次，4000 mL/次/min；抽干，室温下真空干燥24小时直至恒重，称量干燥全保护肽树脂371.2g。
实施例23：芋螺抗皱素线性肽的制备
配置裂解液（TFA/EDT/TIS/H2O,V/V/V/V,92.5/2.5/2.5/2.5）3.7L, 降温至0℃，加入上述肽树脂371.2 g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，得到未干燥线性肽，直接用于下步氧化反应。
实施例24：芋螺抗皱素粗肽环化液的制备
用50mmol磷酸二氢钠/50mmol磷酸一氢钠为缓冲盐体系，用DIEA调PH值为9.0；用上述缓冲盐水溶液128L，加入DMSO14 L，配成约10%的DMSO溶液。将上述未干燥的线性肽加入到10%的DMSO溶液中，配成约1mg/mL的溶液，室温下搅拌48小时，HPLC检测反应完全，粗肽纯度69.64%
实施例25：芋螺抗皱素的纯化
将粗肽环化液用0.45um滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：A 0.1%的三氟乙酸水溶液；B相：乙腈；B相 梯度：28%-45%流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合格样品峰合并，浓缩冻干，得到44.51 g白色絮状产品，总收率：31.23%；纯度：99.01%；MS检测：1188.21（1/2M+H）、792.53（1/3M+H）、594.69（1/4M+H）。

Claims (12)

1.芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将固相载体依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH或其盐在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到全保护肽树脂。
步骤2：全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；
步骤3：将芋螺抗皱素线性肽用DMSO水溶液溶解澄清后，加入到缓冲盐体系中，最终线性肽反应浓度控制在较稀浓度。室温下环化24～48小时，得到芋螺抗皱素粗肽环化液；
步骤4：粗肽环化液经纯化、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素。
2.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤1所述的固相载体选自RinkAmideAM Resin、RinkAmide MBHAResin、SieberAmide Resin。
3.根据权利要求2所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于：RinkAmideAM Resin的替代度0.4mmol/g～1.5mmol/g，RinkAmide MBHAResin的替代度为0.4mmol/g～1.5mmol/g,SieberAmide Resin的替代度为0.4mmol/g～1.0mmol/g。
4.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。
5.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤1中所用的碱为DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠。
6.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，氨基酸的投料量比为1.5～3.0eq，氨基酸和缩合剂的比值为1：1.1～1.5。
7.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤2所述裂解液采用体积百分比为80％～95％的TFA、体积百分比1-10％的乙二硫醇、体积百分比1-10％的苯甲硫醚、余量为纯化水组成的混合酸液。
8.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤3所述DMSO水溶液为采用体积百分比为5％～30％的DMSO,95％～70％的纯化水组成的混合溶液。
9.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤3所述缓冲盐体系为磷酸盐缓冲盐体系、氨水/碳酸氢铵缓冲盐体系、甲酸铵/甘氨酸缓冲盐体系。
10.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤3所述较稀浓度为按照线性肽称重配成0.1mg/mL～5mg/mL
11.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤4粗肽环化液纯化的方法为：粗肽环化液用0.45um滤膜过滤后，用高效液相色谱法进行纯化，色谱柱为反相C18填料高效液相色谱柱，流动相：A为0.1％的三氟乙酸水溶液；B为乙腈；梯度：B相为21％-35％。
12.根据权利要求1所述的芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，步骤4粗肽环化液纯化的方法为：粗肽环化液用0.45um滤膜过滤后，用高效液相色谱法进行纯化，色谱柱为反相C18填料高效液相色谱柱，流动相：A为0.1％的三氟乙酸水溶液；B为乙腈；梯度：B相为28％-45％。
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