WO2021103458A1 - 一种地加瑞克的固相合成方法 - Google Patents

一种地加瑞克的固相合成方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021103458A1
WO2021103458A1 PCT/CN2020/092591 CN2020092591W WO2021103458A1 WO 2021103458 A1 WO2021103458 A1 WO 2021103458A1 CN 2020092591 W CN2020092591 W CN 2020092591W WO 2021103458 A1 WO2021103458 A1 WO 2021103458A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fmoc
solvent
solid
degarelix
reaction
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/092591
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陶志强
尹传龙
陶安进
余品香
Original Assignee
深圳翰宇药业股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳翰宇药业股份有限公司 filed Critical 深圳翰宇药业股份有限公司
Publication of WO2021103458A1 publication Critical patent/WO2021103458A1/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of polypeptide drug production, and relates to a solid-phase synthesis method of degarelix.
  • Degarelix Acetate is a gonadotropin releasing hormone (GnRH) receptor inhibitor drug developed by Ferring Pharmaceuticals. It slows the growth and progression of prostate cancer by inhibiting testosterone, which is essential for the continued growth of prostate cancer. For the treatment of advanced prostate cancer. Listed in the United States in December 2008 under the trade name The main chain of degarelix consists of 10 amino acids, and the N-terminus is modified by acetylation. The amino acid sequence is Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH 2 . Its structural formula is as follows:
  • Hor (hydroorotic acid) in the fifth amino acid 4Aph (Hor) from the nitrogen end is prone to isomerization reaction under alkaline conditions to form hydantoin-5-acetic acid (see Org. Biomol. Chem., 2004, 2, 1098-1103; J. Chem. Soc. Perkin, Trans. 1984, 2, 1077-1081).
  • the mechanism is as follows:
  • Patent US5925730 discloses the preparation of degarelix by Boc solid phase synthesis method
  • patent US5977302 discloses the preparation of degarelix by Boc liquid phase synthesis method.
  • Boc strategy can avoid the use of alkali
  • the lysis reagents require the use of highly toxic HF , Resulting in restrictions on mass production.
  • Patent US8828938 uses a solid-phase synthesis strategy to prepare degarelix, and points out that deprotection with a 20% piperidine/DMF solution can effectively inhibit this side reaction, but the sixth position from the nitrogen end is protected by 4Aph (tbu-Cbm)
  • t-Bu needs to be cleaved with TFA for 25 hours. Too long time will lead to degradation of the peptide chain, thereby reducing the purity of the crude peptide and increasing the difficulty of purification.
  • Patent CN102329373 uses Fmoc solid-phase synthesis of degarelix, first introduce 4Aph (Trt) or 4Aph (Alloc), after the peptide chain is coupled, remove Trt or Alloc, and finally couple L-Hor, but use acid The removal of Trt or Alloc will cause the Boc part of Lys (Boc, ipr) to fall off, and it will react with the next amino acid during subsequent amino acid coupling, resulting in unnecessary impurities.
  • Trt 4Aph
  • Alloc 4Aph
  • Patent CN103351428 adopted a similar strategy, except that it was replaced with 4Aph (Mmt) or 4Aph (Dmt).
  • Patent CN103992392 first introduces 4Aph (ivDde), and then couples with hydroorotic acid after removing ivDde. Although it can avoid the problem of Boc part falling off in Lys (Boc, ipr) caused by acid removal of Trt or Alloc, this method is still There are problems such as unclean removal of ivDde or incomplete L-Hor coupling resulting in L-Hor defect impurities, and the post-processing of this method is more troublesome.
  • Fmoc-4Aph(Hmb, Hor)-OH (the structure is shown below) is used as the raw material for direct coupling at the fifth position of the N-terminal. That is, it avoids the side reaction of Hor (hydroorotic acid) in 4Aph (Hor) that is prone to isomerization under alkaline conditions, and reduces the need to remove ivDde in 4Aph (ivDde) and couple hydrogenated milk, for example, in patent CN103992392. The cumbersome steps of acid cleaning avoid the generation of Hor defect impurities.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for synthesizing degarelix.
  • the technical solution adopted by the present invention is: a solid-phase synthesis method of degarelix, which includes the following steps:
  • the solid-phase carrier in 1) is Rink Amide AM Resin, Rink Amide MBHA Resin or Rink Amide Resin; the degree of substitution of the solid-phase carrier is 0.1-1.0 mmol/g, preferably 0.2-0.8 mmol/g, More preferably, it is 0.3-0.5 mmol/g.
  • Fmoc-4Aph(Hmb, Hor)-OH in 1) can be purchased commercially or synthesized by oneself;
  • reaction temperature It is room temperature, the reaction time is 10-14 hours, the reaction solvent is a mixed solvent of dioxane and water, and the volume ratio of dioxane and water is 1:1.
  • the molar ratio of Fmoc-4Aph-OMe, 2-methoxy-4-acetoxybenzaldehyde and NaBH 3 CN in said a is 1:1:1 to 1:1.5:1.5;
  • the molar ratio of Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe, EDC, HOBt, DIPEA and hydrogenated orotic acid prepared by a in said b is 1:1:1:3:1 ⁇ 1:1.5:1.5:3.75 :1.5;
  • the molar ratio of the Fmoc-4Aph(Hmb, Hor)-OMe prepared by b in the c and the lithium hydroxide in the 1 mol/L lithium hydroxide aqueous solution is 1:1 to 1:5.
  • step 1) specifically includes the following steps:
  • the solvent for swelling is DMF, NMP or dichloromethane, preferably DMF.
  • the reagent used to remove the Fmoc protecting group is a 20% piperidine/DMF solution.
  • the coupling agent is a combination of DIPCDI and compound A or a combination of DIPEA and compound A and compound B, wherein compound A is HOAt or HOBt, and compound B is PyAOP, PyBOP, HATU, HBTU or TBTU, preferably Composition of DIPCDI and Compound A.
  • the coupling reaction time for each amino acid is usually 1.5-4 hours, preferably 2-3 hours; the temperature is preferably room temperature (ie 20 ⁇ 5° C.), and it can also be carried out at an appropriately increased or decreased temperature.
  • the step 2) specifically includes the following steps: using a mixed solvent of acetic anhydride and pyridine to fully mix with the peptide resin and then react at room temperature for 2-5 hours for capping, preferably 2-3 hours, in the mixed solvent of acetic anhydride and pyridine
  • the molar amount of is 10-40 times that of the N-terminal free amino group, and the molar ratio of acetic anhydride and pyridine is 1:1.
  • step 3 cleavage of peptide resin in the mixture of TFA and lysates with H 2 O, the TFA and H 2 O volume ratio of 95: 5, and the lysate volume weight ratio of the peptide resin 6-8mL: 1g;
  • the pyrolysis temperature is room temperature, and the time is 2-4 hours, preferably 3 hours.
  • anhydrous ether is used for precipitation of the crude peptide, the amount is 8-12 times the volume of the lysate, and the crude peptide is obtained after drying with nitrogen.
  • the step of synthesizing the crude peptide further includes the steps of purification and transsalting of the crude peptide.
  • the purification step adopts reverse phase high pressure liquid chromatography
  • the reverse-phase high-pressure liquid chromatography method includes: using reverse-phase octadecylsilane as a stationary phase, using a 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution/acetonitrile as a mobile phase for the first purification, and monitoring and collecting the largest peak fraction at a wavelength of 280 nm;
  • the fraction with a purity greater than or equal to 99.5% and a single impurity less than 0.05% is the first-step qualified fraction, and the rest are unqualified fractions.
  • the fraction of the unqualified fraction with a purity greater than 90% will be recovered and purified, and the purity is less than 90%.
  • the fractions are further transferred to salt with a reversed-phase chromatography column, the chromatographic peak is monitored at a wavelength of 280nm, and the peak fractions are collected, concentrated to about 20mg/ml, and lyophilized.
  • the present invention uses Fmoc-4Aph(Hmb, Hor)-OH instead of Fmoc-4Aph(Hor)-OH as raw materials for sequential coupling, thereby reducing the generation of isomerized impurities.
  • the existence of the protective group of the Hmb skeleton prevents the carboxyl group after hydrolysis and ring opening of the hydrogenated orotic acid from attacking the nitrogen on the benzene ring, thereby inhibiting the rearrangement and isomerization reaction.
  • the reaction mechanism of the present invention to inhibit isomerization impurities is shown below.
  • the isomerization impurities in the crude peptide are reduced to 0.01% (or there may be no, because of noise), thereby reducing the difficulty of purification and improving the purification yield.
  • Hmb is a backbone protecting group, usually used to contract peptides or to overcome difficult sequence coupling (Int. J. Pept. Protein Res. 1994; 43: 431).
  • Other framework protecting groups include Dmb, Mmsb, Hmsb, Hnb and so on. Compared with Dmb, Hmb is more conducive to the coupling of the next amino acid. Compared with Mmsb, Hmsb, and Hnb, the removal of Hmb is more convenient and does not require additional reduction steps. Therefore, the main function of Hmb selected in the present invention is not in the literature (Int. J. Pept. Protein Res.
  • Figure 1 is the HPLC spectrum of the crude peptide of degarelix in Example 1;
  • Figure 2 is the HPLC spectrum of the degarelix refined peptide in Example 1;
  • Figure 3 is a mass spectrum of degarelix refined peptide
  • Figure 4 is the HPLC spectrum of the crude peptide of degarelix in Example 3.
  • Figure 5 is the HPLC spectrum of the degarelix refined peptide in Example 3.
  • Figure 6 is the HPLC spectrum of the crude peptide of degarelix in Example 4.
  • Figure 7 is the HPLC spectrum of the degarelix peptide in Example 4.
  • Step 3 Cleavage of the peptide resin
  • Step 4 Purification and salt transfer of crude peptide
  • Example 3 Put the crude peptide of Example 3 into a beaker, add 40% (v/v) acetonitrile + 60% (v/v) aqueous solution in an amount of about 30 g/L, sonicate until completely dissolved, use 0.45 ⁇ m nylon 66 microporous filter Membrane filtration.
  • the chromatographic column was rinsed with 50% acetonitrile, and the system was equilibrated with 5% acetonitrile for 5 minutes. Then, the system was purified by HPLC with a sample amount of 13-15 g/time, monitored at a wavelength of 280nm, and collected fractions according to the chromatographic peak.
  • the collected fractions are tested with an analytical liquid chromatograph, and the fractions with purity greater than or equal to 99.5% and single impurities less than 0.05% are qualified fractions.
  • the rest are unqualified fractions.
  • the part of the unqualified fractions with a purity greater than 90.0% is recovered and purified, and the purity is less than 90% is treated as waste liquid.
  • the chromatographic column was rinsed with 50% acetonitrile, and the column was equilibrated with the mobile phase 5% acetonitrile for 5 minutes, and the sample was loaded with 17-23 grams. If the sample has precipitated and aggregated, add 30% acetic acid to ultrasonically dissolve it and dilute it with water. The salt will be converted according to the above gradient requirements.
  • the chromatographic peak is monitored at a wavelength of 280nm, and the peak fractions are collected and concentrated to about 20mg/ml.
  • the resin used in step 1 of this example is Rink Amide AM resin (substitution degree is 0.38 mmol/g), and the reaction time is 1.5 hours.
  • the blocking time of the mixed solvent of acetic anhydride and pyridine in step 2 of this embodiment is 5 hours, and the molar amount of the mixed solvent is 40 times that of the N-terminal free amino group.
  • the amount of lysate used in step 3 of this example is 7 times that of peptide resin. Lysis for 4 hours at room temperature, anhydrous ether was used to precipitate the crude peptide, and the amount was 10 times that of the lysis solution. After drying with nitrogen, 28.92 grams of crude peptides were obtained, the purity of the crude peptides was 93.97%, the impurity of hydrolactic acid was 0.06% (see Figure 4), and the yield was greater than 100% (acid radicals were combined).
  • step 4 of this embodiment is the same as that of embodiment 1. After lyophilization, 15.6 g of refined peptides were obtained, with a yield of 63.7%, a purity of 99.90%, and a maximum single impurities of 0.06% (see Figure 5).
  • the resin used in step 1 of this embodiment is Rink Amide MBHA resin (substitution degree is 0.36 mmol/g), and the reaction time is 4 hours.
  • the blocking time of the mixed solvent of acetic anhydride and pyridine in step 2 of this embodiment is 8 hours, and the molar amount of the mixed solvent is 10 times that of the N-terminal free amino group.
  • the amount of lysate used in step 3 of this example is 6 times that of peptide resin. Lysis for 2 hours at room temperature, anhydrous ether was used to precipitate the crude peptide, and the amount was 12 times that of the lysis solution. After drying with nitrogen, 28.48 g of crude peptide was obtained, the purity of the crude peptide was 93.38%, the impurity of hydrolactic acid was 0.05% (see Figure 6), and the yield was greater than 100% (acid radicals were combined).
  • step 4 of this embodiment is the same as that of embodiment 1. After lyophilization, 15.4g of refined peptide was obtained, with a yield of 62.9%, a purity of 99.87%, and a maximum single heterogeneity of 0.03% (see Figure 7).
  • the total yield of degarelix prepared in the examples of patent CN201080018334 is 37%.
  • the total yield of degarelix prepared in the examples of patent CN201110292168 is 40%, and the purity is 99.8%.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

提供了一种地加瑞克的固相合成方法，包括：1)肽树脂的偶联：按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH至固相载体上；2)肽树脂N端乙酰化；3)肽树脂裂解后获得地加瑞克粗肽。

Description

一种地加瑞克的固相合成方法 技术领域
本发明属于多肽类药物生产技术领域，涉及一种地加瑞克的固相合成方法。
背景技术
醋酸地加瑞克是由辉凌制药公司开发的促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物，通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化，适用于晚期前列腺癌的治疗。2008年12月在美国上市，商品名为
Figure PCTCN2020092591-appb-000001
地加瑞克的主链有10个氨基酸组成，N端通过乙酰化修饰。氨基酸序列为Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH 2。其结构式如下：
Figure PCTCN2020092591-appb-000002
在上述结构中，自氮端第五个氨基酸4Aph(Hor)中Hor(氢化乳清酸)在碱性条件下易发生异构化反应，生成乙内酰脲-5-乙酸(详见Org.Biomol.Chem.,2004,2,1098–1103；J.Chem.Soc.Perkin,Trans.1984,2,1077-1081)。机理如下所示：
Figure PCTCN2020092591-appb-000003
在Fmoc固相合成中，需要使用碱脱除Fmoc保护基，因此，该副反应不可避免会发生，相应杂质产生会降低粗肽纯度，增加纯化难度，最终降低产品收率。
专利US5925730公开了Boc固相合成方法制备地加瑞克，专利US5977302公开了Boc 液相合成方法制备地加瑞克，虽然使用Boc策略可以避免使用碱，但裂解试剂都需要使用到剧毒的HF，导致大批量生产受到限制。
Fmoc固相合成策略操作简单，而且可以避免剧毒物HF的使用，因此被广泛应用。专利US8828938采用固相合成策略制备了地加瑞克，而且指出用20％哌啶/DMF溶液脱保护可有效抑制该副反应发生，但其氮端起第六位采用4Aph(tbu-Cbm)保护氨基酸，其t-Bu需要用TFA裂解25小时，时间太长会导致肽链的降解，从而降低粗肽纯度，增加纯化难度。专利CN201310336446和CN201611139257分别采用了“3+7”和“6+4”片段合成法，但片段间由于空间位阻较大，偶联困难必然导致反应不完全。专利CN102329373在采用Fmoc固相合成地加瑞克时，先引入4Aph(Trt)或4Aph(Alloc)，待肽链偶联完，脱除Trt或Alloc，最后再偶联L-Hor，但用酸脱除Trt或Alloc时会导致Lys(Boc,ipr)中Boc部分脱落，在后续氨基酸偶联时会与下一个氨基酸反应，导致产生不必要的杂质。专利CN103351428采取了类似的策略，只不过换成了4Aph(Mmt)或4Aph(Dmt)。专利CN103992392则是先引入4Aph(ivDde)，脱掉ivDde后和氢化乳清酸偶联，虽然可以避免酸脱除Trt或Alloc时导致Lys(Boc,ipr)中Boc部分脱落问题，但该方法仍然存在ivDde脱除不干净或L-Hor偶联不完全导致L-Hor缺损杂质产生等问题，并且该方法后处理比较麻烦。
为了克服现有技术的不足。本发明在N端第五位采用Fmoc-4Aph(Hmb，Hor)-OH(结构如下所示)为原料直接进行偶联。即避免了4Aph(Hor)中Hor(氢化乳清酸)在碱性条件下易发生异构化的副反应，又减少了例如专利CN103992392需要脱除4Aph(ivDde)中ivDde再进行偶联氢化乳清酸的繁琐步骤，避免Hor缺损杂质的产生。
Figure PCTCN2020092591-appb-000004
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种地加瑞克的合成方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种地加瑞克的固相合成方法，包括以 下步骤：
1)肽树脂的偶联：按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH至固相载体上；
2)肽树脂N端乙酰化；
3)肽树脂裂解后获得地加瑞克粗肽。
进一步地，1)中所述固相载体为Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin或Rink Amide Resin；所述固相载体的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。
进一步地，1)中Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH可以商业购买，也可自行合成；
1)中所述Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH的制备方法为：
a、以Fmoc-4Aph-OMe为原料和2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛在NaBH 3CN的作用下进行还原氨化反应得到Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe，反应温度为室温，反应时间为10-14小时，反应溶剂为二氧六环和水混合溶剂，所述二氧六环和水的体积比为1:1。
b、然后在EDC/HOBt/DIPEA作用下，在二氯甲烷溶剂中与氢化乳清酸室温反应2-4小时，得到Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe；
c、然后在1mol/L氢氧化锂水溶液的作用下，以四氢呋喃为溶剂，室温搅拌3-5小时获得Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH。
进一步地，所述a中Fmoc-4Aph-OMe、2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛及NaBH 3CN的摩尔比为1:1:1～1:1.5:1.5；
所述b中a制备得到的Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe、EDC、HOBt、DIPEA和氢化乳清酸的摩尔比为1:1:1:3:1～1:1.5:1.5:3.75:1.5；
所述c中b制备得到的Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe和1mol/L氢氧化锂水溶液中氢氧化锂的摩尔比为1:1～1:5。
进一步地，所述步骤1)具体包括以下步骤：
将固相载体用溶剂进行溶胀；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-Ala-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Pro-OH和偶联剂在溶剂中 溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Leu-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Ser(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-3Pal-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-4Cpa-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-2Nal-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止。
进一步地，所述溶胀用溶剂为DMF、NMP或二氯甲烷，优选为DMF。
进一步地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液。
进一步地，述偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。
进一步地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI：化合物A＝1.2：1.1，DIPEA：化合物A：化合物B＝2.0：1.1：1.0。
进一步地，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
进一步地，所述步骤2)具体包括以下步骤：采用乙酸酐和吡啶的混合溶剂与肽树脂充分混合后室温反应2-5小时进行封端，优选2-3小时，混合溶剂中乙酸酐和吡啶的摩尔用量分别为N端自由氨基的10～40倍，所述乙酸酐和吡啶的摩尔比为1:1。
进一步地，所述步骤3)中肽树脂的裂解所用裂解液为TFA和H 2O的混合物，所述TFA 和H 2O的体积比为95：5，裂解液与肽树脂的体积重量比为6-8mL:1g；所述裂解温度为室温，时间为2-4小时，优选3小时。
进一步地，沉淀粗肽时用无水乙醚，用量为裂解液的8-12倍体积，氮气吹干后得到粗肽。
进一步地，所述粗肽的合成步骤后还包括粗肽的纯化与转盐步骤。
进一步地，所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法；
所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，第一次纯化以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，于280nm波长处监测收集最大峰馏分；液相色谱仪进行检测纯度大于等于99.5％且单杂小于0.05％馏分即为第一步合格馏分，其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于90％部分再进行回收纯化，纯度小于90％作废液处理；馏分用反相色谱柱进一步转盐，于280nm波长处监测色谱峰，收集出峰馏分，浓缩至20mg/ml左右，冻干。
本发明的有益效果为：本发明用Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH替代Fmoc-4Aph(Hor)-OH为原料依序进行偶联，从而降低异构化杂质的产生。Hmb骨架保护基的存在，使得氢化乳清酸水解开环后的羧基无法进攻苯环上的氮，从而遏制了重排异构化反应，本发明抑制异构化杂质反应机理如下所示，将粗肽中异构化杂质降低至0.01％(也可能没有，为噪音)，从而减少了纯化难度，提高了纯化收率。
Figure PCTCN2020092591-appb-000005
Hmb是一种骨架保护基，通常用于收缩肽或克服困难序列的偶联(Int.J.Pept.Protein Res.1994；43:431)。其他的骨架保护基还有Dmb、Mmsb、Hmsb、Hnb等。Hmb相对于Dmb来说更有利于下一个氨基酸的偶联。相对于Mmsb、Hmsb、Hnb来说，Hmb的脱除更加方便，不需要额外的还原步骤，因此本发明选用Hmb主要作用并不是文献(Int.J.Pept.Protein Res.1994；43:431)所述用于收缩肽或克服困难序列的偶联，而是用于取代Fmoc-4Aph(Hor)-OH上侧链苄胺上的氢，如此，不但有利于下一个氨基酸的偶联，而且能抑制Hor(氢化乳清酸)在碱性条件下易发生异构化的副反应，最后裂解时随其他保护基一起裂解除去，操作方便简单。
附图说明
图1为实施例1地加瑞克粗肽HPLC谱图；
图2为实施例1地加瑞克精肽HPLC谱图；
图3为地加瑞克精肽质谱图；
图4为实施例3地加瑞克粗肽HPLC谱图；
图5为实施例3地加瑞克精肽HPLC谱图；
图6为实施例4地加瑞克粗肽HPLC谱图；
图7为实施例4地加瑞克精肽HPLC谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写及英文 含义
Boc 叔丁氧羰基
Ac 乙酰基
tBu 叔丁基
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
PyBOP 苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐
PyAOP (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐.
DIC/DIPCDI N,N’-二异丙基碳二亚胺
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸
DMF N,N-二甲基甲酰胺
TFA 三氟乙酸
DBLK 20％哌啶/DMF(V/V)溶液
DCM 二氯甲烷
EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Dmb 2,4-二甲氧基苄基
Hmb 2-羟基-4-甲氧苄基
Mmsb 2-甲氧基-4-甲磺酰苄基
Hmsb 2-羟基-4-甲氧基-5-磺酰苄基
Hnb 2-羟基-5-硝基苄基
ivDde 1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基
Hor 氢化乳清酸
iPr 异丙基
Alloc 烯丙氧羰基
Trt 三苯甲基
Mmt 对甲氧基苯基二甲基
Dmt 双(对甲氧基苯基)苯基甲基
Fmoc-D-2Nal-OH Fmoc-3-(2-萘基)-D-丙氨酸
Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH Fmoc-4-[(氨基羰基)氨基]--D-苯丙氨酸
Fmoc-D-4Cpa-OH Fmoc-4-氯-D-苯丙氨酸
Fmoc-D-3Pal-OH Fmoc-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酸
实施例1：地加瑞克的合成
步骤1：肽树脂的合成
称取Rink Amide resin(40.54g，替代度为0.37mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-D-Ala-OH(14.008g，45mmol)和HOBT(7.300g，54mmol)加入至DMF(100mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(9.15mL，58.5mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以Kaiser试剂检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，以Kaiser试剂检测树脂有颜色。重复上述偶联及脱保护操作，依序偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH。
步骤2：肽树脂的N端乙酰化
将52mL乙酸酐和吡啶的混合溶剂(摩尔比1:1)用DMF稀释至100mL后加入到固相反应柱，室温反应3个小时，Kaiser试剂检测反应终点。DMF(100mL×6)洗涤6次，再用甲醇(100mL×3)洗涤3次，每次10分钟，真空干燥肽树脂至流沙状，得到肽树脂73.08g。
步骤3：肽树脂的裂解
将实施例2得到的肽树脂73.08g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA：H 2O＝95：5(V:V)，600ml)，室温搅拌3小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入6L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤3次，氮气吹干得到粗肽29.18克，粗肽纯度95.51％，氢化乳氢酸杂质0.01％(见附图1)，收率大于100％(结合了酸根)。
步骤4：粗肽的纯化及转盐
将实施例3粗肽放至烧杯中，以约30g/L量加入40％(v/v)乙腈+60％(v/v)水溶液，超声波超声至完全溶解，使用0.45μm尼龙66微孔滤膜过滤。将色谱柱用50％乙腈冲洗干净后用5％乙腈平衡系统5分钟后，以13-15克/次的上样量进行HPLC纯化，于280nm波长处监测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度大于等于99.5％且单杂小于0.05％馏分即为合格馏分。其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于90.0％部分再进行回收纯化，纯度小于90％作废液处理。
将色谱柱用50％乙腈冲洗干净后用流动相5％乙腈平衡柱子5min上样，上样17-23克。样品若已析出聚集，加入30％醋酸超声溶解后加水稀释，按照上述梯度要求进行转盐，于280nm波长处监测色谱峰，收集出峰馏分，浓缩至20mg/ml左右。冻干后得到16.2g精肽，收率66.2％，纯度99.88％，最大单杂0.03％(见附图2)，质谱信息为1631(见附图3)。
实施例2：Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH的合成
称取Fmoc-4Aph-OMe(41.6g，0.1mol)和2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛(18.3g，1.2eqv)溶于500mL二氧六环和水(体积比为1:1)的混合溶剂中。加入NaBH 3CN(8.8g,1.4eqv)，室温反应12小时。40℃减压浓缩至粘稠状固体，加500mL乙酸乙酯溶解，依次用水和饱和食盐水洗涤，收集有机相无水硫酸钠干燥过夜，40℃减压浓缩100mL，缓慢滴加正己烷至由固体析出，继续搅拌析晶2小时后冰箱冷藏析晶过夜。过滤，40℃真空干燥得到白色固体44.1g。
将上述白色固体、EDC(19.1g,1.2eqv)、HOBt(13.0g,1.2eqv)和氢化乳清酸(15.1g,1.2eqv)用500mL二氯甲烷溶解，缓慢加入DIPEA(52.3mL，3.0eqv)室温反应3小时，减压浓缩至粘稠状固体，加500mL乙酸乙酯溶解，依次用水、饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，收集有机相用无水硫酸钠干燥过夜，40℃减压浓缩至泡沫状固体。加入500mL四氢呋喃，冰浴冷却至0℃，缓慢加入1N的氢氧化锂水溶液100mL，控制温度不超过5℃，继续在相同温度下搅拌4小时。TLC监控反应，反应完后，用柠檬酸调pH值至3，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩至100mL，缓慢滴加正己烷至由固体析出，继续搅拌析晶2小时后冰箱冷藏析晶过夜。过滤，40℃真空干燥得到白色固体45.1g，收率66.4％。
Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH合成过程如下所示。
Figure PCTCN2020092591-appb-000006
实施例3：地加瑞克的合成
本实施例步骤1采用的树脂是称取Rink Amide AM resin(替代度为0.38mmol/g)，反应时间为1.5小时。
本实施例步骤2乙酸酐和吡啶的混合溶剂封端时间为5小时，混合溶剂的摩尔用量分别为N端自由氨基的40倍。
本实施例步骤3中裂解液用量为肽树脂的7倍。室温裂解4小时，沉淀粗肽时用无水乙醚，用量为裂解液的10倍。氮气吹干后得粗肽28.92克，粗肽纯度93.97％，氢化乳氢酸杂质0.06％(见附图4)，收率大于100％(结合了酸根)。
本实施例步骤4纯化制备方法和实施例1一致。冻干后得到得到15.6g精肽，收率63.7％，纯度99.90％，最大单杂0.06％(见谱图5)。
实施例4：地加瑞克的合成
本实施例步骤1采用的树脂是称取Rink Amide MBHA resin(替代度为0.36mmol/g)，反应时间为4小时。
本实施例步骤2乙酸酐和吡啶的混合溶剂封端时间为8小时，混合溶剂的摩尔用量分别为N端自由氨基的10倍。
本实施例步骤3中裂解液用量为肽树脂的6倍。室温裂解2小时，沉淀粗肽时用无水乙醚，用量为裂解液的12倍。氮气吹干后得粗肽28.48克，粗肽纯度93.38％，氢化乳氢酸杂质 0.05％(见附图6)，收率大于100％(结合了酸根)。
本实施例步骤4纯化制备方法和实施例1一致。冻干后得到得到15.4g精肽，收率62.9％，纯度99.87％，最大单杂0.03％(见谱图7)。
对比实施例1：
专利CN201080018334实施例中制备地加瑞克总收率37％。
对比实施例2：
专利CN201110292168实施例中制备地加瑞克总收率40％，纯度99.8％。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (13)

  1. 一种地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
    1)肽树脂的偶联：按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH至固相载体上；
    2)肽树脂N端乙酰化；
    3)肽树脂裂解后获得地加瑞克粗肽。
  2. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，1)中所述固相载体为Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin或Rink Amide Resin；所述固相载体的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。
  3. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，1)中所述Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH的制备方法为：
    a、以Fmoc-4Aph-OMe为原料和2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛在NaBH 3CN的作用下进行还原氨化反应得到Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe，反应温度为室温，反应时间为10-14小时，反应溶剂为二氧六环和水混合溶剂，所述二氧六环和水的体积比为1:1。
    b、然后在EDC/HOBt/DIPEA作用下，在二氯甲烷溶剂中与氢化乳清酸室温反应2-4小时，得到Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe；
    c、然后在氢氧化锂的作用下，以四氢呋喃为溶剂，室温搅拌3-5时获得Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH。
  4. 根据权利要求3所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述Fmoc-4Aph-OMe、2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛及NaBH 3CN的摩尔比为1:1:1～1:1.5:1.5；
    所述b中a制备得到的Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe、EDC、HOBt、DIPEA和氢化乳清酸的摩尔比为1:1:1:3:1～1:1.5:1.5:3.75:1.5；
    所述c中b制备得到的Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe和1mol/L氢氧化锂水溶液中氢氧化锂的摩尔比为1:1～1:5。
  5. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下步骤：
    将固相载体用溶剂进行溶胀；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-Ala-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Pro-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Leu-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Ser(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-3Pal-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-4Cpa-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；
    脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-2Nal-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止。
  6. 根据权利要求5所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述溶胀用溶剂为DMF、NMP或二氯甲烷，优选为DMF。
  7. 根据权利要求5所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液。
  8. 根据权利要求5所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。
  9. 根据权利要求8所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI：化合物A＝1.2：1.1，DIPEA：化合物A：化合物B＝2.0：1.1：1.0。
  10. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述步骤2)具体 包括以下步骤：采用乙酸酐和吡啶的混合溶剂与肽树脂充分混合后室温反应2-5小时进行封端，优选2-3小时，混合溶剂中乙酸酐和吡啶的摩尔用量分别为N端自由氨基的10～40倍，所述乙酸酐和吡啶的摩尔比为1:1。
  11. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述步骤3)中肽树脂的裂解所用裂解液为TFA和H 2O的混合物，所述TFA和H 2O的体积比为95：5，裂解液与肽树脂的体积重量比为6-8mL:1g；所述裂解温度为室温，时间为2-4小时，优选3小时。
  12. 根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述粗肽的合成步骤后还包括粗肽的纯化与转盐步骤。
  13. 根据权利要求12所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法；
    所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，第一次纯化以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，于280nm波长处监测收集最大峰馏分；液相色谱仪进行检测纯度大于等于99.5％且单杂小于0.05％馏分即为第一步合格馏分，其余为不合格馏分，不合格馏分中纯度大于90％部分再进行回收纯化，纯度小于90％作废液处理；馏分用反相色谱柱进一步转盐，于280nm波长处监测色谱峰，收集出峰馏分，浓缩至约20mg/ml，冻干。
PCT/CN2020/092591 2019-11-29 2020-05-27 一种地加瑞克的固相合成方法 WO2021103458A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911198324.X 2019-11-29
CN201911198324.XA CN112876541B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种地加瑞克的固相合成方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021103458A1 true WO2021103458A1 (zh) 2021-06-03

Family

ID=76038394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2020/092591 WO2021103458A1 (zh) 2019-11-29 2020-05-27 一种地加瑞克的固相合成方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112876541B (zh)
WO (1) WO2021103458A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115327010A (zh) * 2022-07-25 2022-11-11 泰州兴普泰生物制药有限公司 Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329373A (zh) * 2011-09-29 2012-01-25 深圳翰宇药业股份有限公司 地加瑞克的固相合成工艺
CN102942625A (zh) * 2012-11-30 2013-02-27 南京工业大学 一种艾塞那肽固相合成方法
CN105085634A (zh) * 2015-08-29 2015-11-25 中肽生化有限公司 一种地加瑞克的制备方法
CN105294853A (zh) * 2015-11-13 2016-02-03 中肽生化有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011066386A1 (en) * 2009-11-25 2011-06-03 Novetide, Ltd. Process for production of degarelix

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329373A (zh) * 2011-09-29 2012-01-25 深圳翰宇药业股份有限公司 地加瑞克的固相合成工艺
CN102942625A (zh) * 2012-11-30 2013-02-27 南京工业大学 一种艾塞那肽固相合成方法
CN105085634A (zh) * 2015-08-29 2015-11-25 中肽生化有限公司 一种地加瑞克的制备方法
CN105294853A (zh) * 2015-11-13 2016-02-03 中肽生化有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115327010A (zh) * 2022-07-25 2022-11-11 泰州兴普泰生物制药有限公司 Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法
CN115327010B (zh) * 2022-07-25 2023-08-29 泰州兴普泰生物制药有限公司 Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112876541A (zh) 2021-06-01
CN112876541B (zh) 2023-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3398960B1 (en) Method for preparing semaglutide
EP3505533A1 (en) Synthesis method for low-racemization impurity liraglutide
US8828938B2 (en) Method for the manufacture of degarelix
US10577394B2 (en) Ganirelix precursor and method for preparing ganirelix acetate by using the same
WO2017097194A1 (zh) 一种全固相制备卡贝缩宫素的方法
CN109575109B (zh) 片段缩合制备地加瑞克的方法
CN113880935B (zh) 一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法
CN107056894B (zh) 一种片段法固相合成醋酸加尼瑞克的方法
WO2020199461A1 (zh) 一种多肽衍生化合物的合成方法
CN110903352A (zh) 一种西曲瑞克的制备方法
WO2021103458A1 (zh) 一种地加瑞克的固相合成方法
WO2020047994A1 (zh) 一种阿巴帕肽的固相合成方法
CN107778351B (zh) 一种全固相合成奥曲肽的方法
CN110642936B (zh) 一种制备特立帕肽的方法
CN111944016B (zh) 一种醋酸艾替班特的制备方法
CN110922453A (zh) 一种戈舍瑞林的合成方法
CN113929763A (zh) 一种采用可溶性的标签为载体制备司美诺肽的方法
WO2021026800A1 (zh) 醋酸地加瑞克的合成方法
CN112321699A (zh) 一种司美格鲁肽的合成方法
CN112159461B (zh) 一种西曲瑞克的合成方法
CN110724188B (zh) 一种pt141合成方法
CN113880921B (zh) 醋酸布雷默浪丹的合成方法
CN108690121A (zh) 一种奈米非肽液相制备方法
WO2009150657A1 (en) Improved process for preparation of eptifibatide by fmoc solid phase synthesis
CN110922452B (zh) 一种戈舍瑞林的合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20893079

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20893079

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1