CN113880921B

CN113880921B - 醋酸布雷默浪丹的合成方法

Info

Publication number: CN113880921B
Application number: CN202111481324.8A
Authority: CN
Inventors: 刘志国; 刘慧敏; 张飞华
Original assignee: Zhejiang Pai Peptide Biology Co ltd Nanjing Branch
Current assignee: Zhejiang Paitide Biological Co ltd Nanjing Branch
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN113880921A

Abstract

本发明提供了一种醋酸布雷默浪丹的合成方法，属于多肽的制备方法技术领域，具体为：采用Fmoc固相多肽合成法，以RinkAmide树脂为载体，用4‑三氟甲基扁桃酸对其进行修饰后，根据布雷默浪丹的多肽序列，在偶联剂作用下，从C端到N端依次缩合具有Fmoc‑保护基团的氨基酸，获得线性肽树脂；然后依次脱除Fmoc保护基，Lys、Asp等的侧链保护剂，接着在偶联剂的作用下在树脂上成环，用裂解剂将树脂裂解，碱性条件下断开酯键，得布美诺肽粗肽，最后经过纯化得到布美诺肽精肽，方法简单，所得醋酸布雷默浪丹的收率高，纯化效率高。

Description

醋酸布雷默浪丹的合成方法

技术领域

本发明属于多肽制技术领域，具体涉及一种醋酸布雷默浪丹的合成方法。

背景技术

布雷默浪丹又称布美诺肽，是一种alpha-黑素细胞刺激激素类似物，为一种环七肽结构。布雷默浪丹作为一种治疗女性性功能障碍的药物，作用机理为：通过激活大脑中的内源性途径来调节性欲和性反应，帮助伴有低活跃性性欲障碍的绝经前女性保持正常性欲。布雷默浪丹目前已完成临床III期研究，有着广阔的市场前景。

布雷默浪丹的环肽结构导致其制备困难，目前布雷默浪丹的合成技术根据成环方法可分为两类，一类是液相成环，但在液相中成环容易产生大量分子间偶联产物，产生二聚体、三聚体等多聚物，导致其合成收率低、纯度低，为了抑制副反应的发生，需要降低其反应浓度，但这会产生大量的废水，不利于环保；另一类是固相成环，固相成环过程中，肽链因空间位阻太大，难以折叠至首尾相连，因而导致成环困难，合成效率不高。

由于布雷默浪丹合成过程中存在合成收率低、纯化困难等问题，严重限制了布雷默浪丹的应用。因此有必要对现有技术进行改进，以提高布雷默浪丹的合成收率和纯度。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种醋酸布雷默浪丹的合成方法，该方法简单，成环容易，所得醋酸布雷默浪丹的收率高，纯度高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种醋酸布雷默浪丹的合成方法，所述方法包括：

S1：利用4-三氟甲基扁桃酸对RinkAmide树脂进行修饰；

S2：采用Fmoc固相多肽合成法，根据布雷默浪丹的多肽序列，在偶联剂作用下，缩合具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得线性肽树脂；

S3：将线性肽树脂用切割剂进行切割，脱除Fmoc保护基和Lys、Trp、Asp、Arg、His的侧链保护基；

S4：在偶联剂作用下，进行树脂上环化，得到布雷默浪丹树脂；

S5：利用裂解剂对布雷默浪丹树脂进行裂解脱除树脂，然后在碱性条件下水解，得布雷默浪丹粗品；

S6：利用高效液相色谱、阴离子交换色谱纯化得到高纯醋酸布雷默浪丹。

本发明通过上述步骤，采用Fmoc固相多肽合成法，以RinkAmide树脂为载体，用4-三氟甲基扁桃酸对其进行修饰后，根据布雷默浪丹的多肽序列，在偶联剂作用下，从C端到N端依次缩合具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得线性肽树脂；然后依次脱除Fmoc保护基，Lys、Asp等的侧链保护基，接着在偶联剂的作用下在树脂上成环，用裂解剂将树脂裂解，碱性条件下断开酯键，得布美诺肽粗肽，最后经过纯化得到布美诺肽精肽，方法简单，所得醋酸布雷默浪丹的收率高，纯化效率高。

进一步地，所述步骤S1中，RinkAmide树脂的替代度为0.34~0.6 mmol/g，交联度为1~2%。

进一步地，所述步骤S1的具体操作为：

将RinkAmide树脂用DCM冲洗数次，然后浸泡在DCM中10~30 min使其充分溶涨，加入哌啶/DCM混合溶液，搅拌反应20~40 min使树脂脱Fmoc保护；将4-三氟甲基扁桃酸、HOBt加入到DCM中搅拌溶解，0~5℃下预冷5~10 min，加入DIC搅拌5~15 min，然后加入树脂，室温下搅拌反应2~3 h，过滤，用DCM冲洗，即得4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂。

更进一步地，所述哌啶/DCM混合溶液中哌啶的质量百分含量为20~30%。

更进一步地，所述4-三氟甲基扁桃酸、HOBt、DIC的摩尔比为1:1~1.5:1~1.5。

更进一步地，所述RinkAmide树脂、4-三氟甲基扁桃酸的添加质量比为1:0.18~0.25。

本发明选用特定交联度、替代度的RinkAmide树脂，利用4-三氟甲基扁桃酸对树脂进行修饰，4-三氟甲基扁桃酸中的羧基与树脂中的氨基通过酰胺化反应连接，经4-三氟甲基扁桃酸修饰后的树脂中引入苯环等基团，机械强度增大，弥补了低交联度树脂溶胀过程中易破碎的缺陷，使用寿命延长，且增大了树脂的溶胀度，有利于反应物进入树脂的网络结构中，加快缩合反应速率，提高目标肽的收率和纯度，这可能是因为RinkAmide树脂经4-三氟甲基扁桃酸修饰改性后，增加了有机溶剂与树脂基团的亲和作用，容易使基团发生离解，网络结构扩张，利于反应物进入树脂的网络结构，其表面和内部暴露的反应活性点增加，增加了树脂内部反应基团与溶液中反应基团的碰撞机会，缩合反应速率加快，同时产生的副产物和溶剂等容易清洗去除，从而增大了目标肽的收率和纯度。

进一步地，所述步骤S2中，具有Fmoc-保护基团的氨基酸依次为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH。

进一步地，所述步骤S2和步骤S4中，缩合剂为DIC/HOBt、DIC/HOAT、HBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA中的任一种。

进一步地，所述步骤S3中，切割剂为包含90~95wt%TFA、1~3wt%TIS、2~3wt%糠基甲基硫醚、2~3wt%去离子水的混合溶液。

进一步地，所述步骤S5中，裂解剂为包含90~96wt%TFA、2~5wt%TIS、2~5wt%去离子水的混合溶液。

进一步地，所述步骤S5中，碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的任一种。

进一步地，所述步骤S6中，高效液相色谱条件为：

色谱填料：十八烷基硅胶，装填体积为20~50 mL；

流动相：A相为包含0.05~1vol％TFA的水溶液，B相为包含0.05~0.5vol%TFA的乙腈溶液；

洗脱梯度：30~40 minB相40~55%；

检测波长：200~220 nm；

柱温：30~45℃；

进料量：10~50 μL；

流速：80~300 mL/min。

进一步地，所述步骤S6中，阴离子交换色谱条件为：

色谱填料：Sinopak-s-DEAE，装填体积为20~80 mL；

流动相：包含0.1~2vol%的醋酸、0.03~0.05wt%三异丙醇胺、0.01~0.025wt%二甲基乙二醛肟的水溶液；

检测波长：200~220 nm；

柱温：30~40℃；

进料量：10~50 μL；

流速：50~100 mL/min。

本发明还提供前述4-三氟甲基扁桃酸修饰RinkAmide树脂在提高固相合成制备醋酸布雷默浪丹收率和纯度方面的应用。

本发明利用高效液相色谱、阴离子交换色谱组合的方法对布雷默浪丹粗品进行纯化，高效液相色谱纯化过程中，以十八烷基硅胶为色谱填料，色谱峰形对称性好，除去了粗品中的大部分杂质，然后利用阴离子交换色谱进行进一步纯化转盐，将布雷默浪丹粗品转成醋酸布雷默浪丹，阴离子交换色谱纯化过程中以包含醋酸、三异丙醇胺、二甲基乙二醛肟的水溶液为流动相，其中的三异丙醇胺、二甲基乙二醛肟与醋酸之间具有一定的协同作用，能够提高布雷默浪丹的纯化收率和纯度，这可能是因为，流动相中添加三异丙醇胺和二甲基乙二醛肟，能在一定程度上增加流动相的离子强度，相对抑制了阴离子交换色谱中布雷默浪丹与固定相的相互作用，改善分离选择性，从而提高布雷默浪丹的收率和纯度，获得纯度高于99%的醋酸布雷默浪丹。

本发明由于以4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂为载体，采用Fmoc固相多肽合成法合成布雷默浪丹，然后通过高效液相色谱法、阴离子交换色谱组合的方法对其纯化制得高纯醋酸布雷默浪丹，因而具有以下有益效果：本发明利用4-三氟甲基扁桃酸修饰后的RinkAmide树脂为载体，通过固相合成法制备醋酸布雷默浪丹，RinkAmide树脂经修饰后，弥补了低交联度树脂溶胀过程中易破碎的缺陷，使用寿命延长，溶胀度提升，空间网络结构变大，加快缩合反应的进行，提高了布雷默浪丹的收率和纯度；本发明利用高效液相色谱法、阴离子交换色谱组合的方法对布雷默浪丹粗品进行纯化，阴离子交换色谱纯化过程中，在流动相中添加三异丙醇胺、二甲基乙二醛肟，与醋酸具有一定的协同作用，可减少多肽的损失，提高纯化收率，提升醋酸布雷默浪丹的纯度。

综上所述，本发明提供了一种醋酸布雷默浪丹的合成方法，方法简单，所得醋酸布雷默浪丹的收率高达74.5%，纯度到99.8%以上。

附图说明

图1是4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂的FTIR图；图中A代表RinkAmide树脂，B代表4-三氟甲基扁桃酸修饰后的RinkAmide树脂；

图2是4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂的溶胀度测试结果示意图；

图3是布雷默浪丹粗品的纯度和收率测试结果示意图；图中B代表收率，C代表纯度；

图4是醋酸布雷默浪丹的纯度和收率测试结果示意图；图中B代表总收率，C代表纯度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明中，使用的缩写含义如下：

Fmoc 9-芴甲氧羰基

Lys 赖氨酸

Boc 叔丁氧羰基

Trp 色氨酸

D-Phe D-丙氨酸

Arg 精氨酸

Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基

His 组氨酸

Asp 天冬氨酸

OtBu 叔丁氧基

Nel 新亮氨酸

DCM 二氯甲烷

HOBt 1-羟基苯并三唑

DIC N,N-二异丙基碳二亚胺

HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑

HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

DIEA N,N-二异丙基乙胺

HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

TFA 三氟乙酸

TIS 三异丙基硅烷

Trt 三苯甲基

DMF N,N-二甲基甲酰胺（不知道有没有）

DMAP 4-二甲氨基吡啶。

实施例1：

一种4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂的制备方法：

1)将100 gRinkAmide树脂（替代度为0.45 mmol/g、交联度为1%）用DCM冲洗5次后，浸于500 mLDCM中20 min使其充分溶涨，将树脂加入到500 mL哌啶/DCM混合溶液（哌啶的质量百分含量为25%）中，搅拌反应30min使树脂脱Fmoc保护；

2)将22 g4-三氟甲基扁桃酸、25.4 gHOBt加入到300 mLDCM中搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入15.2 gDIC搅拌10 min，然后加入树脂，室温下搅拌反应2.5 h，过滤，用DCM冲洗6遍，即得。

将RinkAmide树脂和4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂进行红外光谱分析，测得结果如图1所示。

观察图1，A表示未经修饰的RinkAmide树脂，B为经4-三氟甲基扁桃酸修饰后的RinkAmide树脂，可以看出，相比曲线A中，曲线B在3445 cm^-1出现OH的特征吸收峰，这归属于引入的4-三氟甲基扁桃酸中的-OH，曲线B还在1335 cm^-1、735 cm^-1附近出现C-F的特征吸收峰，说明4-三氟甲基扁桃酸成功引入到RinkAmide树脂上。

实施例2：

一种布雷默浪丹树脂的制备方法，所述方法包括：

1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂：

以实施例1所得4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂为载体，将树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将70.2gFmoc-Lys(Boc)-OH与36g HOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5gDIC搅拌8 min，然后加入到树脂中，搅拌反应10 min后，加入2 gDMAP，室温下搅拌反应3.5h，加入46 g醋酸酐、35.5 g吡啶，室温下反应40 min，用DCM洗涤6次，即得式(1)所示Fmoc-Lys(Boc)-树脂，

(1)；

2)制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂：

将步骤1)所得Fmoc-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将79 gFmoc-Trp(Boc)-OH、36 gHOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5 gDIC，搅拌10 min，然后加入到树脂中，室温下搅拌反应2.5 h，用DCM洗涤6次，即得式(2)所示Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂，

(2)；

3)制备Fmoc-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-PAS-树脂：

将步骤2)所得Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将97.3 gFmoc-Arg(pbf)-OH、36gHOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5 gDIC，搅拌15 min，然后加入到树脂中，室温下搅拌反应2 h，用DCM洗涤6次，即得式(3)所示Fmoc-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-PAS-树脂，

(3)；

4)制备Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂：

将步骤3)所得Fmoc-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-PAS-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液（哌啶的质量百分含量为25%）中反应20 min，用DCM冲洗5次；将58 gFmoc-D-Phe-OH、36 gHOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5 gDIC，搅拌20 min，然后加入到-树脂中，室温下搅拌反应3 h，用DCM洗涤6次，即得式(4)所示Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂，

(4)；

5)制备Fmoc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂：

将步骤4)所得Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将93 gFmoc-His(Trt)-OH、36 gHOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5 gDIC，搅拌15min，然后加入到树脂中，室温下搅拌反应33 h，用DCM洗涤6次，即得式(5)所示Fmoc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂，

(5)；

6)制备Fmoc-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂：

将步骤5)所得Fmoc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将62gFmoc-Asp(OtBu)-OH、36 gHOBt、300 mLDCM混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5gDIC，搅拌10 min，然后加入到树脂中，室温下搅拌反应2 h，树脂用DCM洗涤6次，即得式(6)所示Fmoc-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂，

(6)；

7)制备Fmoc-Nle-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂：

将步骤6)所得Fmoc-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液（哌啶的质量百分含量为25%）中反应20 min，用DCM冲洗5次；将53 gFmoc-Nle-OH、36gHOBt、300mLDMF混合，搅拌溶解，0℃下预冷10 min，加入21.5gDIC，搅拌20 min，然后加入到树脂中，室温下搅拌反应2~3 h，用DCM洗涤6次，即得式(7)所示Fmoc-Nle-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂，

(7)；

8)制备线性AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-树脂：

将步骤7)所得Fmoc-Nle-Asp(OtBu)-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-树脂加入到哌啶/DCM混合溶液(哌啶的质量百分含量为25%)中反应20 min，用DCM冲洗5次；将45 mL乙酸酐、40 mL吡啶、200 mLDCM混合搅拌均匀，然后加入到树脂中，室温下搅拌1 h，用DCM冲洗6次，再然后将树脂溶于1 L切割剂中，室温下搅拌裂解3 h，裂解结束后，加入到8 L冰冻的甲基叔丁基醚中，析出固体并过滤，用甲基叔丁基醚洗涤固体5遍，干燥得式(8)所示线性AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-树脂；其中，所述切割剂为包含93wt%TFA、2wt%TIS、2.5wt%糠基甲基硫醚、1.5wt%去离子水的混合溶液；

(8)；

9)制备布雷默浪丹树脂：

将57 gHBTU、20.3 gHOBt加入到300 mLDCM中溶解，0℃下预冷10 min，加入到步骤8)所得的线性AC-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-树脂中，加入23 gDIEA，室温下下搅拌环化3 h，然后用DCM、甲醇交替洗涤3次，干燥即得。

实施例3：

一种布雷默浪丹粗品的制备方法：

1)裂解：将TFA:TIS:去离子水按照质量比93:3:4混合均匀得到裂解剂，-20℃下预冷1 h，将实施例2所得布雷默浪丹树脂加入到1 L裂解剂中，0℃下反应1 h，升至室温反应3h脱除树脂，滤除树脂，搅拌条件下将滤液加入14 L预冻的甲基叔丁基醚中，析出大量白色物质，离心，收集离心所得固体，并用甲基叔丁基醚洗涤至中性，干燥；

2)酯键水解：步骤1)产物溶于20wt%乙腈水溶液中，冰浴搅拌条件下用1 mol/L的NaOH水溶液调节pH=12，0℃下反应0.5 h，升至30℃继续反应1 h，离心除析出的白色物质，上清液用1 mol/L的HCl水溶液调节至中性即得，-20℃下保存备用。

实施例4：

一种高纯醋酸布雷默浪丹的制备方法：

1)将实施例3所得布雷默浪丹粗品在室温下解冻，用0.45 μm的滤膜过滤；

2)用十八烷基硅胶色谱填料进行高效液相色谱进行纯化，所述高效液相色谱条件为：填料装填体积为30 mL，流动相A为包含0.2vol％TFA的水溶液，流动相B为包含0.1vol%TFA的乙腈溶液，洗脱梯度为40minB相50%，检测波长为210 nm，柱温为40℃，进料量为40 μL，流速：150 mL/min，收集目标峰，并减压浓缩至40 mg/mL；

3)用Sinopak-s-DEAE色谱填料进行阴离子交换色谱纯化，以包含1vol%的醋酸、0.035wt%三异丙醇胺、0.02wt%二甲基乙二醛肟的水溶液为流动相，检测波长为210 nm，流速为80 mL/min，柱温为35℃，收集目标峰，减压浓缩、冷冻干燥获得高纯醋酸布雷默浪丹。

实施例5：

另一种布雷默浪丹粗品的制备方法，所述步骤与实施例1~3基本相同，不同之处在于，所述4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂制备过程中，4-三氟甲基扁桃酸的添加量为RinkAmide树脂的0.15倍，即15 g；并应用与实施例1~3其余步骤相同的方法制备得到布雷默浪丹粗品。

实施例6：

另一种布雷默浪丹粗品的制备方法，所述步骤与实施例1~3基本相同，不同之处在于，所述4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂制备过程中，4-三氟甲基扁桃酸的添加量为RinkAmide树脂的0.18倍，即18 g；并应用与实施例1~3其余步骤相同的方法制备得到布雷默浪丹粗品。

实施例7：

另一种布雷默浪丹粗品的制备方法，所述步骤与实施例1~3基本相同，不同之处在于，所述4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂制备过程中，4-三氟甲基扁桃酸的添加量为RinkAmide树脂的0.25倍，即25 g；并应用与实施例1~3其余步骤相同的方法制备得到布雷默浪丹粗品。

实施例8：

另一种布雷默浪丹粗品的制备方法，所述步骤与实施例1~3基本相同，不同之处在于，所述4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂制备过程中，4-三氟甲基扁桃酸的添加量为RinkAmide树脂的0.3倍，即30 g；并应用与实施例1~3其余步骤相同的方法制备得到布雷默浪丹粗品。

实施例9：

另一种布雷默浪丹粗品的制备方法，所述步骤与实施例1~3基本相同，不同之处在于，以替代度为0.45 mmol/g、交联度为1%的RinkAmide树脂为载体，相应地，制备布雷默浪丹粗品过程中仅有裂解步骤，无酯键水解步骤。

实施例10：

另一种高纯醋酸布雷默浪丹的制备方法，所述步骤与实施例4基本相同，不同之处在于，阴离子交换色谱纯化过程中，流动相中未添加异丙醇胺，即流动相为包含1vol%的醋酸、0.02wt%二甲基乙二醛肟的水溶液。

实施例11：

另一种高纯醋酸布雷默浪丹的制备方法，所述步骤与实施例4基本相同，不同之处在于，阴离子交换色谱纯化过程中，流动相中未添加二甲基乙二醛肟，即流动相为包含1vol%的醋酸、0.035wt%异丙醇胺的水溶液。

实施例12：

另一种高纯醋酸布雷默浪丹的制备方法，所述步骤与实施例4基本相同，不同之处在于，阴离子交换色谱纯化过程中，流动相中未添加异丙醇胺、二甲基乙二醛肟，即流动相为1vol%的醋酸水溶液。

试验例1：

4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂的溶胀度测试：

以实施例1、5~9中的4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂、RinkAmide树脂为样品，称取样品1.00 g，分别放入具塞量筒内，并分别加入DCM至同一刻度并除去气泡，盖紧塞子，使树脂充分溶胀4 h，不断将量筒震荡至树脂堆积紧密，树脂体积不再变化为止，读其体积数，并计算溶胀度：

溶胀度(mL/g)=树脂溶胀后的体积/树脂的质量。

测得树脂的溶胀度结果如图2所示。

从图2可以看出，本发明选用替代度为0.45 mmol/L、交联度为1%的RinkAmide树脂，其未经4-三氟甲基扁桃酸修饰前在DCM中的溶胀度为5.8 mL/g，在经4-三氟甲基扁桃酸修饰后，树脂的溶胀度明显增大，有助于提供更大的网络空间，利于反应物进入树脂的网络结构中，加快缩合反应速率，从而提高目标肽的收率和纯度；还可以看出，利用4-三氟甲基扁桃酸修饰RinkAmide树脂过程中，随着4-三氟甲基扁桃酸添加量的增大，树脂的溶胀度逐渐提升，然而当4-三氟甲基扁桃酸添加过量时，溶胀度反而减小，这可能是因为树脂经4-三氟甲基扁桃酸修饰改性后，溶剂与树脂上的基团的亲和作用增大，容易使基团发生离解，网络结构扩张，溶剂易进入树脂网络结构中，而4-三氟甲基扁桃酸过量时，反应生成的酰胺分子较多，容易发生分子间的氢键缔合，加上分子间偶极的相互吸引，阻止了树脂的溶胀，从而导致溶胀度降低。由此可知，RinkAmide树脂用特定量的4-三氟甲基扁桃酸修饰改性后，有助于提升溶胀度，提高目标肽的收率和纯度。

试验例2：

布雷默浪丹粗品的收率和纯度：

以实施例3、5~9所得布雷默浪丹粗品为样品，利用高效液相色谱测试其纯度，并根据反应物于产物的摩尔量计算其摩尔收率，测试结果如图3所示。

从图3中可以看出，经本发明所述方法合成的布雷默浪丹粗品的收率达90%以上，纯度达89%以上，纯度和收率高；对比实施例3、5~9中数据可知，RinkAmide树脂的使用对布雷默浪丹的收率和纯度具有显著的影响，实施例9所得收率和纯度均最低，说明相比RinkAmide树脂，经4-三氟甲基扁桃酸修饰改性后的RinkAmide树脂作为载体合成布雷默浪丹粗品，有利于提高目标肽的收率和纯度，这可能与树脂的溶胀度有关；还可以看出，实施例5、8所得收率和纯度明显低于实施例3，而实施例6、7所得收率和纯度与实施例1相差较小，这说明仅当以特定量的4-三氟甲基扁桃酸对RinkAmide树脂进行修饰改性，才更有利于提升目标肽的收率和纯度。

试验例3：

高纯醋酸布雷默浪丹的收率和纯度：

以实施例4、10~12所得高纯醋酸布雷默浪丹为样品，利用高效液相色谱测试其纯度，并计算总收率，测试结果如图4所示。

从图4可以看出，经本发明所述方法制得的高纯醋酸布雷默浪丹的纯度最高达99.8%。总收率达74.5%，对比实施例4和10~12，实施例4和10~12提供的方法中不同之处在于纯化过程中，阴离子交换色谱纯化过程所用流动相不同，实施例4的流动相中添加了异丙醇胺和二甲基乙二醛肟，其所得高纯醋酸布雷默浪丹的纯度和收率较高，实施例10和11为流动相中仅添加异丙醇胺或二甲基乙二醛肟，其所得高纯醋酸布雷默浪丹的纯度和收率明显低于实施例4，而实施例12的流动相中未添加异丙醇胺和二甲基乙二醛肟，其所得高纯醋酸布雷默浪丹的纯度和收率与实施例4相比差距显著，这说明阴离子交换色谱纯化过程中流动相的选择对高纯醋酸布雷默浪丹的纯化效率具有较大的影响，流动相中同时添加异丙醇胺和二甲基乙二醛肟，与醋酸之间具有协同作用，一定程度上能增加流动相的离子强度，改善分离选择性，从而提高布雷默浪丹的收率和纯度。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种醋酸布雷默浪丹的合成方法，其特征在于，所述方法包括：

S1：利用4-三氟甲基扁桃酸对RinkAmide树脂进行修饰；

S6：利用高效液相色谱、阴离子交换色谱纯化得到高纯醋酸布雷默浪丹；

所述步骤S1的具体操作为：

将RinkAmide树脂用DCM冲洗数次，然后浸泡在DCM中10~30 min使其充分溶涨，加入哌啶/DCM混合溶液，搅拌反应20~40 min使树脂脱Fmoc保护；将4-三氟甲基扁桃酸、HOBt加入到DCM中搅拌溶解，0~5℃下预冷5~10 min，加入DIC搅拌5~15 min，然后加入树脂，室温下搅拌反应2~3 h，过滤，用DCM冲洗，即得4-三氟甲基扁桃酸修饰的RinkAmide树脂；

所述步骤S1中，RinkAmide树脂、4-三氟甲基扁桃酸的添加质量比为1:0.18~0.25。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，RinkAmide树脂的替代度为0.34~0.6mmol/g，交联度为1~2%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有Fmoc-保护基团的氨基酸依次为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2和步骤S4中，偶联剂为DIC/HOBt、DIC/HOAT、HBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA中的任一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，切割剂为包含90~95wt%TFA、1~3wt%TIS、2~3wt%糠基甲基硫醚、2~3wt%去离子水的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，裂解剂为包含90~96wt%TFA、2~5wt%TIS、2~5wt%去离子水的混合溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，阴离子交换色谱纯化过程中，

色谱填料：DEAE高流速琼脂糖微球，装填体积为20~80mL；

流动相：包含0.1~2vol%的醋酸、0.03~0.05wt%三异丙醇胺、0.01~0.025wt%二甲基乙二醛肟的水溶液。

8.权利要求1中所述的4-三氟甲基扁桃酸修饰RinkAmide树脂在提高固相合成制备醋酸布雷默浪丹收率和纯度的应用。