CN112010945B - 一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了卡贝缩宫素杂质Gly9‑OH的制备方法，采用固相合成和液相合成结合合成主链树酯。采用2‑CTC Resin，Boc‑Tyr(Me)‑OH,Fmoc‑Ile‑OH,Fmoc‑Gln(X)‑OH,Fmoc‑Asn(X)‑OH、Fmoc‑Cys((CH2)3COOtBu)‑OH、Fmoc‑Pro‑OH和Fmoc‑Leu‑OH作为起始原料参与合成树脂主链，通过裂解获得粗肽纯度高于95％。通过液相缩合接上H‑Gly‑OBzl得到带保护基的直链肽杂质，再脱掉Boc、Trt和tBu并关环得到环化中间肽，最后氢化脱苄基得到Gly9‑OH粗品，纯化后得到纯度大于99.5％的产品，收率大于60％。

Description

一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其是涉及一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法。
背景技术
卡贝缩宫素杂质Gly9-OH序列：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH
分子结构式如下：
Figure BDA0002677745620000011
卡贝缩宫素是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，在工艺合成和存放过程中会产生杂质Gly9-OH,此杂质在生产研究中会一直使用，而此杂质的合成工艺不能沿用卡贝缩宫素工艺进行研究，因此开发一类合成此杂质的合成工艺，有利于该杂质的批量生产是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，本发明提供的制备方法收率和纯度高。
本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；
步骤2：根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂；所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys((CH2)3COOtBu)-OH、Y-Tyr(Me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(X)-OH和Fmoc-Asn(X)-OH中的任一种或多种；
步骤3：将所述Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr(Me)-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH；
步骤4：将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)；
步骤5：将所述H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)液相环化得到环化中间肽Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)；
步骤6：将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH。
优选的，所述树脂选自CTC Resin或2-CTC Resin。
优选的，所述X为H、Mmt、Mtt或Trt。
优选的，所述Y为Fmoc或Boc。
优选的，所述Z为All或Bzl。
优选的，所述Fmoc保护基的脱除剂是10％～50％体积浓度的哌啶或哌嗪的DMF溶液。
优选的，所述述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、TIS、TFE和H2O的混合物。
优选的，所述偶联剂为HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。
优选的，步骤2所述偶联具体为依次偶联：
Fmoc-Cys((CH2)3COOtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH。
优选的，所述纯化为采用Prep-HPLC纯化。
与现有技术相比，本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，包括：步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；步骤2：根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂；所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys((CH2)3COOtBu)-OH、Y-Tyr(Me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(X)-OH和Fmoc-Asn(X)-OH中的任一种或多种；步骤3：将所述Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr(Me)-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-OH；步骤4：将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)；步骤5：将所述H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)液相环化得到Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)；步骤6：将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH。本发明通过固相合成和液相合成结合的工艺，操作简便，大大缩短了工艺的合成周期。通过固液结合合成方法提高了卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类。
附图说明
图1为本发明实施例1产品的HPLC色谱图；
图2为本发明实施例2产品的HPLC色谱图；
图3为本发明实施例3产品的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；
步骤2：根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂；所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys((CH2)3COOtBu)-OH、Y-Tyr(Me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(X)-OH和Fmoc-Asn(X)-OH中的任一种或多种；
步骤3：将所述Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr(Me)-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH2)3COOtBu)-Leu-OH；
步骤4：将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)；
步骤5：将所述H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)液相环化得到环化中间肽Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)；
步骤6：将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH。
本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，首先固相合成Fmoc-Leu-树脂。
优选具体为：取Fmoc-Leu-OH与树脂偶联，Fmoc-Leu-树脂。
取树脂加入到固相反应柱中，采用溶剂溶胀树脂，而后将Fmoc-Leu-OH偶联剂溶解在溶剂中，冰浴下活化，加入固相反应柱中，反应，用溶剂洗涤，抽干，进行下一步反应。
上述溶剂包括但不限于DMF。
所述偶联剂优选选自HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。所述偶联剂与Fmoc-Leu-OH的摩尔为1：1～1：5。
本发明所述树脂选自CTC Resin或2-CTC Resin。本发明对其来源不进行限定，市售即可。
其中，所述溶胀的时间优选为20～30min；所述活化的时间优选为10～15min；所述反应时间优选为1.5～2h。
根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-树脂。
本发明所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH、Y-Tyr(Me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(X)-OH和Fmoc-Asn(X)-OH中的任一种或多种。
首先用Fmoc保护基的脱除剂脱保护，用溶剂洗涤，而后将Fmoc-Pro-OH、偶联剂溶解在溶剂中，冰浴下活化，加入固相反应柱中，反应，用溶剂洗涤，抽干直接偶联下一个氨基酸。
其中，本发明所述述Fmoc保护基的脱除时间为10～15min。所述溶胀的时间优选为20～30min；所述活化的时间优选为10～15min；所述反应时间优选为1.5～2h。所述偶联剂优选选自HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。所述偶联剂的用量为1.0eq～5.0eq
而后依次按照上述步骤偶联氨基酸，最后用MeOH(100ml)收缩两次，并干燥。
按照本发明，所述Fmoc保护基的脱除剂优选为10％～50％体积浓度的哌啶或哌嗪的DMF溶液；更优选为20％～40％体积浓度的哌啶或哌嗪的DMF溶液。所述Fmoc保护基的脱除剂的用量为每克树脂用5ml～30ml之间。
本发明偶联具体为依次偶联：
Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH。
将所述Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr(Me)-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH；
本发明所述X为保护基，可以为H、Mmt、Mtt或Trt。所述Y为保护基，Fmoc或Boc。
本发明所述述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、TIS、TFE和H2O的混合物。
所述TFA、PhSMe、EDT、TIS、TFE和H2O的体积比为100:(0～10):(0～10):(0～10):(0～10):(0～10)
所述裂解液的用量为每克树脂用5ml～30ml之间。
所述裂解时间为30～60min。所述裂解的次数优选为2次，合并裂解液，旋干得到固体粗肽。
将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)。
本发明所述Z为保护基，为All或Bzl。
本发明将卡贝缩宫素杂质直链粗品溶解在溶剂中，冰浴下加入偶联剂活化，将H-Gly-O(Z)加入到活化液中，搅拌反应，而后采用溶剂沉降、离心，用溶剂洗涤干燥得到。
上述溶剂包括但不限于甲基叔丁基醚。
所述偶联剂优选选自HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。所述偶联剂的用量为1.0eq～5.0eq所述活化的时间优选为10～15min；所述反应时间优选为1.5～2h。所述沉降的温度为0℃；所述洗涤的次数优选为2～3次。所述干燥优选为真空干燥，本发明对于所述具体的干燥参数不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
偶联得到Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH；而后为脱保护，具体为将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH加入TFA(浓度为每克中间体用TFA量为1ml～200ml或1ml以上)中搅拌反应，采用溶剂沉降、离心、洗涤、干燥得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH。
所述搅拌反应的温度为室温，所述搅拌反应的时间为20～30min，上述溶剂包括但不限于甲基叔丁基醚。所述沉降的温度为0℃；所述洗涤的次数优选为2～3次。所述干燥优选为真空干燥，本发明对于所述具体的干燥参数不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
将所述H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)液相环化得到环化中间肽Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)。
将H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)溶解在溶剂中，加入环化试剂DIEA、氮甲基吗啉、HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。搅拌反应，采用溶剂沉降、离心、洗涤、干燥得到Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)。
本发明所述环化的试剂优选为HBTU和DIEA中的一种或几种；所述环化试剂的用量为1.0eq～5.0eq所述溶剂包括但不限于DMF。所述搅拌反应的温度为室温，所述搅拌反应的时间为20～30min，上述溶剂包括但不限于甲基叔丁基醚。所述沉降的温度为0℃；所述洗涤的次数优选为2～3次。所述干燥优选为真空干燥，本发明对于所述具体的干燥参数不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH。
即为最后脱掉保护基Z，再通过纯化得到目标产品。
将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)溶解在溶剂中，而后脱保护基。
所述脱保护基优选具体为：苄基、Alloc、甲基、乙基等脂肪链，采用Pd/C并通入氢气反应；
或采用四三苯基磷钯和苯硅烷在氮气保护下反应，
或与一水氢氧化锂的水的溶液混合搅拌反应。
而后采用Prep-HPLC纯化，冻干，得到Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH。
本发明实施例采用的Prep-HPLC纯化方法如下：粗品用20％醋酸溶液溶解后，采用Waters RP-HPLC系统纯化，波长220nm，色谱柱为50X250mm反相C18柱，流动相为0.2％醋酸溶液/乙腈。
本发明采用2-CTC Resin，Boc-Tyr(Me)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Gln(X)-OH,Fmoc-Asn(X)-OH、Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Leu-OH作为起始原料参与合成树脂主链，通过裂解获得的粗肽纯度高于95％。然后通过液相缩合接上H-Gly-OBzl得到带保护基的直链肽杂质，再脱掉Boc、Trt和tBu并关环得到环化中间肽，最后氢化脱苄基得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH粗品，且纯化后得到纯度大于99.5％的产品，收率大于60％。通常情况下，多肽水解杂质的合成直接采用酰胺水解反应，该类反应往往选择性不好，且容易产生其他消旋杂质，导致纯化困难，收率不高。本发明创新性地采用了固相和液相相结合的合成工艺，操作简便，步骤短，工艺合成时间短，杂质少，易于纯化，适合放大合成。
本发明提供了一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，包括：步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；步骤2：根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-树脂；所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH、Y-Tyr(Me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(X)-OH和Fmoc-Asn(X)-OH中的任一种或多种；
步骤3：将所述Y-Tyr(Me)-OH-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr(Me)-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH；步骤4：将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)；步骤5：将所述H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-O(Z)液相环化得到Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)；步骤6：将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH。本发明通过固相合成和液相合成结合的工艺，操作简便，大大缩短了工艺的合成周期。通过固液结合合成方法提高了卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类。
本发明提供的多肽的制备方法中所用氨基酸及试剂均可由市场购得。
缩写及英文含义
缩写及英文 含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
HOBT 1-羟基苯并三唑
Cl-HOBT 6-氯-1-羟基苯并三氮唑
HOAT
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
TFA 三氟乙酸
PhSMe 苯甲硫醚
TIS 三异丙基硅烷
EDT 乙二硫醇
DIPEA N,N-二异丙基乙胺。
HBTU 苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯
PyBop 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
DCC 二环己基碳二亚胺
NMM N-甲基吗啉
DIEA N,N-二异丙基乙胺
TEA 三乙胺
Mmt 对甲氧基三苯甲基
Mtt 对甲基三苯甲基
Trt 三苯甲基
t-Bu 叔丁基
下面结合实施例，进一步阐述发明：
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法进行详细描述。
本发明实施例采用的HPLC分析的色谱条件如下：
色谱条件：
色谱柱：XBridge C18，150*3.0mm，3.5μm；
流动相：流动相A：醋酸铵缓冲液(称取醋酸铵0.20g，加水800ml溶解，再加4mlPICB-8Low UV试剂，加水稀释至1000ml)；流动相B：乙腈；
流速：0.8ml/min；
波长：220nm；
柱温：60℃；
进样量：10μl；
梯度条件：
Figure BDA0002677745620000101
实施例1
步骤1：Fmoc-Gly-2-CTC Resin的合成
称取替代度为1.5mmol/g的2-CTC Resin 6.681g，加入到固相反应柱中，用DCM(100ml)溶胀树脂30分钟。称取7.110g的Fmoc-Leu-OH(20.0mmol)和2.713g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.581g的HBTU(8.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接用于下一步反应。
步骤2：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTCResin的合成
用DBLK(20％哌啶/DMF，100ml)脱除Fmoc保护10分钟，脱两次保护，然后用DMF(100ml)洗涤6次。称取6.731g的Fmoc-Pro-OH(20.0mmol)和2.713g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.581g的HBTU(8.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接偶联下一个氨基酸。
按照以上操作依次偶联以下氨基酸Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH得到树脂Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTC Resin，树脂用DCM(100ml)和MeOH(100ml)交叉洗涤3次，最后用MeOH(100ml)收缩两次，并干燥。
步骤3：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH的合成
用200ml/次/30min的DCM:TFE＝4:1(体积比)裂解反应2次，合并裂解液并将其旋干得到白色固体18.231g(纯度98.6％)。
步骤4：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-Gly-OBzl的合成
将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH(18.231g)溶于100ml的DMF中，冰浴下加入2.713g的HOBt(20.0mmol)、7.723g的HBTU(8.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min。将2.023g的H-Gly-OBzl(10.0mmol)加入活化好的活化液中，在室温条件下搅拌反应2h。用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到17.151g(纯度70.5％)的Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH。
步骤5：H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OBzl的合成
将H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OBzl(17.151g)加入TFA(100ml)中室温条件下搅拌反应30min，用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到11.151g(纯度60.5％)的H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH。
步骤6：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tye(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OBzl的合成
将H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH(11.151g)溶于223ml的DMF溶液中，加入4.211g的HBTU(11mmol)和DIEA(5.2ml)，在室温条件下搅拌反应30min。用0℃的4.5L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到11.312g(纯度52.5％)的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OBzl。
步骤7：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH的合成
将11.312g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OBzl溶解于110ml的甲醇中，加入553mg的Pd/C并通入氢气反应5h。反应完成过滤并用甲醇(50ml)洗涤3次。浓缩后得到的10.137g(51.2％)粗品，通过Prep-HPLC纯化、冻干得到6.544g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH，总收率为64.38％。
本发明实施例1产品的HPLC色谱图如图1所示。由图1可以的得出，纯度99.82％。
实施例2
步骤1：Fmoc-Gly-2-CTC Resin的合成
称取替代度为1.5mmol/g的2-CTC Resin 6.711g，加入到固相反应柱中，用DCM(100ml)溶胀树脂30分钟。称取7.105g的Fmoc-Leu-OH(20.0mmol)和2.723g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.593g的HBTU(20.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接用于下一步反应。
步骤2：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTCResin的合成
用DBLK(20％哌啶/DMF，100ml)脱除Fmoc保护10分钟，脱两次保护，然后用DMF(100ml)洗涤6次。称取6.735g的Fmoc-Pro-OH(20.0mmol)和2.711g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.584g的HBTU(20.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接偶联下一个氨基酸。
按照以上操作依次偶联以下氨基酸Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH得到树脂Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTC Resin，树脂用DCM(100ml)和MeOH(100ml)交叉洗涤3次，最后用MeOH(100ml)收缩两次，并干燥。
步骤3：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH的合成
用200ml/次/30min的DCM:TFE＝4:1(体积比)裂解反应2次，合并裂解液并将其旋干得到白色固体18.825g(纯度98.1％)。
步骤4：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-Gly-OMe的合成
将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH(18.825g)溶于100ml的DMF中，冰浴下加入7.579g的2.722g的HOBt(20.0mmol)、7.611g的HBTU(8.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min。将0.893g的H-Gly-OMe(10.0mmol)加入活化好的活化液中，在室温条件下搅拌反应2h。用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到16.313g(纯度70.5％)的Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-Gly-OMe。
步骤5：H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OMe的合成
将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-Gly-OMe(16.313g)加入TFA(100ml)中室温条件下搅拌反应30min，用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到10.162g(纯度59.8％)的H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OMe。
步骤6：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OBzl的合成
将H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OMe(10.162g)溶于223ml的DMF溶液中，加入4.222g的HBTU(11mmol)和DIEA(5.2ml)，在室温条件下搅拌反应30min。用0℃的4.5L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到9.957g(纯度52.1％)的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OMe。
步骤7：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH的合成
将11.312g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OMe溶解于40ml的甲醇中，加入一水氢氧化锂(0.841g)的水(20ml)的溶液，搅拌反应3h。反应完成用1N的HCl将反应液的PH调至中性，得到的溶液直接通过Prep-HPLC纯化冻干得到3.763g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH，总收率为35.03％。
本发明实施例2产品的HPLC色谱图如图2所示。由图2可以的得出，纯度为97.98％。
实施例3
步骤1：Fmoc-Gly-2-CTC Resin的合成
称取替代度为1.5mmol/g的2-CTC Resin 6.693g，加入到固相反应柱中，用DCM(100ml)溶胀树脂30分钟。称取7.101g的Fmoc-Leu-OH(20.0mmol)和2.756g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.532g的HBTU(20.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接用于下一步反应。
步骤2：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTCResin的合成
用DBLK(20％哌啶/DMF，100ml)脱除Fmoc保护10分钟，脱两次保护，然后用DMF(100ml)洗涤6次。称取6.695g的Fmoc-Pro-OH(20.0mmol)和2.705g的HOBt(20.0mmol)溶于DMF(100ml)溶液中，冰浴下加入7.613g的HBTU(20.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF(100ml)洗涤6次，抽干直接偶联下一个氨基酸。
按照以上操作依次偶联以下氨基酸Fmoc-Cys((CH3)3COOtBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH得到树脂Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-2-CTC Resin，树脂用DCM(100ml)和MeOH(100ml)交叉洗涤3次，最后用MeOH(100ml)收缩两次，并干燥。
步骤3：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-OH的合成
用200ml/次/30min的DCM:TFE＝4:1(体积比)裂解反应2次，合并裂解液并将其旋干得到白色固体18.012g(纯度98.7％)。
步骤4：Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH3)3COOtBu)-Leu-Gly-OAll的合成
将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-OH(18.012g)溶于100ml的DMF中，冰浴下加入2.705g的HOBt(20.0mmol)、7.539g的HBTU(20.0mmol)和DIEA(5.2ml)活化10min。将1.156g的H-Gly-OAll(10.0mmol)加入活化好的活化液中，在室温条件下搅拌反应2h。用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到16.622g(纯度68.7％)的Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-Gly-OAll。
步骤5：H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OAll的合成
将Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2)3COOtBu)-Pro-Leu-Gly-OAll(16.622g)加入TFA(100ml)中室温条件下搅拌反应30min，用0℃的2L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到10.018g(纯度65.4％)的H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OAll。
步骤6：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OAll的合成
将H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys((CH3)3COOH)-Leu-Gly-OAll(10.018g)溶于223ml的DMF溶液中，加入4.255g的HBTU(11mmol)和DIEA(5.2ml)，在室温条件下搅拌反应30min。用0℃的4.5L甲基叔丁基醚搅拌沉降，并离心。最后将固体用300ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到10.618g(纯度56.3％)的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OAll。
步骤7：Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH的合成
将10.618g g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OAll溶解于110ml的DMF中，加入1.163g的四三苯基磷钯和苯硅烷(2.193g，20mmol)，在氮气保护下室温搅拌反应30分钟。反应完后直接过滤，并通过Prep-HPLC纯化冻干得到5.897g的Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-OH，总收率为58.53％。
本发明实施例3产品的HPLC色谱图如图3所示。由图3可以得出，纯度为99.74％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；
步骤2：根据卡贝缩宫素杂质Gly9-OH的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上偶联氨基酸，得到Y-Tyr（Me）-OH-Ile-Gln（X）-Asn（X）-Cys（（CH2）3COOtBu）-Leu-树脂；所述氨基酸选自Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys（（CH2）3COOtBu）-OH、Y-Tyr（Me）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln（X）-OH和Fmoc-Asn（X）-OH中的任一种或多种；所述偶联具体为依次偶联：
Fmoc-Cys（（CH2）3COOtBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH和Boc-Tyr(Me)-OH；
步骤3：将所述Y-Tyr（Me）-OH-Ile-Gln（X）-Asn（X）-Cys（（CH2）3COOtBu）-Leu-树脂裂解，得到卡贝缩宫素杂质直链粗品Y-Tyr（Me）-Ile-Gln(X)-Asn(X)-Cys（（CH2）3COOtBu）-Leu-OH；
步骤4：将卡贝缩宫素杂质直链粗品通过液相缩合偶联H-Gly-O(Z)，而后脱掉X、Y和tBu保护基得到H-Tyr（Me）-Ile-Gln-Asn-Cys（（CH2）3COOH）-Leu-Gly-O(Z)；
步骤5：将所述H-Tyr（Me）-Ile-Gln-Asn-Cys（（CH2）3COOH）-Leu-Gly-O(Z) 液相环化得到环化中间肽Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)；
步骤6：将Cyclo[CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-O(Z)脱掉保护基Z，纯化，得到卡贝缩宫素杂质Gly9-OH； 所述纯化为采用Prep-HPLC纯化；
所述X为H、Mmt、Mtt或Trt； 所述Y为Fmoc或Boc； 所述Z为All或Bzl。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂选自CTC Resin或2-CTCResin。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc保护基的脱除剂是10％~50%体积浓度的哌啶或哌嗪的DMF溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、TIS、TFE和H2O的混合物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联采用的偶联剂为HBTU、HATU、PyBop、DIC、DCC、TBTU、HBOT、HOAT和Cl-HOBT中的一种或多种。
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