KR20190001969A - 트립토렐린의 제조방법 - Google Patents

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KR20190001969A
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김재일
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애니젠 주식회사
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Abstract

본 발명은 트립토렐린(Triptorelin)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 고체상(solid-phase)합성 방법을 실시하여 진행한다. 본 발명은 아미노산 모듈을 사용하여 고체상(solid-phase)으로 진행하므로, 액체상(solution-phase)에 비하여 합성 공정이 단순하여 제조기간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 모듈 합성법 적용으로 불순물의 발생을 최소화하여 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하여 상업적 대량 생산에 적합하다.

Description

트립토렐린의 제조방법{Process for the Preparation of Triptorelin}
본 발명은 트립토렐린의 제조방법에 관한 것이다.
트립토렐린(Triptorelin)은 데카 펩타이드(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)로서 아세테이트 또는 파모에이트(Pamoate) 염으로 사용되는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 작용제(GnRH 작용제)이다. 뇌하수체를 지속적으로 자극함으로써, 성선 자극 호르몬 (luteinizing hormone, LH)과 난소성 호르몬 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)의 뇌하수체 분비를 감소시키며, 전립선 암 치료에 사용된다. 트립토렐린은 데카펩틸(Decapeptyl, Ipsen), 디페릴린(Diphereline, Ipsen) 및 고나펩틸(Gonapeptyl, Ferring Pharmaceuticals)이라는 브랜드 이름으로 판매되며 미국의 경우, 트렐스타(Trelstar, Watson Pharmaceutical)로, 이란에서는 바리오펩틸(Variopeptyl, Triptorelin)이라는 브랜드 이름으로 판매된다.
트립토렐린의 합성방법에는 고체상 합성 방법과 액체상 합성 방법이 있다. 고체상 합성 방법에는 아미노산 서열을 고체 지지체(Resin)에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야 하는 단점이 있다.
반면, 액상 합성 방법은 통상의 유기 합성 방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.
트립토렐린을 제조하기 위한 종래의 제조방법은 다음과 같다. 미국특허 제 4,010,125은 고체상 합성방법으로 트립토렐린 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조 단계수가 많고 최종공정에서는 산업적으로 이용 불가능한 원료(클로로포름 등)을 사용하는 등 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량 생산 시 가격 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.
중국특허 제 103012564 A, 103012565 A에는 링크 아마이드(Rink amide) MBHA 레진, 링크 아마이드 AM 레진 등을 사용하여 각 아미노산을 순차적으로 결합시키는 방법으로 트립토렐린 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 동 제조방법의 경우, 단순히 각 아미노산들을 순차적으로 붙이는 방법으로, 여러 단계를 거치기 때문에 불순물이 점차 누적되어 수율이 저하되는 단점이 있다.
또한, 중국특허 101357936 A에 역시 트립토렐린 펩타이드 제조 시 링크 아마이드 MBHA 레진을 사용하고, 단순하게 순차적으로 각 아미노산을 결합하는 방법으로 목적 펩타이드를 제조하는 방법을 기재하고 있는데, 이 역시 불순물의 누적으로 인한 목적물의 분리 및 정제가 어렵게 되어, 수율이 낮아 상업적 대량 생산의 적용에는 많은 제한이 있다.
이상에서 언급한 바와 같이, 트립토렐린 펩타이드의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량 생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 트립토렐린 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.
본 발명자들은 아미노산 모듈을 사용한 고체상(solid-phase)합성 반응의 수행을 유기용매 내에서 하는 경우 불순물의 발생을 최소화 함으로써 안정적으로 대량 생산하기에 적합하다는 사실을 규명하고 새로운 트립토렐린의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 트립토렐린의 새로운 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 트립토렐린(Triptorelin)의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진에 아미노산 단량체(monomer), 2량체(dimer) 및 3량체(trimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 결합시켜 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드에 아미노산 단량체, 2량체 및 3량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 반응시켜 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드에 대하여 레진 및 보호기를 제거하는 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 트립토렐린을 수득하는 단계.
[화학식 I]
H-AA-NH-레진
[화학식 Ⅱ]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R4)-D-Trp(R2)-Leu-Arg(R5)-Pro-Gly-NH-레진
[화학식 Ⅲ]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
상기 화학식 I에서, AA는 단량체(monomer), 2량체(dimer) 또는 3량체(trimer)의 아미노산이다.
상기 R1, R2은 방향족 NH 보호기이다.
상기 R3, R4는 수소 또는 수산기 보호기이다.
상기 R5는 구아니딘 보호기이다.
약어의 정리
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature) 에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972); Pure & Appl . Chem ., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984).
본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다:
t-Bu: 터트-부틸 (tert-Butyl)
Fmoc: 9-플루오레닐옥시카보닐 (9-Fluorenyloxycarbonyl)
Trt: 트리페닐메틸(또는 트리틸) (Triphenylmethyl or Trityl)
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐 (2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)
Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl)
Mtr: 4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐-설포닐 (4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl)
Tos: 파라-톨루엔설포닐 (p-Toluenesulfonyl)
Ms: 메탄설포닐 (Methanesulfonyl)
Gly: 글리신 (Glycine)
Pro: 프롤린 (Proline)
Arg: 아르기닌 (Arginine)
His: 히스티딘 (Histidine)
Leu: 루신 (Leucine)
Trp: 트립토판 (Tryptophan)
D-Trp: 디-트립토판 (D-Tryptophan)
Ser: 세린 (Serine)
Tyr: 타이로신 (Tyrosine)
pGlu: 피로글루타믹산 (Pyroglutamic acid)
상기 화학식 Ⅱ에서 R1 및 R2은 당업계에서 통상적으로 이용하는 방향족 NH 보호기일 수 있다.
상기 방향족 NH 보호기는 터트-부틸(tert-butyl), 벤조일(benzoyl), 트리틸(Trityl), 벤질(benzyl), 파라-메톡시벤질 (p-methoxybenzyl), 벤질옥시카보닐 (benzyloxycarbonyl), 파라-니트로벤질 (p-nitrobenzyl), 디페닐메틸 (diphenylmethyl), 트리페닐메틸 (triphenylmethyl), 터트-부틸옥시카보닐 (tert-butyloxycarbonyl) 또는 아세트아미노메틸 (acetaminomethyl)기일 수 있다.
상기 화학식 Ⅱ에서 R3 및 R4은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기가 될 수 있다.
상기 수소 또는 수산기 보호기는 파라-메톡시벤질(p-methoxybenzyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 벤질옥시메틸(benzyloxymethyl), 테트라히드로피란(tetrahydropyrane), 테트라히드로퓨란(tetrahydrofurane), 터트-부틸(tert-butyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 2-클로로트리틸(2-chlorotrityl), 벤질(benzyl), 알릴(allyl), 터트-부틸디메틸실릴(tert-butyldimethylsilyl), 트리페닐실릴(triphenylsilyl), 트리이소프로필실릴(triisopropylsilyl), 터트-부틸카르보닐(tert-butylcarbonyl), 아세틸(acetyl) 또는 벤조일(benzoyl)기일 수 있다.
상기 화학식 Ⅱ에서 R5은 당업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘 보호기일 수 있다
상기 구아니딘 보호기는 터트-부틸옥시카보닐(tert-butyloxycarbonyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 벤질옥시메틸(benzyloxymethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질(benzyl), 알릴(allyl), 터트-부틸디메틸실릴(tert-butylmethylsilyl), 트리페닐실릴(triphenylsilyl), 트리이소프로필실릴(triisopropylsilyl), 니트로(nitro), Pmc(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl), Mtr((4-methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)sulfonyl), Pbf(2,2,4,6,7-
pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl), Tos(p-toluenesulfonyl) 또는 Ms(methanesulfonyl) 기일 수 있다.
상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 화학식 I로 표시되는 펩타이드의 수득
먼저, 레진에 아미노산 단량체(monomer), 2량체(dimer) 및 3량체(trimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 결합시켜 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 수득한다.
[화학식 I]
H-AA-NH-레진
상기 화학식에서, AA는 단량체(monomer), 2량체(dimer) 또는 3량체(trimer)의 아미노산을 의미한다.
화학식 I 및 Ⅱ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am. Chem . Soc., 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P.I., Anal. Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, 알파-아미노 보호기를 제거 하고 남은 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 결합하여 중간체를 얻는다.
적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자 내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 ㈀ 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, ㈁ 결합반응에서 탈 보호화 반응이 일어나지 않아야 하며, ㈂ 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.
또한, 레진에 결합시키는 아미노산은 아미노산 단량체(monomer), 2량체(dimer) 및 3량체(trimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 아미노산 단량체는 Glu, His, Trp, Ser, Tyr, D-Trp, Leu, Arg, Pro 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
상기 아미노산 2량체는 Arg-Pro, Leu-Arg, Trp-Leu, Tyr-D-Trp, Ser-Tyr, Trp-Ser, His-Trp 및 pGlu-His로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
상기 아미노산 3량체는 Leu-Arg-Pro, D-Trp-Leu-Arg, Tyr-D-Trp-Leu, Ser-Tyr-D-Trp, Trp-Ser-Tyr, His-Trp-Ser 및 Glu-His-Trp로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 특별히 2량체 이상으로 구성된 아미노산을 "모듈"로 표현하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 화학식 I 및 Ⅱ의 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 떼어낼 수 있는 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 레진을 사용할 수 있다.
상기 레진은 링크 아마이드 (RAM) 레진(rink amide (RAM) resin), 링크 아마이드 (아미노메틸)폴리스티렌(rink amide (aminomethyl)polystyrene), 풀리스티렌 에이엠-RAM(polystyrene AM-RAM), 링크 아마이드 벤즈하이드릴아민 폴리머-바운드(rink amide benzhydrilamine polymer-bound), 링크 아마이드-Nle-BHA 레진(rink amide Nle-BHA resin), 링크 아마이드 4-메틸벤질하이드릴아민 폴리머-바운드(rink amide 4-methoxybenzhydrilamine polymer-bound) 및 폴리스티렌 A-RAM(polystyrene A-RAM)로 이루어진 군에서 선택되는 레진일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)를 통해 아미노산 단량체, 2량체 또는 3량체가 결합된 레진을 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고체상 합성에서 레진에 아미노산을 결합시키는데 이용 가능한 커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium- hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7- Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-원(3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one: DEPBT), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate: PyBrOP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole: HOAt), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트(N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate: TDBTU), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트(O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate: TSTU), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate: HCTU), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로크롤라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride: EDC.HCl), 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 (ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate: Oxyma) 및 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3에이치)-온 (3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one: DEPBT)로 이루어진 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 커플링 반응에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM), 1,2-디클로로에탄(1,2-Dichloroethane, EDC), 클로로포름(Chloroform), 엔,엔-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF), 엔,엔-디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide, DMAc), 메탄올(Methanol, MeOH), 에탄올(Ethanol, EtOH), 이소프로필알콜(Isopropylalcohol, IPA) 및 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone, NMP)로 이루어진 군으로부터 선택된 한 개 이상의 용매일 수 있다.
상기 커플링 반응의 반응 온도는 -20℃ 내지 50℃ 일 수 있으며, 바람직하게는 0℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 30℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 30℃일 수 있다.
(b) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득
상기 단계 (a)에서 수득한 펩타이드에 아미노산 단량체, 2량체 및 3량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 1회 이상 반응시켜 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는다.
[화학식 Ⅱ]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R4)-D-Trp(R2)-Leu-Arg(R5)-Pro-Gly-NH-레진
상기 R1 및 R2은 방향족 NH 보호기이다.
R3 및 R4는 수소 또는 수산기 보호기이다.
R5는 구아니딘 보호기이다.
(c) 트립토렐린의 수득
트립토렐린은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 레진 및 보호기를 제거하는 반응을 수행하여 얻을 수 있다.
레진 및 보호기 제거 반응은 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 물(H2O), 페놀(phenol), 티오아니솔(thioanisole) 및 1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol, EDT)의 혼합물; 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS) 및 물(H2O)의 혼합물; 또는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS), 물 (H2O) 및 1,2-에탄디티올 (1,2-ethanedithiol, EDT)의 혼합물 하에서 실시할 수 있다.
레진 및 보호기 제거 반응은 -20℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 30℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서 실시할 수 있다.
트립토렐린(triptorelin)을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다.
[반응식 1]
Figure pat00001
본 발명은 트립토렐린의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 아미노산 또는 아미노산 모듈을 사용한 고체상 (solid-phase) 합성으로 반응 단계를 획기적으로 줄여서 반응 중 불순물의 발생을 최소화하여 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하며, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 트립토렐린을 제조하는 전체 공정을 나타낸 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
각 아미노산은 1개로부터 3개로 구성되며 아미노산의 결합은 각 단계별로 1개 구성 아미노산, 2개 구성 아미노산, 3개 구성 아미노산 등이 각 단계별로 결합할 수 있다. 각 단계에서 결합할 수 있는 아미노산의 구성은 1개, 2개, 3개의 순서로 결합되는 것은 아니며, 무작위로 1개, 2개, 3개 또는 2개, 1개, 3개 또는 3개, 2개, 1개 또는 3개, 1개, 2개 등으로 진행될 수 있다.
다음 실시예에서는 아미노산 1개씩 결합하는 방법, 아미노산을 2개 또는 3개씩 모듈형태로 결합하는 방법을 기술하였다.
본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 펩타이드의 제조(아미노산을 1개씩 결합시키는 합성)
[화학식 Ⅲ]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
<아미노산을 1개씩 결합하는 합성>
(a) H- Gly -NH-( MBHA ) 레진의 수득
링크 아마이드 MBHA 레진(300 mmole, 치환율 0.6 mmol/g 기준) 500 g을 반응기에 넣고 DMF 3 L를 투입하여 10분 동안 교반한 다음 DMF를 완전히 드레인(drain)하였다. 20% 피페리딘/DMF 혼합액 3 L를 더한 다음 15분 동안 교반 후 완전히 드레인하여 반응액을 제거하였다. 동일한 방법으로 20% 피페리딘/DMF 혼합액 3 L를 1회 더 처리하였다. 레진에 DMF 3 L를 더하고 2분 동안 교반하고 완전히 드레인한 다음 동일하게 5회 추가 처리하고 레진을 세척하였다.상기에서 얻은 NH2-MBHA 레진(300 mmol)에 Fmoc-Gly-OH(267.7 g, 300 mmol, 3 당량) 및 Oxyma(140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (3 L)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드용액(495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드 3 L로 2회 세척하여 Fmoc-Gly-NH-레진(링크 아마이드 MBHA)을 수득하였다. 이 레진에 20% 피페리딘/DMF 3L를 더하여 15분 동안 교반 후 드레인하여 반응액을 완전히 제거하고 동일한 양의 20% 피페리딘/DMF를 추가 처리하였다. 레진에 DMF 3 L를 더하고 2분 동안 교반하고 완전히 드레인한 다음 동일하게 5회 추가 처리하고 레진을 세척 처리하여 H-Gly-NH-레진(링크 아마이드 MBHA)을 수득하였다.
(b) H-Pro- Gly -NH-레진(링크 아마이드 MBHA )의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H-Gly-NH-MBHA 레진(300 mmol)에 Fmoc-Pro-OH (303.6 g, 900 mmol, 3 당량) 및 Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(3 L)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 여기에 20% 피페리딘/DMF(3 L)를 2회, 각 15분씩 반응시켜 Fmoc 보호기를 제거하였다. 반응액을 완전히 제거한 다음 DMF 3L로 총 6회 세척하였다.
(c) Fmoc -AA-OH의 결합 및 최종 물질의 수득
상기 반응 (b) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 결합하였다.
Fmoc-Arg(pbf)-OH (583.8 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-Leu-OH (318.0 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-D-Trp(Boc)-OH (473.4 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-Tyr(tBu)-OH (413.7 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-Ser(t-Bu)-OH (345.0 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-Trp(Boc)-OH (473.4 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-His(Trt)-OH (557.7 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-OH (116.2 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-OH의 결합 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척한 다음 TFA: TIS: H2O (14.25 L: 37.5 mL: 37.5 mL)로 처리하여 레진 및 보호기를 제거하고 MTBE 67.5 L로 결정화한 다음, MTBE 30 L x 2로 세척하고 건조함으로써 상기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 Crude 트립토렐린 386.7 g(수율 98.3%, 순도 74.9%)를 수득하였다.
실시예 2: 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 펩타이드의 제조(2 량체 아미노산 모듈을 적용한 합성)
[화학식 Ⅲ]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
<2 량체 아미노산 모듈을 적용한 합성>
(a) H- Gly -NH-( MBHA ) 레진의 수득
상기 기술한 <아미노산을 1개씩 결합하는 합성> (a)에서와 동일한 방법으로 H-Gly-NH-(MBHA) 레진을 수득하였다.
(b) H- Arg ( Pbf )-Pro- Gly -NH-( MBHA ) 레진의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H- Gly -NH-( MBHA ) 레진에 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH (671.3 g, 900 mmol, 3 당량) 및 Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(3 L)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드용액(495.0 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드 3 L로 2회 세척하여 Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH-(MBHA) 레진을 수득하였다. 여기에 20% 피페리딘/DMF(3 L)를 2회, 각 15분씩 반응시켜 Fmoc 보호기를 제거하였다. 반응액을 완전히 제거한 다음 레진을 DMF 3 L로 총 6회 세척하였다.
(c) Fmoc -AA-OH(아미노산 2 량체 )의 결합 및 최종 물질의 수득
상기 반응 (b) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 결합하였다.
Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-OH (575.8 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH (542.5 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-OH (815.4 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-OH (116.2 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-OH의 결합 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척한 다음 TFA: TIS: H2O (14.25 L: 37.5 mL: 37.5 mL)로 처리하여 레진 및 보호기를 제거하고 MTBE 67.5 L로 결정화한 다음, MTBE 30 L x 2로 세척하고 건조함으로써 상기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 Crude 트립토렐린 405.5g (수율 103.1%, 순도 91.4%)를 수득하였다.
실시예 3: 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 펩타이드의 제조(3 량체 아미노산 모듈을 적용한 합성)
[화학식 Ⅲ]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
<3 량체 아미노산 모듈을 적용한 합성>
아미노산 3량체는 일부는 상업적으로 이용 가능 하지만 바람직하게는 2-클로로트리틸 클로라이드 레진에 아미노산을 붙인 다음 고체상에서 추가로 두 개의 아미노산을 더 결합시킨 다음 떼어내어 합성하거나 액체상 반응으로 보호화된 아미노산을 서로 반응하여 3량체를 합성한다.
(a) H- Gly -NH-( MBHA ) 레진의 수득
상기 기술한 <아미노산을 1개씩 결합하는 합성> (a)에서와 동일한 방법으로 H-Gly-NH-(MBHA) 레진을 수득하였다.
(b) H-Leu- Arg ( Pbf )-Pro- Gly -NH-( MBHA ) 레진의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H- Gly -NH-( MBHA ) 레진에 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH(772.2 g, 900 mmol, 3 당량) 및 Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(3 L)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드용액(495.0 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드 3 L로 2회 세척하여 Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH-(MBHA) 레진을 수득하였다. 여기에 20% 피페리딘/DMF(3 L)를 2회, 각 15분씩 반응시켜 Fmoc 보호기를 제거하였다. 반응액을 완전히 제거한 다음 레진을 DMF 3 L로 총 6회 세척하였다.
(c) Fmoc -AA-OH (아미노산 3량체 )의 결합 및 최종 물질의 수득
상기 반응 (b) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 결합하였다.
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-OH (800.1 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-OH (715.4 g, 900 mmol, 3 당량), Oxyma (140.7 g, 990 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (495 ml, 2 M 용액, 3.3 당량)
pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-OH 의 결합 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척한 다음 TFA: TIS: H2O (14.25 L: 37.5 mL: 37.5 mL)로 처리하여 레진 및 보호기를 제거하고 MTBE 67.5 L로 결정화한 다음, MTBE 30 L x 2로 세척하고 건조함으로써 상기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 Crude 트립토렐린 408.3 g(수율 103.6%, 순도 91.3%)를 수득하였다.
실시예 4: 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 트립토렐린 초산염의 제조
[화학식 Ⅲ]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
상기 실시예 1, 2, 3에서 얻은 화학식 Ⅲ으로 표시되는 Crude 펩타이드 393.4 g을 정제수/아세토니트릴 혼합용액에 넣어 용해한 다음, 0.45 μm 여과하였다. 역상 HPLC (230 nm, 1000 ml/분, 10 미크론 C18 컬럼에서 30분 내에 0.1% 아세트산 내 아세토니트릴 초기농도 15%에서 30%로 증가)로 정제하여 화학식 Ⅲ으로 표시되는 트립토렐린 초산염 147.66 g을 수득하였다. 총 수율은 43% 였으며, HPLC의 순도는 99.5% 였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> ANYGEN CO., LTD. <120> Process for the Preparation of Triptorelin <130> PN170174 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Triptorelin <220> <221> SITE <222> (1) <223> Pyroglutamic acid <220> <221> SITE <222> (6) <223> D-Tryptophan <220> <221> SITE <222> (10) <223> -NH2 <400> 1 Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly 1 5 10

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 트립토렐린(Triptorelin)의 제조방법:
    (a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진에 아미노산 단량체(monomer), 2량체(dimer) 및 3량체(trimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 결합시켜 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드에 아미노산 단량체, 2량체 및 3량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 반응시켜 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드에 대하여 레진 및 보호기를 제거하는 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 트립토렐린을 수득하는 단계.
    [화학식 I]
    H-AA-NH-레진
    [화학식 Ⅱ]
    pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R4)-D-Trp(R2)-Leu-Arg(R5)-Pro-Gly-NH-레진
    [화학식 Ⅲ]
    pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

    상기 AA는 단량체(monomer), 2량체(dimer) 또는 3량체(trimer)의 아미노산이고,
    상기 R1 및 R2은 방향족 NH 보호기이고,
    상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 수산기 보호기이며,
    상기 R5는 구아니딘 보호기이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소(H), 터트-부틸(tert-Butyl), 벤조일(benzoyl), 트리틸(Trityl), 벤질(benzyl), 파라-메톡시벤질(p-methoxybenzyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 파라-니트로벤질(p-nitrobenzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 트리페닐메틸(tripheylmethyl), 터트-부틸옥시카르보닐(tert-butyloxycarbonyl) 및 아세트아미노메틸(acetaminomethyl)기로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소(H), 파라-메톡시벤질(p-methoxybenzyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 벤질옥시메틸(benzyloxymethyl), 테트라히드로피란(tetrahydropyrane), 테트라히드로퓨란(tetrahydrofurane), 터트-부틸(tert-butyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 2-클로로트리틸 (2-chlorotrityl), 벤질(benzyl), 알릴(allyl), 트리메틸실릴(trimethylsilyl), 터트-부틸디메틸실릴(tert-butylmethylsilyl), 트리페닐실릴(triphenylsilyl), 트리이소프로필실릴(triisopropylsilyl), 터트-부틸카르보닐(tert-butylcarbonyl), 아세틸(acetyl) 및 벤조일(benzoyl)기로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 R5는 터트-부틸옥시카보닐(tert-butyloxycarbonyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 벤질옥시메틸(benzyloxymethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질(benzyl), 알릴(allyl), 터트-부틸디메틸실릴(tert-butyldimethylsilyl), 트리페닐실릴(triphenylsilyl), 트리이소프로필실릴(triisopropylsilyl), 니트로(nitro), Pmc(2,2,5,7,8-pentamethylchromane-6-sulfonyl), Mtr(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl), Pbf(2,2,4,6,7-
    pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl), Tos(p-toluenesulfonyl) 및 Ms(methanesulfonyl)기로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 레진은 링크 아마이드(RAM) 레진(rink amide (RAM) resin), 링크 아마이드 (아미노메틸)폴리스티렌(rink amide (aminomethyl)polystyrene), 풀리스티렌 에이엠-RAM(polystyrene AM-RAM), 링크 아마이드 벤즈하이드릴아민 폴리머-바운드(rink amide benzhydrilamine polymer-bound), 링크 아마이드-Nle-BHA 레진(rink amide Nle-BHA resin), 링크 아마이드 4-메틸벤질하이드릴아민 폴리머-바운드(rink amide 4-methoxybenzhydrilamine polymer-bound) 및 폴리스티렌 A-RAM(polystyrene A-RAM)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM), 1,2-디클로로에탄(1,2-Dichloroethane, EDC), 클로로포름(Chloroform), 엔,엔-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF), 엔,엔-디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide, DMAc), 메탄올(Methanol, MeOH), 에탄올(Ethanol, EtOH), 이소프로필알콜(Isopropylalcohol, IPA) 및 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone, NMP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에서 수행되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 -20℃ 내지 50℃에서 수행하는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 2량체는 Arg-Pro, Leu-Arg, Trp-Leu, Tyr-D-Trp, Ser-Tyr, Trp-Ser, His-Trp 및 pGlu-His로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 3량체는 Leu-Arg-Pro, D-Trp-Leu-Arg, Tyr-D-Trp-Leu, Ser-Tyr-D-Trp, Trp-Ser-Tyr, His-Trp-Ser 및 Glu-His-Trp로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 트립토렐린의 제조방법.
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