KR101171095B1

KR101171095B1 - 루프로라이드의 제조방법

Info

Publication number: KR101171095B1
Application number: KR1020100023883A
Authority: KR
Inventors: 김재일; 전용국; 김대영; 윤영수; 김진권
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-08-03
Also published as: KR20110060779A

Abstract

본 발명은 고상(solid-phase)합성과 액상(solution-phase)반응을 결합한 신규한 루프로라이드(Leuprolide) 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 제조 합성된 루프로라이드 펩타이드의 분리 및 정제가 용이한 효과를 가짐으로써, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 당업 기술 분야에서 이용하는 루프로라이드 제조 방법보다 간단한 제조 공정을 통하여 루프로라이드 제조함으로써 생산 비용 면에서 매우 경제적인 효과를 나타낸다.

Description

루프로라이드의 제조방법{Process for the Preparation of Leuprolide}

본 발명은 신규한 루프로라이드의 제조방법에 관한 것이다.

루프로라이드는 LH-RH(Luteinizing Hormone Releasing Hormone) 유도체로서 전립선암, 자궁내막증, 자궁근종, 폐경전 여성의 유방암 및 중추성 사춘기 조발증에 대한 적응증을 가지고 있다.

펩타이드 합성방법에는 통상 고상(solid-phase)합성 방법과 액상(solution-phase)합성방법이 있다. 고상 합성방법에는 아미노산 서열을 고체 지지체에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야하는 단점이 있다. 반면 액상합성방법은 통상의 유기합성방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.

루프로라이드를 제조하기 위한 종래의 제조방법은 다음과 같다.

미국특허 제5,602,231호, 미국특허 제6,897,289호, 유럽특허 제0518655호, 유럽특허 제1777232호는 루프로라이드와 같은 LH-RH계열의 펩타이드를 고상 (solid-phase)합성방법으로 제조하는 기술을 기재하고 있다. 상기 유럽특허 제1777232호에 기재되어 있는 방법으로 루프로라이드를 합성하는 경우 HPLC상 루프로라이드 피크(Peak)주위에 불순물이 많아서 정제가 매우 어려운 단점이 있다.

미국특허 제4,008,209호, 미국특허 제6,448,031호, 유럽특허 제1790656호는 액상(solution-phase) 합성방법으로 루프로라이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조단계수가 많고 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량생산 시 가격적 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.

이상에서 언급한 바와 같이 루프로라이드 펩타이드의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 루프로라이드 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.

본 발명자들은 정제가 용이하고 대량으로 루프로라이드를 제조할 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고상(solid-phase)합성 방법과 액상(solution-phase)합성방법을 결합하는 방법을 통하여 불순물이 거의 없는 루프로라이드를 제조할 수 있을 뿐 만 아니라 매우 높은 수율로 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 루프로라이드의 새로운 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 루프로라이드의 제조방법을 제공한다: (a) 고상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 Pro-NH-R⁵와 커플링반응을 통하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드에서 탈보호화 반응을 통하여 루프로라이드를 수득하는 단계.

화학식 Ⅰ

pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-O-레진(resin)

화학식 Ⅱ

pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-OH

화학식 Ⅲ

pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-Pro-NH-R⁵

상기 화학식에서, R¹은 수소 또는 이미다졸 보호기, R²는 수소 인돌 보호기, R³는 수소 또는 수산기 보호기, R⁴는 구아니딘(guanidine) 보호기, 그리고 R⁵는 탄소수 1-10의 알킬기이다.

약어의 정리

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11:1726-1732(1972)).

본 명세서에서 사용한 아미노산 및 보호기의 약어는 다음과 같다:

Tyr: 티로신(Tyrosin)

Glu: 글루타믹 애시드(Glutamic acid)

pGlu: 피로글루타믹 애시드(Pyroglutamic acid)

Ser: 세린(Serine)

Arg: 아르기닌(Arginine)

Pro: 프롤린(Proline)

Leu: 루신(Leucine)

His: 히스티딘(Histidine)

Ala: 알라닌(Alanine)

Trp: 트립토판(Tryptophane)

Et: 에틸(Ethyl)

Boc: t-부틸옥시카보닐(t-butyloxycarbonyl)

tBu: t-부틸(t-butyl)

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시옥시카보닐(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)

Trt: 트리페닐메틸(triphenylmetyl)

Mtr: 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl)

Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐(2,2,5,7,8-pentamethyl-croman-6-sulfonyl)

Tos: 토루엔설포닐(toluensulfonyl)

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐(2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R¹은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 이미다졸 보호기이다. 바람직하게는, 상기 이미다졸보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 또는 알릴기이고, 보다 바람직하게는 트리페닐메틸기 또는 t-부틸옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 트리페닐메틸기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R²은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 인돌보호기이다. 바람직하게는, 상기 인돌보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 또는 알릴기이고, 보다 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R³은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기가 될 수 있다. 바람직하게는, 수산기 보호기는 p-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 2-클로로트리틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기이고, 보다 바람직하게는 t-부틸기 또는 트리페닐메틸기이며, 가장 바람직하게는 수산기 보호기가 t-부틸기인 것이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R⁴은 당업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘니딘니딘 보호기이다. 바람직하게는, 상기 과니딘 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, Pmc, Mtr, Pbf, Tos이고, 보다 바람직하게는 Pbf 또는 Mtr기이며, 가장 바람직하게는 Pbf기이다.

상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R⁵는 당업계에서 통상적으로 이용하는 탄소수 1-10의 알킬기이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “알킬(alkyl)”은 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 알킬 부위는 어떠한 알켄이나 알킨 부위를 포함하고 있지 않음을 의미하는 “포화 알킬(saturated alkyl)” 그룹일 수 있다. 알킬 부위는 적어도 하나의 알켄 또는 알킨 부위를 포함하고 있음을 의미하는 “불포화 알킬(unsaturated alkyl)” 부위일 수도 있다. 포화 또는 불포화에 있어서 알킬은 분지형, 직쇄형 또는 환형일 수 있다.

알킬 그룹은 1-10 개의 탄소원자를 가질 수 있다. 알킬 그룹은 1-10개의 탄소원자들을 가지는 중간 크기의 알킬일 수도 있으나, 바람직하게는 1-6개의 탄소원자, 보다 더 바람직하게는 1-4개의 탄소원자들을 가지는 저급 알킬이다. 예를 들어, C₁-C₄ 알킬은 알킬쇄에 1-4 개의 탄소원자, 즉, 알킬쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노기 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 이어 α-아미노기 및 보호화 측쇄 작용기를 가지는 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다.

적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 ㈀ α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, ㈁ 커플링반응에서 탈보호화반응이 일어나지 않아야 하며, ㈂ 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 Ⅰ의 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진이고, 보다 바람직하게는 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진이며, 가장 바람직하게는 2-클로로트리틸 레진이다.

(b) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득

상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 온화한 산성조건하에서 레진을 제거하여 얻을 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 산성조건은 아미노산 사슬의 측쇄보호기가 유지될 수 있는 온화한 조건이여야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 레진을 제거하는 과정은 산성을 나타내는 용액의 존재 하에서 실시된다. 바람직하게는, 산성 조건은 디클로로메탄,아세트산 및 트리플루오로에탄올의 부피비가 각각 8:1:1로 포함된 용액의 존재하에 실시하거나, 0.5-5부피% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액 하에서 수행한다.

(c) 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅲ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 H-Pro-NHEt과 커플링 시약의 존재 하에서 액상반응을 수행하여 얻는다.

단계 (c)는 본 발명의 제조방법에서 가장 중요하고 특이한 과정이다. 루프로라이드 서열에서 Pro 서열을 제외한 모든 서열은 고상합성법에서 제조되지만, 마지막 C-말단의 Pro 잔기는 액상반응을 통하여 펩타이드 서열에 커플링되어 루프로라이드 서열을 최종적으로 완성한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 이용 가능한 커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropyl carbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium- hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl- uronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7- Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-원 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one: DEPBT), 브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate: PyBrOP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole: HOAt), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate: TDBTU), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate: TSTU), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate: HCTU) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로크롤라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)로 구성된 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있고, 바람직하게는 HBTU 또는 EDC.HCl이고, 가장 바람직하게는 EDC.HCl이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 커플링 액상반응에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름 및 DMF으로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 용매이며, 바람직하게는 디클로로메탄, DMF 또는 디클로로메탄 및 DMF의 혼합용매이고, 가장 바람직하게는 디클로로메탄 및 DMF의 혼합용매이다.

상기 커플링반응의 반응 온도는 -20~50℃이고, 바람직하게는 0~25℃, 보다 바람직하게는 0~15℃, 보다 더 바람직하게는 0~5℃이다.

(d) 루프로라이드의 수득

루프로라이드는 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈보호화반응을 수행하여 얻을 수 있다.

탈보호화반응의 반응 조건으로는 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합물 하에서 가능하며, 가장 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 수행된다.

본 발명은 당업계에서 루프로라이드를 생산하기 위하여 이용하는 액상 합성 방법 또는 고상 합성 방법보다 불순물이 적은 매우 향상된 수득율로 루프로라이드 제조가 가능하며, 특히 고 순도(예컨대 99%이상의 순도)로 정제된 루프로라이드를 제조할 수 있는 효과를 발휘한다(참조: 본원발명 실시예). 또한, 본원발명은 루프로라이드 펩타이드를 대량생산하는 경우 제조 수득율 면에서 종래의 제조 방법보다 매우 큰 경제적인 효과를 가져올 수 있다.

상기 내용을 바탕으로 루프로라이드를 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다(반응식 1).

반응식 1

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 고상(solid-phase)합성과 액상(solution-phase)반응을 결합한 신규한 루프로라이드 제조 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 제조 합성된 루프로라이드 펩타이드의 분리 및 정제가 용이한 효과를 가짐으로써, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 당업 기술 분야에서 이용하는 루프로라이드 제조 방법보다 간단한 제조 공정을 통하여 루프로라이드 제조함으로써 생산 비용 면에서 매우 경제적인 효과를 나타낸다.

도 1은 본원 발명의 신규한 루프로라이드 제조 공정의 전체적인 개략도를 나타낸 것이다. 도 1에서의 영문 표기 및 표현은 발명의 상세한 설명에서 개시된 표현을 참조로 하여 해석된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 : 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅳ

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진

9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진(chlorotrityl resin)의 제조

여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기(제이오텍)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(f=1.27 mmol/g의 레진, 16 mmol, 비드텍) 및 디클로로메탄 (50 ㎖, 대정화금)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (20.8 g, 32 mmol, 2.0당량, GL Biochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄(100 ㎖)을 상기 처리된 레진에 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민(5.2 g, 40 mmol, 2.5 당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 1회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄:메탄올:디이소프로필에틸아민=17:2:1(부피 비, 100 ㎖)을 넣고 20분간 교반시켰다. 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.58 mmol/g이었다.

9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH 커플링 반응

(a) H-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진(0.58 mmol/g, 10 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (100 ㎖, 대정화금)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100 ㎖)를 상기 레진에 넣은 다음, 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(b) 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (a)에서 얻은 H-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진 (10 mmol)에, 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (7.1 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.)의 N,N-디메틸포름아미드(80 ㎖)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드(대정화금)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드용액 (10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(c) H-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘(대정화금)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100 ㎖)를 넣어 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Leu-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(d) 9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH의 커플링 및 최종 물질의 수득

상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.

9-플루오레닐옥시카보닐-D-Leu-OH (7.1 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Tyr(t-부틸)-OH (9.2 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N디메틸포름아미드 용액(10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-OH (7.7 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Trp(t-부틸옥시카보닐)-OH (10.5 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-His(트리페닐메틸)-OH(12.4 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.),1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

pGlu-OH (2.6 g, 20 mmol, 2 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드이 포함된 N,N디메틸포름아미드 용액(10 ㎖, 2 M 용액, 2 당량)

pGlu-OH의 커플링 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하여 상기 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드를 얻었다.

실시예 2 : 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅴ

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-OH

상기 실시예 1에서 얻은 상기 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=8:1:1의 혼합액 (300 ㎖)를 넣고 2시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드를 17.5 g 얻었다. 크루드의 수율은 98%였고, LC (liquid chromatography) 순도는 93.7%였다.

실시예 3 : 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅵ

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt

상기 실시예 2에서 얻은 상기 화학식 Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드 (17.9 g, 10 mmol)를 디클로로메탄 50 ㎖에녹이고, 에틸아민프롤린염산염 (2.7 g, 15 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (2 g, 15 mmol)을 넣고 녹인 후, 디이소프로필에틸아민 (1.9 g, 15 mmol)을 넣고, N,N-디메틸포름아미드을 넣어 부피가 100 ㎖이 되게 하였다. 여기에 HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; 5.7 g, 15 mmol, GL Biochem Ltd.)을 서서히 넣어 주고, 0℃에서 4시간 반응시켰다.

반응이 완료 된 후, 유기층을 0.2 노르말 염산 100 ㎖로 씻은 후 분층된 디클로로메탄을 분리하였다. 100 ㎖ 물로 한번 더 씻은 후 디클로로메탄을 분리하고, 10 % 탄산염 100 ㎖로 씻은 다음 디클로로메탄층을 분리하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압 증류하여 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.7 g을 얻었다.

실시예 4 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드의 제조

화학식 Ⅶ

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt

상기 실시예 3에서 얻은 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.7 g에 트리플루오로아세트산:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 (500 ㎖) 혼합용액을 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압 증류하고 t-부틸메틸에테르 (500 ㎖, 대정화금)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 루프로라이드 11.8 g을 얻었다. 역상 HPLC (reversed-phase high performance liquid chromatography, Shimadzu Corporation)로 정제하여 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드 5.3 g을 얻었다. 총 수율은 44%였고, HPLC의 순도는 99%였다.

실시예 5 : 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅵ

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt

상기 실시예 2에서 얻은 상기 화학식 Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드 (17.9 g, 10 mmol)을 디클로로메탄 50 ㎖에 녹이고, 에틸아민프롤린염산염 (2.7 g, 15 mmol, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시 아조벤조트리아졸 (2 g, 15 mmol)을 넣고 녹인 후, 디이소프로필에틸아민 (1.9 g, 15 mmol)을 넣고, N,N-디메틸포름아미드을 넣어 부피가 100 ㎖이 되게 하였다. 여기에 HATU ((2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 5.7 g, 15 mmol, GL Biochem Ltd.)을 서서히 넣어주고, 0 ℃에서 4시간 반응시켰다.

반응이 완료 된 후, 유기층을 0.2 노르말 염산 100 ㎖로 씻은 후 분층한 디클로로메탄을 분리하였다. 100 ㎖ 물로 한번 더 씻은 후 디클로로메탄을 분리하고, 10 % 탄산염 100 ㎖로 씻은 다음 디클로로메탄층을 분리하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압 증류하여 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.8 g을 얻었다.

실시예 6 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드의 제조

화학식 Ⅶ

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt

상기 실시예 5에서 얻은 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.8g에 트리플루오로아세트산:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 (500 ㎖) 혼합용액을 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압 증류하고 t-부틸메틸에테르 (500 ㎖)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 루프로라이드 12 g을 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드 5.4 g을 얻었다. 총 수율은 45%였고, HPLC의 순도는 99%였다.

실시예 7 : 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식Ⅵ

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt

상기 실시예 2에서 얻은 상기 화학식 Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드 (17.9 g, 10 mmol)을 디클로로메탄 50 ㎖에 녹이고, 에틸아민프롤린염산염 (2.7 g, 15 mmol), 1-히드록시 아조벤조트리아졸 (2 g, 15 mmol)을 넣고 녹인 후, 디이소프로필에틸아민 (1.9 g, 15 mmol)을 넣고, N,N-디메틸포름아미드을 넣어 부피를 100 ㎖으로 적정하였다. 여기에 EDC.HCl(1-ethyl3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; 2.9 g, 15 mmol, GL Biochem Ltd.)을 서서히 넣어주고, 0℃에서 4시간 반응시킨다.

반응이 완료 된 후, 유기층을 0.2 노르말 염산 100 ㎖로 씻은 후 분층한 후클로로메탄을 분리해 낸다. 100 ㎖ 물로 한번 더 씻은 후 디클로로메탄을 분리하고, 10 % 탄산염 100 ㎖로 씻은 다음 디클로로메탄층을 분리해 내었다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하였고, 여과 및 감압 증류하여 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.7 g을 얻었다.

실시예 8 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드의 제조

화학식 Ⅶ

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt

상기 실시예 7에서 얻은 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 18.7g에 트리플루오로아세트산:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5(500 ㎖) 혼합용액을 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압 증류하고 t-부틸메틸에테르 (500 ㎖)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 루프로라이드 12 g을 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 루프로라이드 5.5 g을 얻었다. 총 수율은 46%였고, HPLC의 순도는 99%이상 이였다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 루프로라이드의 제조방법:
(a) 고상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 Pro-NH-R⁵와 커플링반응을 통하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드를 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 탈보호화 반응을 통하여 루프로라이드를 수득하는 단계;
화학식 Ⅰ
pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-O-레진
화학식 Ⅱ
pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-OH
화학식 Ⅲ
pGlu-His(R¹)-Trp(R²)-Ser(R³)-Tyr(R³)-D-Leu-Leu-Arg(R⁴)-Pro-NH-R⁵
상기 화학식에서, R¹은 t-부틸옥시카보닐기, 트리페닐메틸기 또는 수소, R²는 t-부틸옥시카보닐기, 트리페닐메틸기 또는 수소, R³는 t-부틸기, 트리페닐메틸기 또는 수소, R⁴는 t-부틸옥시카보닐기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기 또는 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기, 그리고 R⁵는 탄소수 1-10의 알킬기이다.
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제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 레진은 2-클로로트리틸 레진, 트리틸클로라이드 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 레진을 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 산성용액은 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 부피비가 8:1:1로 포함된 용액인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 용액은 0.5-5% 부피의 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 사용되는 커플링 시약은 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 tetrafluoroborate(O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-원 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one), (브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로크롤라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 사용되는 용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름 및 DMF으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 반응 온도는 -20℃~50℃인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조 방법.