CN110642936B - 一种制备特立帕肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学技术领域，公开了一种制备特立帕肽的方法。本发明所述制备特立帕肽的方法采用片段缩合制备特立帕肽。首先分别合成特立帕肽第1‑16位肽序列(片段A)和第17‑34位肽序列(片段B)，然后，将两个片段偶联得到特立帕肽粗肽，纯化获得特立帕肽。本发明中的片段侧链没有保护基，在水中有较好的溶解度，不存在偶联困难的问题，操作简单，生产效率高。得到的特立帕肽产品纯度高，易于纯化。实验表明，本发明得到的特立帕肽的粗肽纯度可得到80％，总收率能达到45％。经过简单的纯化精肽纯度可达到99.92％，单个最大杂质0.05％。与现有技术相比，本发明具有产品质量高、成本低、适合工业化生产等特点。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种制备特立帕肽的方法。
背景技术
特立帕肽(Teriparatide)是人甲状旁腺激素中的1-34位片段，该片段与人甲状旁腺素具有相同的生物活性，由美国Eli Lilly公司开发用于原发性骨质疏松、性腺功能减退性骨质疏松和绝经妇女的骨质疏松，具有较大的市场前景。其结构式为：
肽序列为：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。
专利US6590081采用基因重组的方法得到特立帕肽。但基因重组法存在工艺复杂、成本高和三废严重等问题。
专利CN201510005427采用Wang树脂或2-Cl-CTC树脂由C端向N端逐个偶联氨基酸合成特立帕肽，属于常规固相合成方法。但该方法在偶联至后期时反应不完全，导致最终产品纯化困难，纯度不高。
专利CN201310403743采用逐个偶联的方式进行合成，不同于专利CN201510005427，该专利将17位Ser的游离羟基与16位Asn的羧基进行酯缩合，再通过O→N酰基转移得到特立帕肽。该法虽然能够通过改变目标肽空间构型来降低后续位点的偶联难度，但仍然存在固相偶联步数多的问题，纯化困难。
专利CN201410262511中采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψMe,MePro)-OH代替原16-17位置两个氨基酸逐个进行偶联，最终裂解得到特立帕肽。该方法采用假脯氨酸二肽的方式投料，避免了氧化杂质的产生，但无法避免因肽链过长所产生的多种缺失肽，同时该假脯氨酸二肽价格昂贵，不易得到。
专利CN201511024053中采用多个二肽或三肽片段替换单个氨基酸进行偶联，最终裂解得到特立帕肽。该方法需要采用液相合成方法得到11个短肽片段，操作复杂，生产效率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种制备特立帕肽的方法，所述制备方法操作简单，生产效率高、适合于特立帕肽的大规模生产，同时制得的特立帕肽纯度高，易于纯化。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备特立帕肽的方法，包括：
步骤1：将3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-O H、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和PG-Ser(tBu)-OH，然后通过对硝基氯甲酸苯酯关环形成苯并咪唑酮，最后通过水杨醛和TFA裂解得到片段A PG-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL；
步骤2：将Fmoc-Phe-OH与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH，TFA裂解得到片段B Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH；
步骤3：将片段A和片段B偶联，然后脱除片段A中1位Ser的保护基得到特立帕肽粗肽；
步骤4：特立帕肽粗肽纯化得到特立帕肽；
其中步骤1和步骤2顺序不分先后。
作为优选，步骤1所述固相载体为Rink Amide Resin或2-Cl-CTC Resin。
作为优选，步骤1所述偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
作为优选，步骤1所述PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基、Teoc保护基、Fmoc保护基。
作为优选，步骤1所述裂解的裂解剂为TFA与水的混合溶液。
作为优选，步骤2所述固相载体为Wang Resin。
作为优选，步骤2所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/DMAP/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
作为优选，步骤2所述裂解的裂解剂为TFA与TIS的混合溶液。
作为优选，步骤3所述偶联的具体操作为溶于吡啶/醋酸缓冲溶液反应2-4小时。
作为优选，步骤3所述脱除片段A中1位Ser的保护基的具体操作为：
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入TFA/碘化铵/二甲硫醚脱除保护基Msz，乙醚沉淀；
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Teoc保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入四丁基氟化铵脱除保护基Teoc；
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Fmoc保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入二乙胺脱除保护基Fmoc。
本发明所述制备特立帕肽的方法采用片段缩合制备特立帕肽。首先分别合成特立帕肽第1-16位肽序列(片段A)和第17-34位肽序列(片段B)，然后，将两个片段偶联得到特立帕肽粗肽，纯化获得特立帕肽。本发明中的片段侧链没有保护基，在水中有较好的溶解度，不存在偶联困难的问题，操作简单，生产效率高。得到的特立帕肽产品纯度高，易于纯化。实验表明，本发明得到的特立帕肽的粗肽纯度可得到80％，总收率能达到45％。经过简单的纯化精肽纯度可达到99.92％，单个最大杂质0.05％。与现有技术相比，本发明具有产品质量高、成本低、适合工业化生产等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为片段A的合成路线图；
图2为实施例5得到的特立帕肽粗肽的色谱图；
图3为实施例6得到的特立帕肽粗肽的色谱图；
图4为实施例7得到的特立帕肽粗肽的色谱图；
图5为实施例8得到的特立帕肽精肽的色谱图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种制备特立帕肽的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备特立帕肽的方法，包括：
步骤1：将3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和PG-Ser(tBu)-OH，然后通过对硝基氯甲酸苯酯关环形成苯并咪唑酮，最后通过水杨醛和TFA裂解得到片段A PG-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL；
步骤2：将Fmoc-Phe-OH与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH，TFA裂解得到片段B Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH；
步骤3：将片段A和片段B偶联，然后脱除片段A中1位Ser的保护基得到特立帕肽粗肽；
步骤4：特立帕肽纯化得到特立帕肽；
其中步骤1和步骤2顺序不分先后。
本发明所述制备特立帕肽的方法采用片段缩合制备特立帕肽。首先分别合成特立帕肽第1-16位肽序列(片段A)和第17-34位肽序列(片段B)，然后，将两个片段偶联得到特立帕肽粗肽，纯化获得特立帕肽。本发明中的片段侧链没有保护基，在水中有较好的溶解度，不存在偶联困难的问题，操作简单，生产效率高。得到的特立帕肽产品纯度高，易于纯化。
本发明所述制备方法步骤1首先采用固相合成法将特立帕肽的肽序列中第1-16位氨基酸从C端至N端依次偶联合成，然后关环形成苯并咪唑酮，最后裂解得到肽片段A(PG-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL)。具体路线如图1所示。
其中，优选的，步骤1所述固相载体为Rink Amide Resin或2-Cl-CTC Resin。
进一步的，步骤1所述固相载体的初始替代度优选为0.4mmol/g～1.0mmol/g。在一些实施例中，步骤1所述固相载体的初始替代度为0.5mmol/g，在一些实施例中步骤1所述固相载体的初始替代度为0.6mmol/g。
Fmoc保护基团的氨基酸与固相载体偶联的过程中常常需要偶联剂，以活化氨基酸。优选的，步骤1所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。。在一些实施例，步骤1所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI。
具体的，所述3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸和HOBt用有机溶剂溶解，冰浴下加入DIPCDI活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的固相载体进行偶联反应。
作为优选，所述溶解3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸和固相载体的有机溶剂均为DMF。
作为优选，偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤1所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化。所述纯化方法具体方法为用DMF洗涤。
进一步的，在偶联反应结束后还包括脱除Fmoc步骤。在一些实施例中，所述脱除Fmoc的试剂为20％哌啶溶液(哌啶：DMF＝1:4)。
本发明所述制备方法步骤1在3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸与固相载体偶联后通过多肽固相合成法逐一偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(T rt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和PG-Ser(tBu)-OH。
其中，步骤1所述逐一偶联方式所使用的偶联剂优选为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
进一步的，步骤1所述逐一偶联方式中在每步偶联前还包括脱除Fmoc步骤。在一些实施例中，所述脱除Fmoc的试剂为20％哌啶溶液(哌啶：DMF＝1:4)。
进一步的，步骤1所述逐一偶联中所述PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基、Teoc保护基、Fmoc保护基。即逐一偶联中，其中1位丝氨酸采用原料为Msz-Ser(tBu)-OH、Teoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ser(tBu)-OH。
本发明所述方法步骤1在依次偶联氨基酸后通过对硝基氯甲酸苯酯关环形成苯并咪唑酮树脂。在一些实施例中，所述关环的具体操作为对硝基氯甲酸苯酯溶于二氯甲烷，加入固相反应柱中，室温反应1小时，再加入DIPEA，反应30分钟。
本发明所述方法步骤1中关环反应生成树脂先与水杨醛反应。在一些实施例中，所述水杨醛反应的具体操作为将碳酸钠和水杨醛溶于DCM与THF的混合溶液，加至上述生成的肽树脂中，室温反应过夜，过滤，滤液减压浓缩至干。其中，所述DCM与THF的混合溶液中DCM与THF的体积比为1:3。
本发明所述方法步骤1所述裂解的裂解剂为TFA与水的混合溶液。在一些实施例中，所述TFA与水的混合溶液中TFA与水的体积比为95:5。
本发明所述制备方法步骤2采用固相合成法将特立帕肽的肽序列中第17-34位氨基酸从C端至N端依次偶联合成，裂解得到肽片段B(Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH)。
其中，优选的，步骤2所述固相载体为Wang Resin。
进一步的，步骤2所述固相载体的初始替代度优选为0.4mmol/g～1.0mmol/g。在一些实施例中，步骤1所述固相载体的初始替代度为0.8mmol/g。
本发明所述制备方法步骤2所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/DMAP/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
在一些实施例中，步骤2所述偶联的偶联剂HOBt/DMAP/DIPCDI。
具体的，所述Fmoc-Phe-OH和HOBt、DMAP用有机溶剂溶解，冰浴下加入DIPCDI活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的固相载体进行偶联反应。
作为优选，所述溶解Fmoc-Phe-OH和固相载体的有机溶剂均为DMF。
作为优选，偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤2所述偶联反应结束后需要对反应液进行封闭。所述封闭方法具体为加入吡啶和乙酸酐混合液封闭树脂6小时。
上述步骤2所述封闭反应结束后需要对反应液进行纯化。所述纯化方法具体方法为用DMF洗涤。
本发明所述制备方法步骤2在Fmoc-Phe-OH与固相载体偶联后按照步骤1的方法通过多肽固相合成法逐一偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。
本发明所述方法步骤2所述裂解的裂解剂为TFA与TIS的混合溶液。在一些实施例中，所述TFA与TIS的混合溶液中TFA与TIS的体积比为95:5。
本发明所述制备方法步骤3将片段A和片段B偶联，然后脱除片段A中1位Ser的保护基得到特立帕肽粗肽。
其中，步骤3所述偶联的具体操作为溶于吡啶/醋酸缓冲溶液，反应2-4小时。
所述吡啶/醋酸缓冲溶液溶液中吡啶与醋酸的摩尔比为1:1。所述偶联反应的温度为室温。
步骤3在片段A和片段B偶联后脱除片段A中1位Ser的保护基即可得到特立帕肽粗肽。
1位Ser的保护基不同，脱除保护基的方法不同。
在一些实施方案中，1位Ser的保护基为Msz保护基，即片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基，片段A和片段B偶联完毕加入TFA/碘化铵/二甲硫醚脱除保护基Msz，乙醚沉淀。其中所述TFA/碘化铵/二甲硫醚的体积比优选为90:5:5。
在一些实施方案中，1位Ser的保护基为Teoc保护基，即片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Teoc保护基，片段A和片段B偶联完毕加入四丁基氟化铵脱除保护基Teoc；
在一些实施方案中，1位Ser的保护基为Fmoc保护基，即片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Fmoc保护基，片段A和片段B偶联完毕加入二乙胺脱除保护基Fmoc。
本发明所述制备方法步骤4将特立帕肽粗肽纯化得到特立帕肽，其中所述纯化优选为反相高效液相色谱纯化。
反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquidchromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离纯化。
优选的，所述反相高效液相色谱法具体为：以反相十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，得到的特立帕肽粗肽溶液上样后，用0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分。
进一步的，在反相高效液相色谱纯化后冻干得到特立帕肽。
其中，特立帕肽的纯度检测方法如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C18 4.6×250mm×5μm 300A)；以50mmol/L硫酸铵溶液(用稀硫酸调pH至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B；采用以下条件梯度洗脱。流速为1.0ml/min；柱温为25℃；检测波长为214nm。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
实施例1：片段一(Msz-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL)的合成
称取替代度为0.5mmol/g的Rink Amide Resin 20.0g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，抽去溶液，称取18.7g(50mmol)3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸和8.1g(60mmol)HOBt溶于DMF，冰浴下加入8.2g(65mmol)DIPCDI，加入固相反应柱中，室温反应2小时，抽去溶液，DMF洗涤3次。20％哌啶溶液脱除Fmoc保护基团(反应时间5+7分钟)，DMF洗涤6次。
按照片段一的肽序，重复上述氨基酸偶联和脱除Fmoc保护基团的步骤，采用偶联剂HOBt/DIPCDI或HOBt/PyBop/DIPEA或HATU/HOAt/DIPEA或HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA，依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Msz-Ser(tBu)-OH。
称取10.1g(50mmol)对硝基氯甲酸苯酯溶于二氯甲烷，加入固相反应柱中，室温反应1小时，再加入12.9g(100mol)DIPEA，反应30分钟，抽去溶液，二氯甲烷洗涤6次。另称取10.6g(100mmol)碳酸钠、100ml水杨醛溶于DCM/THF(1:3)的混合溶液，加至上述肽树脂中，室温反应过夜，过滤，滤液减压浓缩得到至干。最后将其用TFA/H2O(95:5)裂解2小时，乙醚沉淀，得到片段一19.2g。
实施例2：片段二(Teoc-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL)的合成
称取替代度为0.6mmol/g的2-Cl-CTC Resin 16.7g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，抽去溶液，称取7.48g(20mmol)3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸溶于DMF，冰浴下加入5.2g(40mmol)DIPEA，加入固相反应柱中，室温反应0小时，再加入6ml甲醇封闭树脂1小时，抽去溶液，DMF洗涤6次。
按照实施例1中的方法，按照片段二的肽序，依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Teoc-Ser(tBu)-OH。
称取6.1g(30mmol)对硝基氯甲酸苯酯溶于二氯甲烷，加入固相反应柱中，室温反应1小时，再加入7.7g(60mol)DIPEA，反应30分钟，抽去溶液，二氯甲烷洗涤6次。另称取6.4g(60mmol)碳酸钠、60ml水杨醛溶于DCM/THF(1:1)的混合溶液，加至上述肽树脂中，室温反应过夜，过滤，滤液减压浓缩得到至干。最后将其用TFA/H2O(95:5)裂解2小时，乙醚沉淀，得到片段二10.5g。
实施例3：片段三(Fmoc-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL)的合成
1位丝氨酸采用Fmoc-Ser(tBu)-OH，其他合成方法同实施例1。
实施例4：片段四(Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH)的合成
称取替代度为0.8mmol/g的Wang Resin 62.5g(50mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂3分钟后，称取19.37g(50mmol)Fmoc-Phe-OH、8.1g(60mmol)HOBt和6.1g(5mmol)DMAP溶于DMF，冰浴下加入8.2g(65mmol)DIPCDI，加入固相反应柱中，室温反应2小时，DMF洗涤6次。再加入79.1g(1000mmol)吡啶和102.1g(1000mmol)乙酸酐混合液封闭树脂6小时，DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到71.4g Fmoc-Phe-Wan gResin，检测替代度为0.3mmol/g。
按照实施例1中的方法，按照片段四的肽序依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到的肽树脂用TFA/TIS(95:5)裂解2小时，乙醚沉淀，得到片段四23.2g。
实施例5：特立帕肽粗肽的合成
将实施例1得到的片段一19.2g(10mmol)和实施例4得到的片段四23.2g(10mmol)溶于吡啶/醋酸缓冲溶液(1:1，10mM)，室温反应2小时，减压浓缩至干，加入TFA/碘化铵/二甲硫醚(90:5:5)反应30分钟，乙醚沉淀，得到特立帕肽粗肽37g，纯度80.10％，重量收率90％。纯度检测结果见图2及表1。
实施例6：特立帕肽粗肽的合成
将实施例2得到的片段二21.9g(10mmol)和实施例4得到的片段四23.2g(10mmol)溶于吡啶/醋酸缓冲溶液(1:1，10mM)，室温反应3小时，再加入26.15g四丁基氟化铵(100mmol)反应过夜，得到特立帕肽粗肽溶液直接进行纯化，粗肽纯度67.97％。纯度检测结果见图3及表1。
实施例7：特立帕肽粗肽的合成
将实施例3得到的片段三21.5g(10mmol)和实施例4得到的片段四23.2g(10mmol)溶于吡啶/醋酸缓冲溶液(1:1，10mM)，室温反应4小时，减压浓缩至干，加入甲醇溶解，再加入14.63g二乙胺(200mmol)，室温反应2小时，减压浓缩至干，得到特立帕肽粗肽45g，纯度63.22％，重量收率109％。纯度检测结果见图4及表1。
实施例8：特立帕肽粗肽的纯化
将实施例5得到的特立帕肽粗肽采用HPLC进行纯化，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，0.1％TFA溶液和乙腈作为流动相流，收集目标馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到特立帕肽精肽18.5g，纯度99.92％，单个最大杂质0.05％，总收率45％。纯度检测结果见图5及表1。
将实施例6得到的特立帕肽粗肽采用上述相同条件纯化，得到特立帕肽精肽14.8g，纯度99.76％，单个最大杂质0.07％，总收率36％。
将实施例7得到的特立帕肽粗肽采用上述相同条件纯化，得到特立帕肽精肽14.0g，纯度99.73％，单个最大杂质0.06％，总收率34％。
表1：本发明实施例实验条件和结果对比
与现有方法对比，本发明所述制备方法操作简单，生产效率高、适合于特立帕肽的大规模生产，同时制得的特立帕肽纯度高，易于纯化。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种制备特立帕肽的方法，其特征在于，包括：
步骤1：将3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和PG-Ser(tBu)-OH，然后通过对硝基氯甲酸苯酯关环形成苯并咪唑酮，最后通过水杨醛处理和TFA裂解得到片段A PG-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SAL；步骤1所述PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基、Teoc保护基、Fmoc保护基；
步骤2：将Fmoc-Phe-OH与固相载体偶联，再按照肽序从C端至N端依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Fmoc-Ser（tBu）-OH，TFA裂解得到片段B Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH；
步骤3：将片段A和片段B偶联，然后脱除片段A中1位Ser的保护基得到特立帕肽粗肽；
步骤4：特立帕肽粗肽纯化得到特立帕肽；
其中步骤1和步骤2顺序不分先后。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述固相载体为Rink Amide Resin或2-Cl-CTC Resin。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1所述裂解的裂解剂为TFA与水的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述固相载体为Wang Resin。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述偶联的偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/DMAP/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA、HOAt/PyAop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2所述裂解的裂解剂为TFA与TIS的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述偶联的具体操作为溶于吡啶/醋酸缓冲溶液反应2-4小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述脱除片段A中1位Ser的保护基的具体操作为：
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Msz保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入TFA/碘化铵/二甲硫醚脱除保护基Msz，乙醚沉淀；
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Teoc保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入四丁基氟化铵脱除保护基Teoc；
片段A中PG-Ser(tBu)-OH的PG为Fmoc保护基时，片段A和片段B偶联完毕加入二乙胺脱除保护基Fmoc。
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