CN112175046A - 一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，该一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法包括以下步骤：1)用多肽固相法合成化合物1：Boc‑Pyr‑His(Boc)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp(Boc)‑Leu‑OH；2)用多肽液相法合成化合物2：Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；3)在液相中合成化合物3：Boc‑Pyr‑His(Boc)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Gly‑Leu‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；4)合成曲普瑞林粗品：Pyr‑His‑Trp‑Ser‑Tyr‑D‑Trp‑Leu‑Arg‑Pro‑Gly‑NH2，本发明用CTC树脂合成片段，结合液相法合成戈那瑞林，CTC树脂合成片段可以方便自动化生产，CTC树脂可以回收重复利用，极大降低了用Rink树脂进行固相合成的成本，Rink树脂的价格要比CTC树脂高很多，并且不能回收再次使用；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法。
背景技术
中文名∶曲普瑞林，英文名∶Triptorelin结构式∶pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；分子量∶1311.5
曲普瑞林临床用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症等。
曲普瑞林是一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌减少。醋酸曲普瑞林用于治疗相关性激素病症，包括：晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症。
1974年日本武田化工的FujinoMashiko等人首先发明促黄体激素释放激素的十肽酰胺类似物的合成工艺。并在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为∶JP1974002742、DE246005、US008209(液相法)。
上述方法均存在着一定的缺陷，每一轮脱帽须用三氟醋酸，故接肽收率低，导致生产成本较高；三废污染多，并使用三氟醋酸进行纯化，污染环境，纯化收率一般在25％以下。因此目前的方法限制了醋酸曲普瑞林的大规模生产和使用。
现有技术中，申请号为200710044419.7公开了一种固相多肽合成曲普瑞林的制备方法，包括如下步骤：以.RinkAmideAM树脂或.RinkAmidMBHA树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoe-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得粗品，粗品经C18(或C8)柱分离纯化，冻干后，制得曲普瑞林精品。
现有技术中还公开了申请号为201310014882.2的涉及一种优良的曲普瑞林及其固相合成制备方法，其制法包括步骤∶
1)、向树脂中加入Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱进行偶联反应，形成Fmoc-Gly-树脂；
2)、加入脱帽试剂进行反应；接着加入保护氮基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，进行偶联反应形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；
3)、循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用曲另外9个氨基酸以替换Fmoc-Pro-OH；
4)、向所得十肽树脂中加入切割液进行切肽，使十肽切离树脂，任选地对曲普瑞林进行纯化。该方案选用哌啶为脱帽试剂，为易制毒试剂，价格较高，且不易储存。对于现有的合成方法而言，将上述现有技术进行工业化生产依然存在生产成本高的问题。
发明内容
基于此，有必要针对背景技术中存在的问题，提供一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法。
本发明的技术方案是构造一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2
4)合成曲普瑞林粗品：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
在其中一个实施例中，步骤1)中，化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-D-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
脱帽试剂为哌嗪溶液，溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH。
在其中一个实施例中，步骤2)中，化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，H-Gly-NH2·HCl为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2；
3)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
在其中一个实施例中，步骤3)中，化合物3可以通过液相法合成：
以化合物1和化合物2为合成片段；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01～1：1.5，化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
在其中一个实施例中，曲普瑞林粗品纯度可以达到90％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到曲普瑞林粗品。
本发明的优点和有益效果如下：
用CTC树脂合成片段，结合液相法合成戈那瑞林，CTC树脂合成片段可以方便自动化生产，CTC树脂可以回收重复利用，极大降低了用Rink树脂进行固相合成的成本，Rink树脂的价格要比CTC树脂高很多，并且不能回收再次使用；首次报道哌嗪替代了经典的哌啶作为脱帽试剂，哌啶为易制毒试剂，液体容易变质，难以管理，价格较高；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应，降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明的化合物1的HPLC图。
图2为本发明的化合物1去保护基样品的MS图。
图3为本发明的Fmoc-Pro-Gly-NH2.HCl的HPLC图谱。
图4为本发明的H-Pro-Gly-NH2的HPLC图谱。
图5为本发明的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2.HCl的HPLC图谱。
图6为本发明的H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2的HPLC图谱。
图7为本发明的H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2的MS图谱。
图8为本发明的化合物3的HPLC图谱。
图9为本发明的曲普瑞林粗品的HPLC图。
图10为本发明的曲普瑞林粗品的MS图。
图11为本发明的另一实施例的化合物1的HPLC图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2
4)合成曲普瑞林粗品：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
优选地，步骤1)中，化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-D-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
脱帽试剂为哌嗪溶液，溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
优选地，脱帽试剂的溶剂为DMF，哌嗪的质量浓度为3％。
所述哌嗪溶液的体积优选为按树脂的质量计算；
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH。
具体地，化合物1的合成过程如下：
投料表如下：
一、Leu-树脂的合成；
1).称25gCTC树脂于250ml固相合成反应器中，取Fmoc-Leu-OH于250ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM共120ml，摇匀，加DIEA41ml，摇匀溶解，倒入反应器开始反应。反应1h时，用抽滤装置抽去反应液，用DMF洗4次；
2).量取200ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
3).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
二、D-Trp(Boc)-Leu-树脂的合成；
1).得到Leu-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA，溶剂为DMF，反应时间为2小时，反应完成后，用DMF洗涤4遍；
2).反应完全的检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阴性。
3).得到Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-树脂后，量取200ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
4).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
5).获得D-Trp(Boc)-Leu-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在D-Trp(Boc)-Leu-树脂上连接氨基酸保护单体：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pyr-OH后获得：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：
加1％TFA/DCM溶液150ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复6次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH，34.3g，纯度94.3％，收率90.5％。(RP-HPLC图见图1；其裂解的无保护样品MS图见图2})
参照图1，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度洗脱：0～30min；70％B～75％B；
λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
优选地，步骤2)中，化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，H-Gly-NH2为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2；
3)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2,
4)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
具体地，化合物2的合成过程如下：
1).合成Fmoc-Pro-Gly-NH2：
称Fmoc-Pro-OH，100mmol，33.7g，BOP110mmol，49g溶于500mlDMF中，冷浴10min，加入TEA110mmol，12g。然后称取H-Gly-NH2.HCl，110mmol，12g，用100mlDMF+12gTEA溶解，倒入上述反应液，反应2h，HPLC显示反应完全，加入0.5M盐酸析出，过滤，得白色固体产物，真空干燥，得产物47.2g，纯度99.1％，收率110％。(RP-HPLC图见附图3)。
参照图3，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFAB：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B50％～90％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
2).合成H-Pro-Gly-NH2：
将产物用二乙胺500ml溶解，搅拌30min，HPLC显示反应完全。浓缩除去二乙胺，加石油醚析出，得到黄色稠状产物，H-Pro-Gly-NH2，纯度92.9％，真空干燥。(RP-HPLC图见图4)
参照图4，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～10min，B30％～60％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
3).合成Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2.HCl：
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH：80mmol，52g用400mlDMF溶解，加入BOP：88mmol，39g，溶解后冰浴，然后加入TEA：88mmol，9g，另上述H-Pro-Gly-NH2用DMF50ml溶解加入加入到以上溶液中，2h后，HPLC显示反应完全，加入0.5M盐酸析出，过滤，得白色固体产物，真空干燥，得产物70.1g，纯度91.1％，收率104.6％。(RP-HPLC图见图5)
参照图5，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B55％～65％；λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
4).合成Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2：
将Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2溶于300ml二乙胺，反应30min，TLC显示反应完全，浓缩至少量，加石油醚析出，过滤，真空干燥，得到化合物2类白色固体56.9g，纯度97.5％，收率122％。(RP-HPLC图见图6，MS图见图7)。
参照图6，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B0％～10％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
优选地，步骤3)中，化合物3可以通过液相法合成：
以化合物1和化合物2为合成片段；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01—1：1.5，化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
具体地，化合物3合成过程如下：
1).化合物1 10mmol，15.2g和BOP11mmol，4.9g溶于20mlDMF，加入活化剂HOBt和有机碱DIEA溶解，-5℃冷浴10min；
2).另取化合物2 12mmol，7g，溶于20mlTHF中，反应2h，HPLC检测反应完全。浓缩，加入0.5M盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性。真空干燥，得产物曲普瑞林前体(化合物3)：22.3g，产率105.6％，纯度96.1％。(RP-HPLC图见图8。)
参见图8，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B70％～75％；λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
优选地，曲普瑞林粗品纯度可以达到80％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到曲普瑞林粗品。
具体地，曲普瑞林粗品合成过程如下：
1).取250ml圆底烧瓶，称曲普瑞林前体(化合物3)10mmol(22.3g)投入，加入切肽试剂(TFA：TIS：H2O＝95：2.5：2.5)切割，得到含有曲普瑞林粗品的TFA溶液。
2).浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚。离心，真空干燥得曲普瑞林三氟乙酸盐粗品，11.8g，纯度88.9％，收率82.6％。(RP-HPLC图见图9，MS图见图10)
参见图9，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail 100-5 C18 column 4.6*250mm；
流动相：缓冲液：0.1M磷酸，三乙胺调节pH至3，缓冲液：乙腈：甲醇＝70：20：10；
等度洗脱；λ＝230nm；流速＝1.0ml/min。
由以上实施例可知，本发明提供的曲普瑞林的制备方法，采用固相合成法合成化合物1，液相合成法合成化合物2，然后再将两个中间体缩合得到化合物3，脱保护后得到曲普瑞林，简化了曲普瑞林的制备步骤，降低了曲普瑞林制备成本；采用本发明所述的方法制备得到的曲普瑞林纯度高达90％左右。
实施例2
与上述实施例的不同之处在于，本实施例通过回收树脂合成化合物1：
将实施例1的树脂用DMF洗涤，甲醇洗涤，抽去滤液，真空干燥。另配置二氯亚砜的DCM溶液(二氯亚砜10ml，DCM＝200ml)，加入装有树脂的250ml固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤。
投料表如下：
一、Leu-树脂的合成；
1).称25gCTC树脂于250ml固相合成反应器中，取Fmoc-Leu-OH于250ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM共120ml，摇匀，加DIEA41ml，摇匀溶解，倒入反应器开始反应。反应1h时，用抽滤装置抽去反应液，用DMF洗4次；
2).量取200ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
3).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
二、D-Trp(Boc)-Leu-树脂的合成；
1).得到Leu-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA，溶剂为DMF，反应时间为2小时，反应完成后，用DMF洗涤4遍；
2).反应完全的检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阴性。
3).得到Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-树脂后，量取200ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
4).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
5).获得Trp(Boc)-Leu-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在D-Trp(Boc)-Leu-树脂上连接氨基酸保护单体Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pyr-OH后获得Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：
加1％TFA/DCM溶液150ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复6次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到化合物1：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH，29.9g，纯度93.3％，收率78.9％。(RP-HPLC图见图11)
参照图11，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈/H2O，0.1％TFA(HPLC)；
梯度洗脱：0～30min；70％B～75％B；
λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2
4)合成曲普瑞林粗品：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
2.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于：步骤1)中，化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-D-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
脱帽试剂为哌嗪溶液，溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH。
3.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于：步骤2)中，化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，H-Gly-NH2为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2；
3)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
4.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于：步骤3)中，化合物3可以通过液相法合成：
以化合物1和化合物2为合成片段；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01～1：1.5，化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
5.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于，曲普瑞林粗品纯度可以达到80％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到曲普瑞林粗品。
6.根据权利要求5所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于，由化合物3获得粗品的步骤如下：
1)取烧瓶，称化合物3投入，加入切肽试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)切割，得到含有曲普瑞林粗品的TFA溶液；
2)浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚；
3)离心，真空干燥得曲普瑞林三氟乙酸盐粗品。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于，化合物3合成步骤如下：
1)取化合物1和缩合剂溶于DMF，加入活化剂和有机碱溶解，-10～5℃冷浴5～15min；
2)另取化合物2溶于THF中，反应1.5～2.5h，HPLC检测反应完全。浓缩，加入盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性；
3)真空干燥，得到化合物3。
8.根据权利要求1～6任一项所述的一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法，其特征在于，使用后的树脂回收步骤如下：
1)将树脂用DMF洗涤；
2)甲醇洗涤，抽去滤液，真空干燥；
3)另配置二氯亚砜的DCM溶液，加入装有树脂的固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤。
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