CN104387454A - 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法 - Google Patents

一种片段缩合制备曲普瑞林的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液相中，脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保护的曲普瑞林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸曲普瑞林；其中，所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1～7位氨基酸，所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8～10位氨基酸。本发明利用固液相结合片段缩合的方法制备曲普瑞林，提高了产率和纯度，成本低，利于大规模生产。

Description

一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种片段缩合制备曲普瑞林的方法。
背景技术
曲普瑞林，英文名：Triptorelin，商品名：达菲林、达必佳，肽序列为：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，分子式：C64H82N18O13，分子量：1310.63。
曲普瑞林作为一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，临床用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤、体外受精、中枢性性早熟症等。
目前曲普瑞林的制备方法主要以逐个缩合为主。例如专利US4010125使用Benzhydryl amine树脂为起始原料，以Boc保护的氨基酸为单体，专利CN200710044419.7和CN201310013712.2以及CN201310014882.2，均以Rink Amide MBHA树脂或者RinkAmide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次逐个接上氨基酸，裂解获得曲普瑞林粗品，最后HPLC进行分离纯化，获得目标产物。
以上方法有如下一些问题：a)曲普瑞林序列中存在Arg-Pro，在常规条件下用固相方法缩合需要过量氨基酸，且缩合效率低，容易出现缺陷肽。这是由于氨基酸自身结构导致的立体位阻使得缩合反应极为困难。b)使用Rink树脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合成不经济；并且相对于2-氯-三苯甲基氯树脂价格不菲。c)全液相合成时，需要良好的后处理技术。
所以本领域技术人员仍然期待以高收率、低成本获得具有良好品质的产品。
发明内容
本发明针对现有制备方法收率低，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的曲普瑞林的问题，提供一种固液相结合片段缩合的方法制备曲普瑞林，提高产率和纯度；由于采用2-氯-三苯甲基氯树脂使得成本降低，利于大规模生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
方案一：
一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液相中，脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保护的曲普瑞林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸曲普瑞林；
其中，
所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1～7位氨基酸，
所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8～10位氨基酸。
上述片段缩合制备曲普瑞林的方法优选包括以下步骤：
(1)固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列树脂，
所述的全保护第一肽片段序列为：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH，
将全保护第一肽片段序列从固相载体上裂解；
(2)液相合成曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列，
所述的全保护的第二肽片段序列为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2；
脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基；
(3)液相中将步骤(2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤(1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林；
(4)将全保护曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
(5)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
步骤(1)中，全保护的第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。
固相制备曲普瑞林全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百分含量为0.5～1％TFA的DCM溶液。
步骤(2)中，液相合成全保护的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH与H-Gly-NH2反应得到Fmoc-Pro-Gly-NH2，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Arg(Pbf)-OH反应得到Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2。
所述脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基也就是脱去Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2的Fmoc保护，得到H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2。
氨基脱保护试剂为体积百分含量16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液，或者体积百分含量为50％的二乙胺的DCM溶液；优选体积百分含量为50％二乙胺的DCM溶液。缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选THF。
步骤(3)中，将步骤(2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤(1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林过程中，使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。
步骤(4)中，全保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。
步骤(5)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为0.25％v/v醋酸水溶液和80％v/v乙腈水溶液。
方案二：
一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂，然后将全保护的第三肽片段序列从树脂上裂解下来，液相中与H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林，然后脱去侧链保护得到曲普瑞林粗品，纯化转盐得到醋酸曲普瑞林；
其中，所述的第三肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
上述片段缩合制备曲普瑞林的方法，优选包括以下步骤：
(a)固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂，
所述的曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列为：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH，
将全保护的第三肽片段序列从固相载体上裂解；
(b)液相中全保护第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林；
(c)将全保护的曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
(d)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
步骤(a)中，曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得肽树脂；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。
固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百分含量为0.5～1％TFA的DCM溶液。
步骤(b)中曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1:1。
步骤(c)中，全保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。
步骤(d)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为醋酸水溶液和乙腈水溶液。
有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明利用较高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技术合成选定结构的高纯度肽片段，液相合成困难序列，再采用液相偶联技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(>98.5％)、高收率(>40％)的目标肽。
2、在合成存在“困难序列”的多肽时，往往采用片段缩合法。相比较连续固相与全液相合成曲普瑞林的工艺，本发明：
a.2-氯-三苯甲基氯树脂重复使用方法简便，价格低廉；每个片段可使用高荷载量(>0.8mmol/g树脂)的固相载体，物料通量增加；
b.避开困难序列的肽片段合成中氨基酸及试剂投量为1.5-2倍量，远低于固相肽合成常规的3-4倍甚至5倍、6倍过量，节约物料成本；
c.相比较全液相合成，固液相结合片段缩合技术取二者之优点，兼有固相合成工艺简便和液相合成的低物料投入。
3、采用超酸敏感型树脂合成的较短氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低了曲普瑞林的制备成本，有利于实现规模化、产业化生产。
附图说明
图1为本发明制备的曲普瑞林纯肽分析色谱图；
图2为本发明制备的曲普瑞林纯肽质谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中，合成曲普瑞林所涉及的目的肽及中间体的肽片段氨基酸序列见表l。本发明中肽片段组合方式见表2。所使用的物料缩写的含义见表3。
表1 曲普瑞林相应的编码氨基酸序列
肽序号 氨基酸序列 相应编码氨基酸
曲普瑞林 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 1-10
第一肽片段序列 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-OH 1-7
第二肽片段序列 H-Arg-Pro-Gly-NH2 8-10
第三肽片段序列 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-OH 1-9
表2 组合方法
本文中，“取代值”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。
表3 本发明所使用的物料缩写含义
英文缩写 全称
Fmoc 9-芴甲氧羰基
2-CTC Resin 2-氯-三苯甲基氯树脂
RP-HPLC 反相高效液相色谱
DMF N,N-二甲基甲酰胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
DMSO 二甲基亚砜
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
DIEA N,N-二异丙基乙胺
NMM N-甲基吗啡啉
HOBt 1-羟基苯并三氮唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
PyBOP 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基
EDC 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
EDT 1,2-乙二硫醇
TIS 三异丙基硅烷
Boc- 叔丁氧羰基
-Pbf 2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
-tBu 叔丁基
-Trt 三苯甲基
实施例1：
1.树脂制备
制备Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Leu-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.82g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.52mmol/g。
2.片段制备
2.1肽片段AA(1-7)-OH的制备：
向肽反应室中加入5g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-D-Trp(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mLDMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Tyr(tBu)、Ser(tBu)、Trp(Boc)、His(Trt)、Pyr各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.78g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.84g纯度97％AA(1-7)-OH，产率95％。
上述制备的片段AA(1-7)-OH的结构如下：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH
分子式：C88H105N11O15，分子量：1555.778。
2.2肽片段AA(8-10)-NH2的制备：
圆底烧瓶中加入110mg H-Gly-NH2·HCl(1mmol)、110μL NMM(1mmol)、371mgFmoc-Pro-OH(1.1mmol)和149mg HOBt(1.1mmol)。将所述固体溶解于20mL THF，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入139mg DIC(1.1mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温过夜。反应混合物过滤，滤液浓缩，油状物乙酸乙酯溶解，分别用饱和碳酸氢钠水溶液、5％柠檬酸水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋转蒸发，油状物用MTBE研磨，得386mgFmoc-Pro-Gly-NH2，收率98％。
圆底烧瓶中加入385mg Fmoc-Pro-Gly-NH2(0.98mmol)，用10mL 50％二乙胺/DCM溶液脱去Fmoc基团，室温磁力搅拌过夜，后处理得到166mg H-Pro-Gly-NH2，收率99％。
圆底烧瓶中加入714mg Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.1mmol)、165mg H-Pro-Gly-NH2(0.96mmol)和149mg HOBt(1.1mmol)。将所述固体溶解于20mL THF，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入139mg DIC(1.1mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温过夜。反应混合物过滤，滤液浓缩，油状物乙酸乙酯溶解，分别用饱和碳酸氢钠水溶液、5％柠檬酸水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋转蒸发，油状物用MTBE研磨，得740mg Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2，收率96％。
圆底烧瓶中加入738mg Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2(0.92mmol)，用10mL 50％二乙胺/DCM溶液脱去Fmoc基团，室温磁力搅拌过夜，后处理得到522mgH-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2，收率98％。
制备的AA(8-10)-NH2的结构如下：
H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2
分子式：C26H41N7O6S，分子量：579.28。
3.片段缩合过程
通过液相缩合片段制备AA(1-10)-NH2
圆底烧瓶中加入1.556g AA(1-7)-OH(1mmol)、522mg AA(8-10)-NH2(0.9mmol)和135mg HOBt(1mmol)。将所述固体溶解于20mL DMF，加入330μL DIEA(2mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入379mg HBTU(1mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌1小时。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×50mL水洗涤，干燥获得2.01g粗品AA(1-10)-NH2。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得1.85g AA(1-10)-NH2，收率97％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
AA(1-7)-OH，Rf：0.45；
AA(8-10)-NH2，Rf：0.28；
AA(1-10)-NH2，Rf：0.33。
制备的AA(1-10)-NH2的结构如下：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2
分子式：C114H144N18O20S，分子量：2117.05。
4.曲普瑞林的裂解及纯化
4.1通过去除侧链保护AA(1-10)-NH2制备曲普瑞林粗肽
圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5:2.5:2.5:2.5)溶液50mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入1.12g AA(1-10)-NH2。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后升至室温，搅拌3小时。将该溶液加入0℃乙醚70mL沉淀所述肽。以3000rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析乙醚。将所述固体再悬浮于50mL乙醚中，以3000rpm离心旋转5分钟，倾析乙醚。重复一次，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1:1水/乙腈30mL中，在室温下保存24小时。将该溶液冷冻，然后冷冻干燥获得680mg曲普瑞林粗肽，产率98％。
4.2HPLC纯化曲普瑞林粗肽
45mg曲普瑞林粗肽经制备型HPLC纯化产生全长曲普瑞林纯品21.1mg，产率47％。
HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18250×19,5u,130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.80％乙腈/水；B.0.25％醋酸/水；方法：20％-45％A，10min；45-60％A，30min。
曲普瑞林纯肽色谱图见图1，纯肽质谱图见图2。
曲普瑞林的结构如下：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
分子式：C64H82N18O13，分子量：1310.63。
实施例2：
1.树脂制备
制备Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Pro-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.69g Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.46mmol/g。
2.片段制备
肽片段AA(1-9)-OH的制备：
向肽反应室中加入5g Fmoc-Pro-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Leu、D-Trp(Boc)、Tyr(tBu)、Ser(tBu)、Trp(Boc)、His(Trt)、Pyr各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mLDMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得9.38g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.41g纯度96％AA(1-9)-OH，产率93％。
上述制备的片段AA(1-9)-OH的结构如下：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH
分子式：C112H140N16O20S，分子量：2061.015。
3.片段缩合过程
通过液相缩合片段制备AA(1-10)-NH2
圆底烧瓶中加入1.11g AA(1-9)-OH(0.54mmol)、297mg H-Gly-NH2·HCl(2.7mmol)和81mg HOBt(0.6mmol)。将所述固体溶解于20mL DMF，加入645μL DIEA(3.9mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入227mg HBTU(0.6mmol)。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升至室温，再搅拌1小时。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×50mL水洗涤，干燥获得1.15g粗品AA(1-10)-NH2。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得1.12gAA(1-10)-NH2，收率98％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
AA(1-9)-OH，Rf：0.38；
AA(1-10)-NH2，Rf：0.33。
制备的AA(1-10)-NH2的结构如下：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2
分子式：C114H144N18O20S，分子量：2117.05。
4.曲普瑞林的裂解及纯化同实施例1。

Claims (10)

1.一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液相中，脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保护的曲普瑞林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸曲普瑞林；
其中，
所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1～7位氨基酸，
所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8～10位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列树脂，
所述的全保护第一肽片段序列为：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-OH，
将全保护第一肽片段序列从固相载体上裂解；
(2)液相合成曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列，
所述的全保护的第二肽片段序列为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2；
脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基；
(3)液相中将步骤(2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤(1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林；
(4)将全保护曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
(5)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
3.根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(1)中，全保护的第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂；
固相制备曲普瑞林全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。
4.根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(2)中，液相合成全保护的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH与H-Gly-NH2反应得到Fmoc-Pro-Gly-NH2，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Arg(Pbf)-OH反应得到Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2；
所述脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基也就是脱去Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2的Fmoc保护，得到H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2；
氨基脱保护试剂为体积百分含量16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液，或者体积百分含量为50％的二乙胺的DCM溶液；缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应使用的反应溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。
5.根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤(1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林过程中，使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。
6.一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂，然后将全保护的第三肽片段序列从树脂上裂解下来，液相中与H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林，然后脱去侧链保护得到曲普瑞林粗品，纯化转盐得到醋酸曲普瑞林；
其中，所述的第三肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
7.根据权利要求6所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(a)固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂，
所述的曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列为：
Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH，
将全保护的第三肽片段序列从固相载体上裂解；
(b)液相中全保护第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林；
(c)将全保护的曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
(d)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
8.根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(a)中，曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得肽树脂；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂；
固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。
9.根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(b)中曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。
10.根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤(c)中，全保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。
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