CN104004064A - 一种布舍瑞林的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种布舍瑞林的制备方法，所述方法包括步骤：(1)固相合成七肽X-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-OH,X为H或者Z；(2)将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl在液相缩合得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；(3)将七肽和二肽在液相进行片段缩合，得到九肽X-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NHEt；和(4)将九肽氢化得到布舍瑞林粗品。

Description

一种布舍瑞林的制备方法
技术领域
本发明涉及医药多肽类原料药的化学合成，尤其涉及一种布舍瑞林的固相和液相结合的合成方法。
背景技术
布舍瑞林肽序为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，分子式：C60H86N16O13,分子量为1239.42，其结构式如下：
布舍瑞林是一种促性腺生成激素释放激素(GnRH)类似物,能够促进卵泡生成激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)的释放，临床用于治疗前列腺癌、子宫内膜异位症以及不孕症。该多肽为赛诺菲-安万特制药公司研制生产，1984年在德国上市，商品名为suprecur。
关于布舍瑞林的化学合成时有报道，但所得粗品的收率或纯度都不高，有的工艺还存在成本高的问题。CN101935339A公开的方法中使用HMPB-MBHA树脂为载体，价格昂贵，不利于大量生产。有的方法涉及的保护基多，操作繁琐，效率低，也不利于规模化生产，如CN102190709A、CN101735308A及US6211333B1。CN103554229A使用的方法不能完全脱除保护基，影响了粗肽纯度和收率。JP2006169165使用一种微通道反应器合成布舍瑞林,该方法中使用三肽片段pGlu-His-Trp-OH和H-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在HBTU/DIPEA作缩合剂，33％NMP/DMF作溶剂条件下缩合得到布舍瑞林粗肽,片段中多个氨基酸侧链未保护，在进行片段缩合时产生较多杂质，使得粗品纯度和收率低。另外该装置也只适合于小规模多肽的合成，不适合放大生产。
因此，本领域迫切需要提供一种适于规模化生产的布舍瑞林合成方法来生产高纯的产品，以满足医药用途。
发明内容
本发明旨在提供一种新的布舍瑞林制备方法。
本发明提供了一种布舍瑞林粗品的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)固相合成七肽全保护肽：X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH,X为H或者Z；
(2)将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl在液相体系中缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；
(3)将步骤(1)得到的七肽全保护肽和步骤(2)得到的二肽在液相进行片段缩合，用纯水沉降，得到侧链带保护基的九肽X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt；
(4)将步骤(3)得到的侧链带保护基的九肽氢化，脱除Bzl,Z和Trt保护基，得到布舍瑞林粗品。
在另一优选例中，在步骤(1)中，合成全保护七肽时所使用的保护氨基酸如下：Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH，Pyr-OH或者Z-Pyr-OH或者Z-Pyr-OSu。
在另一优选例中，所述步骤(2)是将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl在液相体系中通过缩合剂缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,再使用适当浓度的HCl/EA溶液脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl。
在另一优选例中，步骤(3)中，7+2片段缩合也是在液相体系中通过缩合剂缩合得到全保护肽九肽。
在另一优选例中，全保护肽七肽使用2-CTC树脂进行固相合成，投料摩尔比(投料时所使用的保护氨基酸与合成规模的物质的量之摩尔比)为1.5-6倍。
在另一优选例中，在合成全保护肽七肽，二肽以及7+2片段缩合时可使用如下缩合剂组合中的任意一种：DIC/Y,EDC.HCl/Y,HBTU/Y/Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z；其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z＝DIPEA或NMM或TMP。
在另一优选例中，步骤(4)中氢化是将九肽溶于适当浓度的AcOH/H2O溶液中，用Pd/C作催化剂，通入H2氢化，滤除Pd/C后将滤液加入到冰冻MTBE或乙醚中，过滤收集固体，干燥得到布舍瑞林粗品。
据此，本发明提供了一种可行的布舍瑞林合成方法来生产高纯的产品，以满足医药用途。
附图说明
图1显示了实施例得到的布舍瑞林粗品HPLC图：保留时间RT＝34.956min,纯度93.8％。
图2显示了实施例得到的布舍瑞林粗品ESI-MS图：[M+H]+＝1239.75,[M+2H]2+＝620.42。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现可以固相和液相结合的方式合成布舍瑞林。具体地，包括采用固相合成的方式得到侧链带有保护基的7肽，在液相中缩合并脱保护基得到2肽，然后再在液相中将先前分别得到的7肽与2肽缩合得到侧链带有保护基的9肽，最后将在醋酸溶液中的侧链带有保护基的9肽通过氢化脱除全保护肽9肽侧链保护基(D-Ser侧链保护基tBu会保留)得到布舍瑞林粗品。在此基础上，完成了本发明。
如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptide synthesis)”是一种本领域熟知的多肽合成技术，包括但不限于下述方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接(键合)在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸接到固相载体上；然后氨基被封闭(保护)的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应(缩合)形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键(切割)，得到合成好的肽。
如本文所用，“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用，都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂。
如本文所用，“缩合剂”、“活化剂”、“活化试剂”或“缩合活化剂”可以互换使用，都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液，优选含有TFA、TIS和EDT的苯酚水溶液。
如本文所用，“HPLC纯度”是指将制备得到的多肽产品，经过HPLC检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而得到的目标多肽化合物的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。
如本文所用，“布舍瑞林粗品”是指HPLC纯度在40％-95％％的布舍瑞林产品。
布舍瑞林的结构式如式Ⅰ所示：
Pyr1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-D-Ser(tBu)6-Leu7-Arg8-Pro9-NHEt Ⅰ
本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表：
本发明提供的固液结合制备布舍瑞林粗品的方法包括如下步骤：
第一步，使用2-CTC Resin合成七肽全保护肽：X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH,X为H或者Z；
第二步，在液相体系下，将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl通过缩合剂缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,并用HCl/EA溶液脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；
第三步，在液相体系下，将第一步得到的七肽全保护肽和第二步得到的得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl通过缩合剂进行片段缩合，得到侧链带保护基的九肽X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt；
第四步，将第三步得到的侧链带保护基的九肽溶于AcOH/H2O溶液中，通入H2氢化脱除Bzl,Z和Trt保护基得到布舍瑞林粗品。
在上述第一步中，将Fmoc-Leu-OH连接到2-CTC Resin载体上，得到Fmoc-Leu-CTC Resin，将Fmoc-Leu-CTC Resin脱保护得到H-Leu-CTC Resin，并依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，依次偶联得到七肽全保护肽；制得的Fmoc-Leu-CTC Resin替代度范围为0.20mmo/g-1.00mmol/g,优先选择0.50mmol/g-0.90mmol/g。
上述第一步中，合成全保护七肽时所用的保护氨基酸为：Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH，Pyr-OH或者Z-Pyr-OH或者Z-Pyr-OSu。上述第一步合成全保护七肽时，氨基酸投料摩尔比为1.5-6倍，优先选择1.5-2.5倍。
在上述第二步和第三步中，缩合保护氨基酸，二肽制备和片段缩合时采用的缩合试剂为：DIC/Y,EDC.HCl/Y,HBTU/Y/Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z；其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z＝DIPEA或NMM或TMP，优先选择DIC/HOBt或HBTU/Cl-HOBt/DIPEA或HBTU/HOBt/NMM或PyBOP/HOBt/DIPEA。
上述第二步在制备全保护二肽时，Boc-Arg(Pbf)-OH与Pro-NHEt.HCl投料摩尔比为0.9-3/1,优先选择1.0-1.5/1；脱除二肽保护基时使用3N-7N HCl/EA溶液，优先选择4N-6N HCl/EA溶液。
上述第三步在进行7+2片段缩合时，二肽与全保护七肽投料摩尔比为1-3倍，优先选择1-1.5倍；反应pH值为6-10，优先选择pH值为7-9。
上述第三步进行7+2片段缩合后，用纯水沉降，过滤及干燥得到侧链带保护基的九肽；沉降时所使用的纯水用量为反应液体积的6-12倍，优先选择8-10倍。
上述第四步将第三步得到的侧链带保护基的九肽溶于AcOH/H2O溶液中，并使用Pd/C作催化剂，通入H2氢化并维持反应液在合适的温度，从而脱除Bzl,Z和Trt保护基；滤除Pd/C并将滤液加入到冰冻MTBE或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到布舍瑞林粗品。在九肽脱保护时使用的AcOH/H2O溶液中AcOH浓度为70％-99％，优先选择85％-96％。氢化时的反应温度为35-65℃，优先选择40-50℃。氢化反应时间为10-40h,优先选择15-30h；最后沉降时使用的MTBE或乙醚用量为滤液体积的6-12倍，优先选择8-10倍。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供的固液结合制备布舍瑞林粗品的方法包括如下步骤，上述各步骤中的具体条件和优选范围也可适用于以下步骤：
(i)使用缩合剂DIPEA将Fmoc-Leu-OH连接到2-CTC Resin载体上，得到Fmoc-Leu-CTC Resin；
(ii)将Fmoc-Leu-CTC Resin脱保护得到H-Leu-CTC Resin，并依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，依次偶联得到X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-2-CTC Resin,X为H或者Z；
(iii)裂解成全保护肽：X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH；
(iv)在液相体系下，将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl(市售)通过缩合剂缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt；
(v)用适当浓度的HCl/EA溶液脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；
(vi)在液相体系下，将七肽全保护片段和二肽通过缩合剂进行片段缩合，并用纯水沉降，过滤及干燥得到侧链带保护基的九肽X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt；
(vii)将步骤(vi)中所得的侧链带保护基的九肽溶于AcOH/H2O溶液中，并使用Pd/C作催化剂，通入H2氢化并维持反应液在合适的温度，从而脱除Bzl,Z和Trt保护基；和
(viii)滤除Pd/C并将滤液加入到冰冻MTBE或乙醚中，析出固体并过滤收集固体，干燥得到布舍瑞林粗品，纯度可达≥90％。
有关茚三酮显色法(Kaiser)、水合茚三酮试验(Ninhydrin test)，及其监控方法可以参见文献VIRENDER K.SARIN,et al.“Quantitative Monitoring ofSolid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction”ANALYTICALBIOCHEMISTRY117，147－157(1981)、E.KAISER,et al.“Color Test for Detectionof Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides”SHORTCOMMUNICATIONS595-598(Received October28,1969)、和THORKILDCHRISTENSEN“A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in SolidPhase Peptide Synthesis Using Chloranil”Acta Chemica Scandinavica B33(1979)763-766。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的合成布舍瑞林的方法，条件温和，操作简便，粗品纯度和产率均较高。
2、本发明提供的合成布舍瑞林的方法，成本低，环境污染小，易于工业化生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中涉及的布舍瑞林HPLC分析方法如下：
固定相：色谱柱Kromasil100-5C18柱(4.6*250mm)柱温30℃
流动相：ACN/H3PO4＝2/7(pH＝2.5)流速：1ml/min
梯度：100％流动相等度洗脱60min检测波长：220nm
实施例1
1.全保护七肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH的合成
称取50.0g2-CTC Resin(1.0mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取17.7gFmoc-Leu-OH并加入约200mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入8.7mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入17.5mLDIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.52mmol/g。
称取57.7g(30mmol)Fmoc-Leu-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉。加入适量5％PIP/1.25％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮。称取17.3gFmoc-D-Ser(tBu)-OH,6.1gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入7.9mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0-5℃，最后加入17.1gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全。反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr。
将上述所得82.1g片段(1-7)肽树脂加入到82mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体30.8g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1534.40；
2.二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl的合成
称取8.9gPro-NHEt.HCl于烧瓶中并加入适量DMF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性。称取29.0gBoc-Arg(Pbf)-OH,7.4gHOBt于烧杯中，加入DMF搅拌至溶解，随后加入19.2mLDIPEA并用冰水浴降温至0-5℃，再加入20.9gHBTU活化约10min,将活化液加入到溶有Pro-NHEt.HCl的烧瓶中，室温反应约4h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程。反应结束后，加入适量EA并搅拌均匀，随后依次加入5％H3PO4溶液,饱和NaHCO3溶液，饱和NaCl溶液，纯水并分别洗涤2-3遍，收集有机相并用无水Na2SO4干燥约2小时，过滤并将滤液真空浓缩，用PE重结晶，过滤并真空干燥得到28.7g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝651.30。
将所得28.7gBoc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt加入到280mL4NHCl/EA溶液中，室温搅拌过夜，可用HPLC监控反应进程，反应结束后，将析出的固体过滤，并用EA洗涤固体5-6遍，将固体放置真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体为16.9g,测得ESI-MS：[M+H]+＝373.10。
3.7+2片段缩合
称取11.6g二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl溶于50mLDMF中并搅拌至溶解，加入DIPEA调pH至7。称取30.0g七肽全保护肽，5.1gCl-HOBt于烧杯中并用150mLDMF溶解，加入8.7mLDIPEA并用冰水浴降温至0-5℃，再加入9.5gHBTU活化约10min,将其加入到二肽溶液中，室温反应3-4h,并控制反应pH值在7，可用HPLC监控反应进程。反应结束后，将反应液加入到1.6L预先降温的冰水中，析出白色固体并过滤，用纯水洗涤固体3-4遍，将所得固体真空干燥至恒重，称量所得固体为40.8g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1815.34。
4.脱除侧链保护得到布舍瑞林粗品
将上述所得40.8g全保护九肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Pro-NHEt溶于410mL88％AcOH/H2O溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度在42℃。加入6.1g10％Pd/C于九肽溶液中，并用N2置换烧瓶中的空气，再通入H2置换2-3次，最后通入H2并维持约22h，可借助HPLC监控反应进程。反应结束后，将溶液过滤，将所得滤液加入到3.2L冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3-4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为24.4g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1239.75,粗品HPLC纯度为93.8％，收率为78.7％。
实施例2
1.全保护肽七肽Z-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH的合成
称取140.0g2-CTC Resin(1.1mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取87.1gFmoc-Leu-OH并加入约700mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入43.0mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入86.1mLDIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.70mmol/g。
称取142.9g(100mmol)Fmoc-Leu-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉。加入适量20％哌啶/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮。称取76.7gFmoc-D-Ser(tBu)-OH,27.0gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解并用冰水浴冰浴约3min，再加入31.0mLDIC活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全。反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Z-Pyr-OH。
将上述所得231.9g片段Z-(1-7)肽树脂加入到2.3L的20％TFE/DCM(V/V)溶液中搅拌1.5-2h,滤去树脂，收集滤液并浓缩至固体，并干燥至恒重，得固体109.4g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1668.20。
2.二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl的合成
称取20.6gPro-NHEt.HCl于烧瓶中并加入适量DMF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性。称取79.0gBoc-Arg(Pbf)-OH,20.3gHOBt于烧杯中，加入DMF搅拌至溶解并用冰水浴冰浴约3min，再加入23.2mLDIC活化约10min,将活化液加入到溶有Pro-NHEt.HCl的烧瓶中，室温反应约4-5h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程。反应结束后，加入适量EA并搅拌均匀，随后依次加入5％H3PO4溶液,饱和NaHCO3溶液，饱和NaCl溶液，纯水并分别洗涤2-3遍，收集有机相并用无水Na2SO4干燥约2小时，过滤并将滤液真空浓缩，用PE重结晶，过滤并真空干燥得到68.4g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝651.62。
将所得68.4gBoc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt加入到700mL5NHCl/EA溶液中，室温搅拌过夜，可用HPLC监控反应进程，反应结束后，将析出的固体过滤，并用EA洗涤固体5-6遍，将固体放置真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体为38.8g,测得ESI-MS：[M+H]+＝373.23。
3.7+2片段缩合
称取38.0g二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl溶于190mLDMF中并搅拌至溶解，加入DIPEA调pH至8。称取99.1g片段Z-(1-7)全保护肽，10.1gHOBt于烧杯中并用450mLDMF溶解，用冰水浴冰浴约3min，再加入11.6mLDIC活化约10min,将其加入到二肽溶液中，室温反应4-5h,并控制反应pH值在8，可用HPLC监控反应进程。反应结束后，将反应液加入到5.8L预先降温的冰水中，析出白色固体并过滤，用纯水洗涤固体3-4遍，将所得固体真空干燥至恒重，称量所得固体为137.2g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1949.60。
4.脱除侧链保护得到布舍瑞林粗品
将上述所得137.2g全保护九肽Z-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Pro-NHEt溶于1.4L的93％AcOH/H2O溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度在46℃。加入27.4g10％Pd/C于九肽溶液中，并用N2置换烧瓶中的空气，再通入H2置换2-3次，最后通入H2并维持约25h，可借助HPLC监控反应进程。反应结束后，将溶液过滤，将所得滤液加入到12.6L冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3-4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为70.8g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1240.10,粗品HPLC纯度为92.5％，收率为76.1％。
实施例3
1.全保护肽七肽Z-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH的合成
称取200g2-CTC Resin(1.2mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取169.7gFmoc-Leu-OH并加入约1000mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入83.8mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入167.7mLDIPEA继续反应约2.5h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.90mmol/g。
称取222.2g(200mmol)Fmoc-Leu-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉。加入适量5％PIP/1.25％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮。称取191.7gFmoc-D-Ser(tBu)-OH,67.5gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，随后加入174.6mLDIPEA并用冰水浴降温至0-5℃,再加入260.2gPyBOP活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全。反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH。在缩合Pyr时，我们使用Z-Pyr-OSu作为保护氨基酸，称取180.2g溶于DMF中，并加入DIPEA调pH至8,投入反应器中反应，同样以茚三酮检测判定缩合是否完全。
将上述所得400.4g片段Z-(1-7)肽树脂加入到加入到3.6L1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体214.8g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1668.25。
2.二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl的合成
称取35.7gPro-NHEt.HCl于烧瓶中并加入适量DMF搅拌至溶解，用NMM调pH至中性。称取158.0gBoc-Arg(Pbf)-OH,40.5gHOBt于烧杯中，加入DMF搅拌至溶解,随后加入66.0mLNMM并用冰水浴降温至0-5℃，再加入156.1gPyBOP活化约10min,将活化液加入到溶有Pro-NHEt.HCl的烧瓶中，室温反应约3-4h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程。反应结束后，加入适量EA并搅拌均匀，随后依次加入5％H3PO4溶液,饱和NaHCO3溶液，饱和NaCl溶液，纯水并分别洗涤2-3遍，收集有机相并用无水Na2SO4干燥约2小时，过滤并将滤液真空浓缩，用PE重结晶，过滤并真空干燥得到111.3g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝651.30。
将所得111.3gBoc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt加入到1L的6NHCl/EA溶液中，室温搅拌过夜，可用HPLC监控反应进程，反应结束后，将析出的固体过滤，并用EA洗涤固体5-6遍，将固体放置真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体为62.0g,测得ESI-MS：[M+H]+＝373.13。
3.7+2片段缩合
称取58.3g二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl溶于300mLDMF中并搅拌至溶解，加入NMM调pH至9。称取132.1g片段Z-(1-7)全保护肽，13.5gHOBt于烧杯中并用650mLDMF溶解，随后加入22.0mLNMM并用冰水浴降温至0-5℃，再加入52.0gPyBOP活化约10min,将其加入到二肽溶液中，室温反应3-4h,并控制反应pH值在9，可用HPLC监控反应进程。反应结束后，将反应液加入到9.5L预先降温的冰水中，析出白色固体并过滤，用纯水洗涤固体3-4遍，将所得固体真空干燥至恒重，称量所得固体为177.6g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1949.25。
4.脱除侧链保护得到布舍瑞林粗品
将上述所得177.6g全保护九肽Z-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Pro-NHEt溶于1.8L的96％AcOH/H2O溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度在50℃。加入32.0g10％Pd/C于九肽溶液中，并用N2置换烧瓶中的空气，再通入H2置换2-3次，最后通入H2并维持约30h，可借助HPLC监控反应进程。反应结束后，将溶液过滤，将所得滤液加入到18L冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3-4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为98.1g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1239.80,粗品HPLC纯度为92.8％，收率为79.2％。
对比例1
全保护肽片段(1-8)AA+Pro-NHEt.2HCl缩合，最后氢化脱除侧链保护基。所述的全保护肽片段(1-8)AA其肽序为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH,使用到的保护氨基酸分别为：Pyr,Fmoc-His(Fmoc)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(NO2)-OH。此方法合成出的全保护肽纯度较差，只有40％左右。通过HPLC及MS图谱分析，使用Fmoc-Ser-OH时因其侧链羟基不带保护基，在缩合后续氨基酸时会产生相关副反应；另外，在缩合完Fmoc-His(Fmoc)-OH脱保护后，His侧链咪唑基也裸露出来，因Pyr分子相对较小，在缩合Pyr时也产生了相关副反应。
对比例2
全保护肽片段(1-7)AA+H-Arg-Pro-NHEt.2HCl缩合，最后氢化脱除侧链保护基。所述的全保护肽片段(1-7)AA其肽序为：Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu,使用到的保护氨基酸分别为：Pyr,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Leu-OH。此方法合成出的全保护肽片段(1-7)AA纯度也只有50-60％,使用侧链不带保护的Fmoc-Tyr-OH出现了对比例1中类似的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (6)

1.一种布舍瑞林粗品的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)固相合成七肽全保护肽：X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-OH,X为H或者Z；
(2)将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl在液相体系中缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；
(3)将步骤(1)得到的七肽全保护肽和步骤(2)得到的二肽在液相进行片段缩合，用纯水沉降，得到侧链带保护基的九肽X-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt；
(4)将步骤(3)得到的侧链带保护基的九肽氢化，脱除Bzl,Z和Trt保护基，得到布舍瑞林粗品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，合成全保护七肽时所使用的保护氨基酸如下：Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Ser(Trt)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH，Pyr-OH或者Z-Pyr-OH或者Z-Pyr-OSu。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)是将Boc-Arg(Pbf)-OH和Pro-NHEt.HCl在液相体系中通过缩合剂缩合得到全保护二肽Boc-Arg(Pbf)-Pro-NHEt,再使用适当浓度的HCl/EA溶液脱除保护基得到二肽H-Arg-Pro-NHEt.2HCl；在步骤(3)中，7+2片段缩合也是在液相体系中通过缩合剂缩合得到全保护肽九肽。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，全保护肽七肽使用2-CTC树脂进行固相合成，投料摩尔比(投料时所使用的保护氨基酸与合成规模的物质的量之摩尔比)为1.5-6倍。
5.如权利要求2和3所述的制备方法，其特征在于，在合成全保护肽七肽，二肽以及7+2片段缩合时可使用如下缩合剂组合中的任意一种：DIC/Y,EDC.HCl/Y,HBTU/Y/Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z；其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z＝DIPEA或NMM或TMP。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中氢化是将九肽溶于适当浓度的AcOH/H2O溶液中，用Pd/C作催化剂，通入H2氢化，滤除Pd/C后将滤液加入到冰冻MTBE或乙醚中，过滤收集固体，干燥得到布舍瑞林粗品。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104387454A (zh) * 2014-12-08 2015-03-04 兰州大学 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
CN104402977A (zh) * 2014-12-08 2015-03-11 泰州施美康多肽药物技术有限公司 一种布舍瑞林的固液合成方法
CN104530198A (zh) * 2014-12-09 2015-04-22 兰州大学 一种片段缩合制备醋酸去氨加压素的方法
CN108440653A (zh) * 2018-04-12 2018-08-24 海南医学院 一种布舍瑞林化合物的合成方法
KR20190003912A (ko) * 2017-06-30 2019-01-10 애니젠 주식회사 부세렐린의 제조 방법
CN109354608A (zh) * 2018-11-07 2019-02-19 吉尔生化（上海）有限公司 一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法
CN116655745A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 杭州湃肽生化科技有限公司 一种中间体在制备布舍瑞林中的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101735308A (zh) * 2010-01-05 2010-06-16 杭州诺泰制药技术有限公司 一种布舍瑞林的合成方法
CN101935339A (zh) * 2010-08-17 2011-01-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种固相制备布舍瑞林的方法
RU2442791C1 (ru) * 2010-07-08 2012-02-20 Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" Способ получения бусерелина и промежуточные соединения для его получения
CN103517915A (zh) * 2012-09-27 2014-01-15 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备布舍瑞林的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101735308A (zh) * 2010-01-05 2010-06-16 杭州诺泰制药技术有限公司 一种布舍瑞林的合成方法
RU2442791C1 (ru) * 2010-07-08 2012-02-20 Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" Способ получения бусерелина и промежуточные соединения для его получения
CN101935339A (zh) * 2010-08-17 2011-01-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种固相制备布舍瑞林的方法
CN103517915A (zh) * 2012-09-27 2014-01-15 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备布舍瑞林的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陆冬冬: "抗肿瘤多肽药布舍瑞林的合成研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
陆冬冬等: "固液结合法合成抗肿瘤多肽药物醋酸布舍瑞林", 《中国医药工业杂志》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104387454A (zh) * 2014-12-08 2015-03-04 兰州大学 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
CN104402977A (zh) * 2014-12-08 2015-03-11 泰州施美康多肽药物技术有限公司 一种布舍瑞林的固液合成方法
CN104387454B (zh) * 2014-12-08 2017-07-21 兰州大学 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
CN104402977B (zh) * 2014-12-08 2017-11-14 泰州启瑞医药科技有限公司 一种布舍瑞林的固液合成方法
CN104530198A (zh) * 2014-12-09 2015-04-22 兰州大学 一种片段缩合制备醋酸去氨加压素的方法
CN104530198B (zh) * 2014-12-09 2017-09-15 兰州大学 一种片段缩合制备醋酸去氨加压素的方法
KR20190003912A (ko) * 2017-06-30 2019-01-10 애니젠 주식회사 부세렐린의 제조 방법
KR101971417B1 (ko) 2017-06-30 2019-04-24 애니젠 주식회사 부세렐린의 제조 방법
CN108440653A (zh) * 2018-04-12 2018-08-24 海南医学院 一种布舍瑞林化合物的合成方法
CN109354608A (zh) * 2018-11-07 2019-02-19 吉尔生化（上海）有限公司 一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法
CN116655745A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 杭州湃肽生化科技有限公司 一种中间体在制备布舍瑞林中的用途
CN116655745B (zh) * 2023-07-31 2023-10-13 杭州湃肽生化科技有限公司 一种中间体在制备布舍瑞林中的用途

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