CN108440653A - 一种布舍瑞林化合物的合成方法 - Google Patents

一种布舍瑞林化合物的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布舍瑞林的全液相合成方法，包括以下步骤：1)用液相方法合成四肽片段pGlu‑His‑Trp‑Ser‑OH，2)用液相方法合成五肽片段Tyr‑D‑Ser(But)‑Leu‑Arg‑Pro‑NHEt，3)四肽片段与五肽片段经液相缩合、沉淀、纯化、脱盐、转盐，得醋酸布舍瑞林。本发明工艺条件温和，易于控制，产率高，成本低，适合大规模生产。

Description

一种布舍瑞林化合物的合成方法
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种布舍瑞林的液相全合成方法。
背景技术
布舍瑞林(Buserelin)是促性腺激素释放激素(LH-RH)激动剂类似物，为人工合成的线性九肽，分子量为1239.42，CAS登记号为57982-77-1，分子式为：C60H86N16O13，其氨基酸序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸—酪氨酸—(O—叔丁基)—D-丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基)。化学结构式如下：
布舍瑞林的剂型分为注射剂、鼻喷剂和植入剂三种，临床用于治疗前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等。
布舍瑞林的合成方法主要包括固相合成、液相合成和固-液结合合成三种方法。中国专利CN103936849A，CN103554229A，CN103517915A，CN101935339A采用固相路线合成了布舍瑞林。固相合成方法中，保护氨基酸和缩合试剂需要三倍过量或更多，氨基酸浪费较多，合成成本大。并且在最后的切肽工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除而生成其它杂质，杂质较多，反应收率较低。固相合成仅在最后一步进行纯化工序，一般粗品的纯度和肽含量均较低，给分离纯化带来很大的困难，导致分离纯化效率低，工作量大。
专利CN104402977A和CN104004064A报道了固-液结合合成布舍瑞林的方法。前者用固相方法合成三肽片段H-D-Ser(But)-Leu-Arg(HCl)-OH，后者合成七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-OH时，均使用TFA/DCM体系进行多肽从树脂上切割。此方法在多肽切割的同时，也容易使6-位丝氨酸侧链叔丁基脱除，降低反应收率，从而使后续的分离纯化困难。
另外对于寡肽化合物而言，液相合成方法虽然步骤繁琐，但其每步反应可以根据氨基酸或短肽的结构调整保护基和缩合试剂，每步反应产物可以进行纯化和表征。相比固相合成，液相合成更容易实现多肽药物的规模化生产，且成本大大降低。
专利CN104402977A报道了全液相合成布舍瑞林的方法，采用5+4的片段缩合方式，氨基酸的氨基采用了Fmoc保护方式，其脱除采用25％哌啶/DMF溶液。哌啶属于剧毒化学品，大量使用会造成严重的环境污染，因此采用此方法不适合布舍瑞林的规模化生产。且在布舍瑞林质量研究中，需要对哌啶进行残留溶剂的检查。
文献Biochemical and biophysical research communications 1978,81(2),382-390采用4+3+2液相片段缩合法。而文献Journal ofMedicinal Chemistry 1978,21(10),1081-1024采用(2+2)+(3+2)的液相片段合成策略。这两种方法均采用叠氮化合物法进行肽片段的缩合而得到布舍瑞林。叠氮物法操作危险，需要零下40℃以下低温，因此不适合产业化生产。
发明内容
发明目的：本发明的发明目的是为了克服现有技术的上述缺陷，提供了一种保护氨基酸和缩合剂来源丰富、反应条件温和、适合放大生产、收率高、纯化简便的布舍瑞林合成方法。
技术方案：一种布舍瑞林的液相全合成方法，布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH(焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸)和五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基)经HBTU/HOBt法缩合得到。
其合成线路如图1所示。
进一步地，根据不同的氨基酸和肽片段的结构不同，所述的缩合剂可优选为DCC/HOBt，HBTU/HOBt和氯甲酸异丁酯等。
所述的四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH是采用二肽pGlu-His-OH(焦谷氨酸—组氨酸)与二肽酯Trp-Ser-OMe(色氨酸—丝氨酸甲酯)盐酸盐经HBTU/HOBt法缩合得到。
所述的二肽酯Trp-Ser-OMe(色氨酸—丝氨酸甲酯盐酸盐)的合成采用苄氧羰基保护色氨酸(Z-Trp-OH)与丝氨酸甲酯盐酸盐(Ser-OMe·HCl)经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱苄氧羰基保护基后得到。
进一步地，所述的四肽片段pGlu-His-Trp-Ser-OH由以下步骤合成：首先pGlu和His-OMe在DCC/HOBt复合缩合剂的存在下，于DMF溶剂中生成二肽甲酯pGlu-His-OMe，而后在NaOH水溶液中水解为二肽酸pGlu-His-OH；同时，Z-Trp-OH与Ser-OMe在HBTU/HOBt复合缩合剂作用下于DMF溶剂中缩合生成Z-Trp-Ser-OMe，而后在pd/C催化剂作用下脱去Z保护基得到二肽甲酯Trp-Ser-OMe。最后，二肽酸pGlu-His-OH和二肽甲酯Trp-Ser-OMe在HBTU/HOBt作用下生成四肽甲酯pGlu-His-Trp-Ser-OMe，四肽甲酯在NaOH水溶液中水解得到所需的四肽片段pGlu-His-Trp-Ser-OH(焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸)。
所述五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用全保护三肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH((N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸)与二肽Arg(NO2)-Pro-NHEt(Nγ—硝基—精氨酸—脯氨酸—乙胺基)经混合酸酐法缩合、催化氢化脱Z，Bzl和NO2得到。
所述的全保护三肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH采用全保护酪氨酸Z-Tyr(Bzl)-OH与侧链保护的二肽酯D-Ser(But)-Leu-OMe经HBTU/HOBt法缩合、水解后得到。
所述的侧链保护的二肽酯D-Ser(But)-Leu-OMe采用Z-D-Ser(But)-OH(N—苄氧羰基—O—叔丁基)—D—丝氨酸)与亮氨酸甲酯盐酸盐L-Leu-OMe·HCl经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到。
进一步地，所述的五肽片段Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先取Z-Pro(N—苄氧羰基—脯氨酸)和乙胺水溶液NH2CH2CH3在DCC/HOBt(二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三氮唑)作用下生成Z-Pro-NHEt，催化氢化脱Z-保护基，再与Boc-Arg(NO2)-OH(Nα—叔丁氧羰基—Nγ—硝基—精氨酸)反应，生成Boc-Arg(NO2)-Pro-NHEt，再用TFA(三氟乙酸)脱Boc保护基生成二肽Arg(NO2)-Pro-NHEt；
全保护D-丝氨酸Z-D-Ser(But)-OH与亮氨酸甲酯Leu-OMe在HBTU/HOBt(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三氮唑)复合缩合剂作用下，在DMF溶剂中反应生成保护二肽Z-D-Ser(But)-Leu-OMe((N—苄氧羰基—O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸甲酯)，而后催化氢化脱Z-保护基得到二肽D-Ser(But)-Leu-OMe，然后与全保护酪氨酸Z-Tyr(Bzl)-OH反应生成保护三肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe，此三肽在NaOH水溶液中水解得到保护的三肽片段Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH。然后所得三肽片段Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH与二肽Arg(NO2)-Pro-NHEt在氯甲酸异丁酯缩合剂作用下得到保护五肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，而后在pd/C作用下催化氢化脱除Z-，Bzl-和NO2-三个保护基得到五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt。
有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过大量实验筛选，采用4+5的片段合成法，如图1合成路线，直接将四肽片段pGlu-His-Trp-Ser-OH与五肽片段Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt在HBTU/HOBt复合缩合剂作用下生成布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸—酪氨酸—(O—叔丁基)—D-丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基)。本方法采用的保护氨基酸和缩合试剂来源丰富、简单易得，合成方法可避免传统方法中严苛的反应条件、每步收率高、每步反应后处理方法均简便，且中间肽产品纯度高，整个合成成本低，反应条件温和，适合于工业化大生产。
附图说明
图1为本发明的合成流程图。
图2为纯化后布舍瑞林产品的HPLC谱图。
图3为布舍瑞林的ESI-MS图。
具体实施方式
实施例1
一种布舍瑞林的液相全合成方法，其包括以下步骤：
1、四肽片段pGlu-His-Trp-Ser-OH的合成
(1)、Z-Trp-Ser-OMe的合成：
向装有电磁搅拌的250mL单口烧瓶中加入Z-Trp-OH(N—苄氧羰基—色氨酸)(3.39g，10mmol)，加入无水THF(20mL)搅拌至溶解。另称取Ser-OMe·HCl(丝氨酸甲酯盐酸盐)(1.55g，10mmol)溶于无水DMF(20mL)，向此溶液中加入NMM(N—甲基吗啉)(1.1mL，10mmol)，将无水DMF溶液一次性加到THF溶液中，冰浴下将HOBt(1-羟基苯并三氮唑)(1.49g，11mmol)和HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)(4.17g，11mmol)加到上述混合液中，保温反应2h，室温搅拌过夜。过滤，减压浓缩，产物溶于乙酸乙酯(30mL)，依次用20％柠檬酸洗，水洗，饱和NaHCO3洗，饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥后过滤，滤液低温重结晶，得白色固体Z-Trp-Ser-OMe(N—苄氧羰基—色氨酸—丝氨酸甲酯)(3.87g，收率88.4％)。熔点：140.5℃～141℃(文献值:140.5℃～141℃)。[α]D 20＝-24.8°(c＝1.4，DMF)。ESI-MS：[M+H]+＝462.0。
(2)、Trp-Ser-OMe的合成：
向装有电磁搅拌的高压反应釜中加入Z-Trp-Ser-OMe(4.39g，10mmol)，然后加入甲醇(40mL)，搅拌至溶解，加入5％Pd/C(0.44g)，氢气置换空气3次，于室温和10bar的压力下反应2h，反应毕。过滤，蒸干，得白色固体Trp-Ser-OMe(2.99g，收率98.2％)，直接用于下一步反应。
(3)、pGlu-His-OMe的合成：
向装有电磁搅拌的250mL两口烧瓶中加入L-焦谷氨酸(1.29g，10mmol)，溶于无水DMF(30mL)。冰浴下加入HOBt(1-羟基苯并三氮唑)(1.49g，11mmol)和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)(2.27g，11mmol)，冰浴反应2h后，将溶有His-OMe·2HCl(组氨酸甲酯盐酸盐)(2.42g，10mmol)和NMM(N—甲基吗啉)(2.2mL，20mmol)的无水DMF(50mL)溶液滴加到上述反应液中，冰浴搅拌反应2h，室温搅拌过夜，反应完全后，过滤，减压蒸除溶剂，用甲醇-乙酸乙酯重结晶两次，得白色固体pGlu-His-OMe(收率90.3％)。熔点：198℃～199℃(文献值：198℃～199℃)。[α]D 20＝-4.0°(c＝1％，MeOH)。ESI-MS：[M+H]+＝280.93，[2M+H]+＝561.07。
(4)、pGlu-His-OH的合成：
取pGlu-His-OMe(焦谷氨酸—组氨酸甲酯)5.60g(20mmol)，溶于60mLMeOH中，冰浴下滴加20mLNaOH(2N)水溶液并搅拌1h，用HCl(2N)水溶液调pH至3。减压蒸除溶剂，残留物溶于40ml MeOH并滤除不溶盐，减压蒸除溶剂，残留物以乙醇结晶纯化得pGlu-His-OH(焦谷氨酸—组氨酸)白色固体5.18g(97.3％)。ESI-MS：264.9[M-H]-。H-NMR：14.58(2H,s,imidazole-NH,-COOH),9.04(1H,d,J＝1.2Hz,imidazole-2H),8.64(1H,d,J＝8.0Hz,pyrrolidone-NH),7.83(1H,d,J＝4.2Hz,-NHCO-),7.44(1H,d,J＝13.9Hz,imidazole-5H),4.58–4.49(1H,m,8-CH),4.08(1H,dd,J＝8.7,3.9Hz,pyrrolidone-5H),3.19(1H,dd,J＝15.7,5.1Hz,9-CH2),3.08(1H,dd,J＝15.2,9.8Hz,9-CH2),2.29–2.17(1H,m,pyrrolidone-3H),2.16–1.99(2H,m,pyrrolidone-4H),1.80(1H,ddd,J＝12.8,9.2,4.9Hz,pyrrolidone-3H)。
(5)、pGlu-His-Trp-Ser-OMe的合成：
取pGlu-His-OH 2.66g(10mmol)，溶于25mL DMF中，冰浴下依次加入1.2mL NMM(N—甲基吗啉)及HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)3.99g(10mmol)，反应活化5分钟。另取Trp-Ser-OMe(色氨酸—丝氨酸甲酯)3.05g(10mmol)，溶于15mLDMF。待羧基组份活化完成后，将后者加入，补加1.2mLNMM调节pH约为8，冰浴搅拌40min后转至室温继续搅拌16h。减压蒸除溶剂，残留物用甲醇-乙酸乙酯重结晶，得到白色固体纯品pGlu-His-Trp-Ser-OMe(焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸甲酯)4.56g(83.2％)。ESI-MS：[M+H]+＝554.3。1H-NMR：11.79(1H,s,imidazole-NH),10.84(1H,d,J＝1.6Hz,indole-NH),8.58(1H,d,J＝7.6Hz,imidazole-2H),8.07(1H,d,J＝8.0Hz,pyrrolidone-NH),7.97(1H,d,J＝7.8Hz,-NHCO-),7.79(1H,s,imidazole-5H),7.60(1H,d,J＝7.8Hz,-NHCO-),7.51(1H,d,J＝0.8Hz,indole-4H),7.32(1H,d,J＝8.0Hz,-NHCO-),7.14(1H,d,J＝2.1Hz,indole-2H),7.08–7.03(1H,m,indole-5H),6.98(1H,dd,J＝11.0,3.8Hz,indole-6H),6.77(1H,s,indole-7H),4.64(1H,td,J＝8.2,5.2Hz,imidazole-5H),4.45(1H,dd,J＝10.3,5.1Hz,8-CH),4.40(1H,dt,J＝7.6,5.2Hz,11-CH),3.99(1H,dd,J＝8.5,4.0Hz,14-CH),3.71(1H,dd,J＝11.0,5.3Hz,-CH2 OH),3.64(3H,s,40-OCH3),3.19(1H,dd,J＝14.8,4.8Hz,30-CH2),3.02–2.87(2H,m,24-CH2),2.79(1H,dd,J＝14.8,7.9Hz,30-CH2),2.23–2.12(1H,m,pyrrolidone-3H),2.08–1.97(2H,m,pyrrolidone-4H),1.80–1.69(1H,m,pyrrolidone-3H)。
(6)、pGlu-His-Trp-Ser-OH的合成：
取pGlu-His-Trp-Ser-OMe 2.77g(5mmol)，溶于15mLMeOH中，冰浴下滴加5mLNaOH(2N)水溶液并搅拌3h。用HCl(2N)水溶液调pH至3。减压蒸除溶剂，残留物溶于20mL MeOH并滤除不溶盐，减压蒸除溶剂，残留物以乙醇结晶纯化得白色固体纯品pGlu-His-Trp-Ser-OH2.56g(92.4％)。ESI-MS：[M-H]-＝538.4。
2、五肽片段Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成
(7)Z-D-Ser(But)-Leu-OMe的合成
取Z-D-Ser(But)-OH((N—苄氧羰基—O—叔丁基)—D—丝氨酸)8.85g(30mmol)，溶于60mLDMF中，冰浴下依次加入3.5mLNMM及缩合试剂，反应活化5分钟。另取Leu-OMe·HCl(亮氨酸甲酯盐酸盐)4.38g(30mmol)，溶于40mLDMF，并滴加3.5mLNMM调节pH约为7。待羧基组份活化完成后将后者加入，补加3.5mLNMM调节pH约为8，冰浴搅拌40min后转至室温继续搅拌6h。减压蒸除溶剂，残留物稀释于150mL DCM中，并分别用10％柠檬酸水溶液，水，饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液洗涤，无水MgSO4干燥。抽滤并减压蒸除溶剂，残留物于乙醇结晶纯化得白色纯品Z-D-Ser(But)-Leu-OMe(89.6％)。熔点：107.5℃～108.3℃(文献值：107℃～108℃)。ESI-MS：[M+Na]+＝445.3。1H-NMR：8.35(1H,d,J＝7.9Hz,-NHCO-),7.41–7.27(5H,m,benzene-H),7.14(1H,d,J＝8.7Hz,13-NHCO-),5.04(2H,s,-CH2OCO-),4.32(1H,ddd,J＝10.5,7.9,4.5Hz,11-CH),4.23–4.15(1H,m,14-CH),3.61(3H,d,J＝13.1Hz,-OCH3),3.44(2H,d,J＝6.0Hz,-CH 2-OtBu),1.74–1.53(2H,m,15-CH2-),1.47(1H,ddd,J＝13.7,9.4,4.5Hz,-CH(CH3)2),1.10(9H,s,-C(CH 3)3),0.86(6H,dd,J＝18.9,6.5Hz,-CH(CH 3)2)。
(8)D-Ser(But)-Leu-OMe的合成
向装有电磁搅拌的高压反应釜中加入Z-D-Ser(But)-Leu-OMe((N—苄氧羰基—O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸甲酯)(4.22g，10mmol)，然后加入甲醇(30mL)，搅拌至溶解，加入5％Pd/C(0.28g)，氢气置换空气3次，于室温和10bar的压力下反应2.5h，反应完成后，过滤，蒸干，得白色固体D-Ser(But)-Leu-OMe(2.82g，收率98.0％)，直接用于下一步反应。ESI-MS：[M+H]+＝289.2；[M+Na]+＝311.2；[2M+H]+＝577.2。
(9)、Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe的合成
向装有电磁搅拌的250mL两口烧瓶中加入Z-Tyr(Bzl)-OH((N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸)(2.43g，6.0mmol)，溶于无水THF(15mL)，冰浴下加入HOBt(1-羟基苯并三氮唑)(0.89g，6.6mmol)和HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)(2.5g，6.6mmol)，1h后，向此溶液中加入溶有D-Ser(But)-Leu-OMe((O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸甲酯)(1.73g，6.6mmol)的无水DMF(15mL)溶液，NMM调反应体系pH 8，保温反应2h，室温搅拌过夜，反应毕。过滤，减压浓缩，产物溶于乙酸乙酯，依次用20％柠檬酸洗，水洗，饱和NaHCO3洗，饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥后过滤，蒸除溶剂。通过乙醇重结晶得到白色固体纯品Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe((N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸甲酯)(3.42g，86.5％)。熔点：134.2℃～135.6℃。ESI-MS：[M+H]+＝698.4；[2M+H]+＝1373.8。
(10)、Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH的合成
向装有电磁搅拌的100mL单口烧瓶中加Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe(2.58g，3.9mmol)，溶于甲醇(20mL)，室温搅拌下加入1mol·L-1NaOH溶液(6.24mL)，2h后反应毕。反应液在冰浴下用10％柠檬酸溶液调pH 7，减压蒸去大部分甲醇后残留液加水(20mL)，冰浴下用10％柠檬酸溶液调pH 5，再补加水(20mL)，过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥，得产品Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH(2.33g，收率90.3％)。ESI-MS：[M+H]+＝660.2。
(11)、Z-Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的100mL两口烧瓶中加入Z-Pro(N—苄氧羰基)—脯氨酸)4.98g(20mmol)，然后加入DMF(30mL)，搅拌至溶解，加入NMM(2.25mL，20mmol)，于-20℃剧烈搅拌下向反应瓶中滴加DCC 4.53g(22mmol)和HOBt(1-羟基苯并三氮唑)2.97g(22mmol)，10min后，向混合物中加入预冷的70％乙胺溶液(5.0mL，75mmol)，反应体系转至冰浴搅拌过夜，反应毕。反应液减压浓缩后加乙酸乙酯(30mL)，依次用20％柠檬酸洗，水洗，饱和NaHCO3洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得白色固体Z-Pro-NHEt(N—苄氧羰基)—脯氨酸—乙胺)(4.61g，收率83.5％)。熔点：106.9℃～107.5℃(文献值:107℃～108℃)；[α]D 20＝-41.6°(c＝1，MeOH)。ESI-MS：[M+Na]+＝299.00。
(12)、Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的高压反应釜中加入Z-Pro-NHEt(2.76g，10mmol)，然后加入甲醇(30mL)，搅拌至溶解，加入5％Pd/C(0.28g)，氢气置换空气，于室温和10bar的压力下反应2.0h，反应完全后，过滤，减压蒸除溶剂，得无色油状物Pro-NHEt(脯氨酸—乙胺)(2.72g，收率98.6％)，直接用于下一步反应。ESI-MS：[M+H]+＝142.90。
(13)、Boc-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的250mL单口烧瓶中加入Boc-Arg(NO2)-OH(Nα—叔丁氧羰基—Nγ—硝基—精氨酸)(3.19g，10mmol)和HOBt(1.49g，10mmol)，溶于无水THF(20mL)，冰浴下向混合液中加入HBTU(4.17g，11mmol)，保温反应90min后加入Pro-NHEt(脯氨酸—乙胺)(1.42g，10mmol)和无水DMF(20mL)，冰浴搅拌2h，室温搅拌过夜，反应完全后，过滤，减压浓缩至油状物，用100mL甲醇：乙酸乙酯(20：80)重结晶得白色固体Boc-Arg(NO2)-Pro-NHEt(Nα—叔丁氧羰基—Nγ—硝基—精氨酸—脯氨酸—乙胺)(4.06g，收率91.5％)。熔点：108.9℃～110.5℃，[α]D 20＝-42.6°(c＝1，MeOH)。ESI-MS：[M+H]+＝444.21。
(14)、Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的100mL单口烧瓶中加入Boc-Arg(NO2)-Pro-NHEt(2.22g，5.0mmol)，溶于10mL二氯甲烷和10mL三氟乙酸中，室温搅拌2h，反应毕。减压蒸除溶剂，得白色固体Arg(NO2)-Pro-NHEt(1.64g，收率95.4％)，直接用于下一步反应。ESI-MS：[M+H]+＝344.02。
(15)、Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的100mL的两口圆底烧瓶中加入Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH(5.1g，8.0mmol)，溶于无水DMF(60mL)，冰浴下依次加入NMM(0.88mL，8.0mmol)和氯甲酸异丁酯(1.1mL，8.0mmol)，2h后，将Arg(NO2)-Pro-NHEt(2.7g，8.0mmol)的DMF溶液(60mL)加到上述溶液中，冰浴搅拌8h，反应毕。过滤，蒸干滤液，残余物溶于乙酸乙酯(120mL)，水洗2次(2×100mL)，依次用饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤旋蒸后用乙醇重结晶得保护五肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(6.6g，87.3％)。熔点：137.5℃～138.9℃。ESI-MS：[M+H]+＝1009.6。
(16)、Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成
向装有电磁搅拌的高压反应釜中加入Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(5.0g，5.1mmol)，然后加入甲醇(100mL)，搅拌至溶解，加入5％Pd/C(0.5g)，氢气置换空气，于室温和10bar的压力下反应2.0h，反应毕。过滤，减压蒸除溶剂，用高压制备液相分离纯化后得纯品Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-Et(收率95.4％)。ESI-MS：[M+H]+＝718.50。
3、布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH3的液相合成
取pGlu-His-Trp-Ser-OH 8.3g(15mmol)，溶于50mL DMF中，冰盐浴下依次加入1.75mLNMM，5.7g HBTU和Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH310.75g(15mmol)，补加NMM调节pH约为8，冰盐浴搅拌40min后转至室温继续搅拌16h。减压蒸除溶剂，残留物用甲醇-乙酸乙酯重结晶得布舍瑞林的白色固体粗品；布舍瑞林粗品HPLC纯度：大于82％，收率约为80％，如图3所示，ESI-MS：[M+H]+＝1240.1.
4、布舍瑞林粗品的纯化和冻干
布舍瑞林产品纯化包括步骤：样品前处理、纯化、脱盐和转盐
(1)样品前处理：用20：80的乙腈：水溶液溶解布舍瑞林粗品，浓度为1.0g/mL，用TFA调整溶液pH值3.0左右。使用直径＝300mm、孔径＝0.45μm微孔滤膜过滤待用。
(2)分离纯化
制备柱：15cm X 30cm柱，kromasil 10μm C 18反相色谱填料颗粒。
流动相：A：0.1％TFA水溶液B：90％乙腈/10％水/0.1％TFA
梯度洗脱条件如下：
时间(分钟) 流动相B(％) 流速(ml/min)
0-10 5 300
18 20 400
45 42 400
平衡：用约2个柱体积5％B流动相，平衡柱子10分钟
上样量：5g布舍瑞林粗品
上样流速：250mL/min
检测波长：230nm
同时监测压强
执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集组份，直到检测器吸光度小于0.1AU时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向HPLC监测各组份纯度，收集合并纯度大于98％以上样品，浓缩除去大部分溶剂。其余组份根据纯度不同分别合并，浓缩，进行二次纯化。
(3)脱盐和转盐
制备柱：15cm X 30cm柱，kromasil 10μm C 18反相色谱填料颗粒。
流动相：A：5％醋酸铵水溶液
B：10％乙腈/90％水溶液
C：10％水/90％乙腈/0.1％醋酸
上样量：8g左右
梯度洗脱条件：
时间(分钟) 流动相(％) 流速(ml/min)
0-7 100A 300
14 100B 300
30 100B-100C 300
纯化后布舍瑞林产品的HPLC谱图如图2所示。与布舍瑞林对照品显示相同的保留时间(tR)为27.114min。

Claims (11)

1.一种布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，采用液相片段缩合方式合成，包括以下步骤：采用四肽焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸和五肽酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基经HBTU/HOBt法缩合得到。
2.根据权利要求1所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于：所述的四肽焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸(pGlu-His-Trp-Ser-OH)是采用二肽焦谷氨酸—组氨酸(pGlu-His-OH)与二肽酯色氨酸-丝氨酸甲酯(Trp-Ser-OMe)的盐酸盐经HBTU/HOBt法缩合得到。
3.根据权利要求2所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述的二肽焦谷氨酸—组氨酸(pGlu-His-OH)采用焦谷氨酸(pGlu)与组氨酸甲酯盐酸盐(L-His-OMe·2HCl)经DCC/HOBt法缩合、水解得到。
4.根据权利要求2所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述的二肽酯色氨酸—丝氨酸甲酯盐酸盐的合成采用苄氧羰基保护色氨酸(Z-Trp-OH)与丝氨酸甲酯盐酸盐(Ser-OMe·HCl)经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱苄氧羰基保护基后得到。
5.根据权利要求1所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述五肽酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基(Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt)采用全保护三肽(N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸与二肽Nγ—硝基—精氨酸—脯氨酸—乙胺基经混合酸酐法缩合、催化氢化脱Z，Bzl和NO2得到。
6.根据权利要求5所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述的全保护三肽(N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸(Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH)采用全保护酪氨酸(Z-Tyr(Bzl)-OH)与侧链保护的二肽酯D-Ser(But)-Leu-OMe经HBTU/HOBt法缩合、水解后得到。
7.根据权利要求6所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述的侧链保护的二肽酯D-Ser(But)-Leu-OMe采用(N—苄氧羰基—O—叔丁基)—D—丝氨酸与亮氨酸甲酯盐酸盐(L-Leu-OMe·HCl)经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到。
8.根据权利要求5所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述的二肽Nγ—硝基—精氨酸—脯氨酸—乙胺基(Arg(NO2)-Pro-NHEt)采用全保护精氨酸Nα—叔丁氧羰基—Nγ—硝基—精氨酸(Boc-Arg(NO2)-OH)与脯氨酸—乙胺(Pro-NHEt)经HBTU/HOBt法缩合、酸解脱Boc保护基后得到。
9.根据权利要求8所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，所述脯氨酸—乙胺(Pro-NHEt)采用苄氧羰基保护脯氨酸(Z-Pro)与乙胺经DCC/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到。
10.一种布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)二肽焦谷氨酸—组氨酸(pGlu-His-OH)的合成：取焦谷氨酸pGlu与组氨酸甲酯盐酸盐L-His-OMe·2HCl经DCC/HOBt法缩合、水解后得到二肽pGlu-His-OH；
(2)二肽酯色氨酸-丝氨酸甲酯(Trp-Ser-OMe)的合成：采用苄氧羰基保护色氨酸Z-Trp-OH与丝氨酸甲酯盐酸盐Ser-OMe·HCl经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到二肽酯Trp-Ser-OMe；
(3)四肽焦谷氨酸—组氨酸—色氨酸—丝氨酸(pGlu-His-Trp-Ser-OH)的合成：取步骤(1)的二肽pGlu-His-OH与步骤(2)的二肽酯Trp-Ser-OMe经HBTU/HOBt法缩合、水解后得到四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH；
(4)全保护三肽(N—苄氧羰基—O—苄基)—酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸(Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH)的合成：采用全保护的D-丝氨酸Z-D-Ser(But)-OH与亮氨酸甲酯盐酸盐Leu-OMe·HCl经HBTU/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到二肽酯D-Ser(But)-Leu-OMe；而后与全保护的酪氨酸Z-Tyr(Bzl)-OH再经HBTU/HOBt法缩合、水解后得到保护三肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH；
(5)二肽Nγ—硝基—精氨酸—脯氨酸—乙胺基(Arg(NO2)-Pro-NHEt)的合成：采用苄氧羰基保护脯氨酸Z-Pro与乙胺经DCC/HOBt法缩合、催化氢化脱Z保护基后得到Pro-NHEt；而后与全保护精氨酸Boc-Arg(NO2)-OH经HBTU/HOBt法缩合、酸解脱Boc保护基后得到侧链保护的二肽Arg(NO2)-Pro-NHEt；
(6)五肽酪氨酸—(O—叔丁基)—D—丝氨酸—亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—乙胺基(Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt)的合成：采用步骤(4)中的保护三肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OH与步骤(5)中的二肽Arg(NO2)-Pro-NHEt经混合酸酐法缩合、催化氢化脱保护基后得到五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt；
(7)布舍瑞林的合成：取步骤(3)中的四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH与步骤(6)中的五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt经HBTU/HOBt法缩合得到，旋转蒸发掉部分溶剂后，经甲醇-乙酸乙酯重结晶得白色沉淀，过滤得到布舍瑞林粗品；
(8)取步骤(7)粗品经高压制备液相纯化和脱盐转盐，浓缩溶液，冷冻干燥得到醋酸布舍瑞林纯品。
11.根据权利要求10所述的布舍瑞林化合物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：样品前处理、纯化、脱盐和转盐
(1)样品前处理：用20：80的乙腈：水溶液溶解布舍瑞林粗品，浓度为1.0g/mL，用TFA调整溶液pH值3.0，使用直径＝300mm、孔径＝0.45μm微孔滤膜过滤待用。
(2)分离纯化
制备柱：15cm X 30cm柱，kromasil 10μm C 18反相色谱填料颗粒。
流动相：A：0.1％TFA水溶液B：90％乙腈/10％水/0.1％TFA
梯度洗脱条件如下：
时间(分钟) 流动相B(％) 流速(ml/min) 0-10 5 300 18 20 400 45 42 400
平衡：用约2个柱体积5％B流动相，平衡柱子10分钟；
上样量：5g布舍瑞林粗品
上样流速：250mL/min
检测波长：230nm
同时监测压强
执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集组份，直到检测器吸光度小于0.1AU时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向HPLC监测各组份纯度，收集合并纯度大于98％以上样品，浓缩除去大部分溶剂。其余组份根据纯度不同分别合并，浓缩，进行二次纯化；
(3)脱盐和转盐
制备柱：15cm X 30cm柱，kromasil 10μm C 18反相色谱填料颗粒；
流动相：A：5％醋酸铵水溶液
B：10％乙腈/90％水溶液
C：10％水/90％乙腈/0.1％醋酸
上样量：8g左右
梯度洗脱条件：
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