CN100455593C

CN100455593C - 胸腺五肽合成方法

Info

Publication number: CN100455593C
Application number: CNB2005100115449A
Authority: CN
Inventors: 谢文全; 熊伟; 邹长忠; 刘汉光
Original assignee: HUABANG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHONGQING
Current assignee: Chongqing Huapont Pharm Co Ltd
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2025-04-08
Also published as: CN1844142A

Abstract

本发明涉及胸腺五肽的合成方法。以酪氨酸衍生物为原料，通过四次缩合反应，依次分别连接由叔丁基或叔丁氧羰基保护的缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸，生成保护五肽。本方法在连接精氨酸合成五肽步骤中采用叔丁氧羰基对精氨酸进行保护，可一次性脱除所有保护基得到胸腺五肽。本方法简化了工艺步骤、产品收率高、成本低、纯度高。

Description

胸腺五肽合成方法

技术领域：

本发明涉及胸腺五肽的一种合成方法。

背景技术：

胸腺五肽是胸腺生成素II(Thymopoietin II)第32-36位的氨基酸残基片段，它的基本序列为NH₂-Arg-Lys-Asp-Val-TYr-OH，保留了胸腺生成素的有效生物活性。胸腺五肽为细胞免疫调节药物，具有诱导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能，可用于治疗恶性肿瘤、肝炎、自身免疫性疾病等。

许多文献报道了采用液相合成技术制备胸腺五肽的方法，如CN1442428A、MI91A-000706公开的方法是以酪氨酸衍生物为原料，进行多次缩合反应，依次分别连接由叔丁基、叔丁氧羰基等保护基团保护的缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸，生成保护四肽，在连接精氨酸进行五肽合成时，现有技术是用芴甲氧羰基(Fmoc)、或苄氧羰基作为保护基对精氨酸的氨基进行保护，生成保护五肽，再分步脱去几种不同的保护基得到胸腺五肽。

采用上述文献报道的合成方法连接精氨酸进行五肽合成时，存在以下问题：

1.若用芴甲氧羰基作为保护基，因芴甲氧羰基衍生物价格昂贵，使得生产成本很高；

2.若用苄氧羰基作为保护基，得到的产物溶解性很差，大多数溶剂都不能将其溶解，只能选择DMF作为溶剂，而且呈果冻状，无法进行过滤，使得产物的纯化十分困难，得到的产物纯度也很低；

3.由于生成的保护五肽上有两种保护基，在脱去保护基时至少需要经过二步，即需用不同的方法脱去不同保护基。如文献方法是用催化氢化、酸解两次反应才能脱去所有保护基。

综上，需要有一种成本较低、脱保护基和产物纯化均较为简便的胸腺五肽合成方法。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种工艺简便，成本较低廉，且产品纯度更好的胸腺五肽的合成方法。

本发明所述胸腺五肽的结构式为：NH₂-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH·CH₃COOH(I)

本方法是以酪氨酸衍生物为原料，通过四次缩合反应，依次分别连接由叔丁基或叔丁氧羰基保护的缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸，生成保护五肽。

由于上述保护五肽中叔丁氧羰基和叔丁基保护基团的性质相近，五肽中的所有保护基可以一步脱除，得到所需要的胸腺五肽。

保护五肽的合成具体包括如下步骤：

1)保护二肽合成：将羧基和羟基用叔丁基保护的酪氨酸与N-苄氧羰基-L-缬氨酸缩合反应，产物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t(II)；

2)保护三肽合成：将(II)与N-苄氧羰基-β-叔丁基-L-天冬氨酸进行缩合反应，产物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t(III)；

3)保护四肽合成：将(III)与N-苄氧羰基-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸进行缩合反应，产

物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Lys(Boc)-Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t(IV)；

4)保护五肽合成：将(IV)与叔丁氧羰基精氨酸进行缩合反应，得到保护五肽：Boc-Arg(Boc)-Lys(Boc)-Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t，

或Boc-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t。

在此步骤中，采用叔丁氧羰基保护基对精氨酸进行保护。所述叔丁氧羰基对精氨酸进行保护，系指用叔丁氧羰基保护精氨酸中的氨基和胍基，其中氨基指α位氨基，胍基是指胍基中的伯胺基、或伯胺基和仲胺基。反应中采用保护基进行保护可避免复杂的缩合反应，降低反应副产物。

所述叔丁氧羰基精氨酸优选用二叔丁氧羰基精氨酸N^α，N^G-(Boc)₂-Arg-OH，或三叔丁氧羰基精氨酸N^α，N^G-(Boc)₃-Arg-OH，其制备方法是将叔丁氧碳酸酐与精氨酸进行反应而得到。

本发明所述一步脱去保护五肽的保护基的方法，可采用本领域技术人员熟知的一些方法，如用酸解法等。酸解法中可选用多种酸进行，如三氟乙酸、HBr/HOAc、甲基磺酸、三氟甲基磺酸和氟磺酸等，脱去所有保护基，得到胸腺五肽盐，如Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH·CF₃COOH(V)。

上述胸腺五肽盐经纯化和盐转换可以根据需要得到胸腺五肽醋酸盐等盐。如可通过高效液相色谱将(V)纯化，离子交换树脂转化为醋酸盐。

本力法由于选择叔丁氧羰基对精氨酸进行保护，制备胸腺五肽具有以下优点：

①因叔丁氧羰基比苄氧羰基对酸敏感，保护基易于酸解除去。可以一步脱去保护五肽中的所有保护基，缩短了工艺步骤、收率更高；

②酸解脱保护基时先产生叔丁基阳离子，再分解为异丁烯，不会带来副产物，使产物纯度更高，纯度不低于95％。且产品又稳定，较长时间保存也不分解；

③能得到五肽的结晶体，使得纯化分离更为简便；

④避免使用昂贵的芴甲氧羰基衍生物，降低了成本。

下面举出具体实施例，仅用于举例说明本方法，其中的试剂和方法并不能限制本发明的实质性内容。

具体实施方式：

以下实施例中，制得的胸腺五肽用高效液相色谱检测。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅键合硅胶为填充剂；磷酸盐缓冲液(pH7.0)甲醇(60∶40)为流动相；检测波长为275nm；理论板数按胸腺五肽峰计算应不低于1200。取对照品溶液20μl，重复进样5次，其峰面积的变异系数应不大于1.5％。

测定方法：取样品加磷酸缓冲液溶解制成每1ml中约含0.5mg的溶液，取20μl样品进样，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

实施例1胸腺五肽的合成

1)保护二肽(Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t)(II)的合成

取Z-Val 50.2g，NH₂-Tyr(Bu^t)-OBu^t 58.6g于lL三颈瓶中，加入600ml二氯甲烷，冰浴冷却至10℃下，搅拌，滴加二环己基碳二亚胺(DCC)41.2g的二氯甲烷溶液。滴加完毕保持室温，搅拌反应8小时后，过滤，滤液依次用稀柠檬酸，稀碳酸钠溶液，水洗涤，分出有机相，用无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂得Z-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t。

将Z-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t溶于乙醇中，加入5％钯碳5g，通入氢气，室温反应3小时。过滤回收钯碳，滤液蒸干，将反应产物用乙酸乙酯和石油醚的混合溶液结晶，得结晶(II)69.0g，收率88％。

2)保护三肽(Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t)(III)的合成

取Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t 69.0g，Z-Asp(OBu^t)-OH·H₂O 60.0g于1000ml三颈瓶中，加入二氯甲烷450ml，冰浴冷却至10℃下，搅拌，滴加二环己基碳二亚胺(DCC)36.5g的二氯甲烷溶液。滴加完毕保持室温，搅拌反应10小时，过滤，滤液依次用稀柠檬酸，稀碳酸钠溶液，水洗涤，分出有机相，用无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂得Z-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t。

将Z-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t溶于乙醇中，加入5％钯碳5g，通入氢气，室温反应3小时。过滤回收钯碳，滤液蒸干，将反应产物用乙酸乙酯和石油醚的混合溶液结晶，得结晶(III)85.0g，收率85.8％。

3)保护四肽(Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t)(IV)的合成

取NH₂-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t85.0g，Z-Lys(Boc)-OH 57.5g于1000ml三颈瓶中，加入500ml二氯甲烷，冰浴冷却至10℃下，搅拌，滴加二环己基碳二亚胺(DCC)31.0g的二氯甲烷溶液。滴加完毕保持室温，搅拌反应16小时，过滤，滤液依次用稀柠檬酸，稀碳酸钠溶液，水洗涤，分出有机相，用无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂得Z-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t。

将Z-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t溶于乙醇中，加入5％钯碳3g，通入氢气，室温反应3小时。过滤回收钯碳，滤液蒸干，将反应产物用乙酸乙酯和石油醚的混合溶液结晶，得晶体(IV)102g，收率85.5％。

4)五肽的合成

A.N^α，N^G-(Boc)₃-Arg-OH的合成

取精氨酸17.5g溶于30ml水中，加入叔丁醇30ml、叔丁氧碳酸酐(Boc)₂O 30ml，搅拌，20℃下反应0.5小时，40℃下反应0.5小时。冷却至10℃，加入(Boc)₂O 60ml，苄基三乙胺溴10g，室温搅拌反应18小时。加水11L，用正己烷/乙醚(1∶1，V/V)200ml提取两次，水相加入300ml乙醚，加柠檬酸调pH3，分离水相和有机相，水相用乙醚提取2次(2×200ml)，合并有机相，用10％H₂SO₄、水洗至中性，无水MgSO₄干燥，过滤，滤液至干得45g油状物，正己烷重结晶，得目标产物27g。

B.保护五肽的合成

取NH2-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-OBu^t 102g，N^α，N^G-(Boc)₃-Arg-OH 61.5g于1000ml三颈瓶中，加入400ml二氯甲烷，冰浴冷却至10℃下，搅拌，滴加二环己基碳二亚胺(DCC)27.0g的二氯甲烷溶液。滴加完毕保持室温，搅拌反应16小时，过滤，滤液依次用稀柠檬酸，稀碳酸钠溶液，水洗涤，分出有机相，用无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂得Boc-Arg(Boc)₂-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Ty(Bu^t)-OBu^t，将反应产物用乙酸乙酯和石油醚的混合溶液结晶得结晶性粉末136.1g，收率84.1％。

C.Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH·CF₃COOH盐(V)的合成

取Boc-Arg(Boc)₂-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Ty(Bu^t)-OBu^t 136.1g于500ml干燥三颈瓶中，室温加入三氟乙酸100ml，搅拌反应5小时，滴加乙醚300ml，搅拌1小时后，过滤，得白色固体产物(V)100.2g。

5)Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH醋酸盐的制备

取Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH·CF₃COOH 100.2g，用高效液相色谱仪进行纯化。高效液相色谱条件：Waters制备色谱柱Nova Pak 40mm×100mm，0.1％TFA/CAN(A)与0.1％TFA/水(B)为流动相，进行梯度洗脱，流速40ml/min；将(V)用水配制成每1ml中含0.2g的溶液，进样量20ml。

D311型阴离子交换树脂的处理：取D311型阴离子交换树脂500ml，装柱，用水洗8小时，洗涤速度约3ml/min。然后用0.5N HCl洗涤，约用3000ml，速度约1.5ml/min，水洗至中性。再用0.5N NaOH洗涤，约用5000ml，洗涤速度约3ml/min，水洗至中性。用稀醋酸(1/15，V/V)3000ml洗涤，速度约1.5ml/min，水洗至近中性。

将100.0g Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH·CF₃COOH用200ml蒸馏水溶解，上样于处理好的离子交换树脂，用蒸馏水洗脱，速度约1.5ml/min，TLC监测样品的出柱及洗脱完全。收集合并洗脱液，冷冻干燥，得成品70.0g。

Claims

1.胸腺五肽合成方法，以羧基和羟基用叔丁基保护的酪氨酸为原料，通过四次缩合反应，依次分别连接由叔丁基或叔丁氧羰基保护的缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸，生成保护五肽，然后脱除保护基；其中在连接精氨酸合成五肽步骤中采用叔丁氧羰基对精氨酸进行保护。

2.权利要求1所述的胸腺五肽合成方法，所述合成五肽包括如下步骤：

1)保护二肽合成：将羧基和羟基用叔丁基保护的酪氨酸与N-苄氧羰基-L-缬氨酸缩合反应，产物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t；

2)保护三肽合成：将步骤1)得到的Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t与N-苄氧羰基-β-叔丁基-L-天冬氨酸进行缩合反应，产物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t；

3)保护四肽合成：将步骤2)得到的Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t与N-苄氧羰基-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸进行缩合反应，产物脱去N-苄氧羰基保护基，得到Lys(Boc)-Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t；

4)保护五肽合成：将步骤3)得到的Lys(Boc)-Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t与叔丁氧羰基精氨酸进行缩合反应，得到保护五肽：

Boc-Arg(Boc)-Lys(Boc)-Asp(Obu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t，

或Boc-Arg(Boc)₂-Lys(Boc)-Asp(OBu^t)-Val-Tyr(Bu^t)-Obu^t。

3.权利要求2所述的胸腺五肽合成方法，所述叔丁氧羰基精氨酸指二叔丁氧羰基精氨酸或三叔丁氧羰基精氨酸。

4.权利要求3所述的胸腺五肽合成方法，所述二叔丁氧羰基精氨酸是：N^α，N^G-(Boc)₂-Arg-OH；所述三叔丁氧羰基精氨酸是：N^α，N^G-(Boc)₃-Arg-OH。

5.权利要求1所述的胸腺五肽合成方法，所述对精氨酸进行保护指对精氨酸中氨基和胍基进行保护。

6.权利要求1～5任一项所述的胸腺五肽合成方法，所述脱除保护基是一次性脱除保护五肽中的所有保护基。

7.权利要求6所述的胸腺五肽合成方法，所述脱除保护基的方法是酸解法，得到胸腺五肽盐。

8.权利要求7所述的胸腺五肽合成方法，所述酸解法使用的酸选自三氟醋酸、HBr/HOAc、甲基磺酸、三氟甲基磺酸或氟磺酸。

9.权利要求7所述的胸腺五肽合成方法，所述酸解法使用的酸是三氟乙酸。

10.权利要求7所述的胸腺五肽合成方法，还包括将胸腺五肽盐纯化，并进行离子交换树脂转化为胸腺五肽醋酸盐。