CN103709233A - 一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，该方法以Fmoc保护的氨基酸为单体，将氨基酸按顺序连接到树脂上，在合成五肽时，加入的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH溶液的溶剂为DMF和THF混合液，采用哌嗪溶液脱除所有Fmoc保护基，最后除去树脂和侧链保护基得胸腺五肽。本发明首次以哌嗪为脱Fmoc的脱保护剂，取代了传统的吡啶，是一类不受“危险化学品”、“制毒化学品”管制的物质，廉价易得，且化学性质稳定；哌嗪在常温下为白色针状晶体，而哌啶为液体，故哌嗪更便于运输和储存；相同浓度下，哌嗪脱Fmoc效率高于哌啶；可见哌嗪在胸腺五肽合成中具有很多优越性，对多肽的生产、研究也具有很大的促进意义。

Description

一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法

技术领域

本发明涉及多肽类药物的制备，具体其涉及一种固相合成胸腺五肽的方法，属于多肽固相合成技术领域。

背景技术

胸腺五肽，其英文名称为thymopentin, 简称TP-5，中文名“胸腺五肽”是其意译名。胸腺五肽是一种化学合成的五肽化合物（精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸），为胸腺多肽激素胸腺生成素(thymopoietin)的第32-36位的氨基酸残基片段，它的基本序列为H-Arg-Lys- Asp-Val-Tyr-OH，保留了胸腺生成素的有效生物活性。胸腺五肽为细胞免疫调节药物，具有诱导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能，可用于治疗恶性肿瘤、肝炎、自身免疫性疾病等，对免疫系统具有和其母体多肽化合物胸腺生成素相同的生理功能和药效。

多肽的化学合成方法主要有液相合成法和固相合成法。在溶液中进行的多肽合成称为液相合成法，反之，多肽固相合成是在固相载体上逐一地重复连接特定的氨基酸的过程。固相合成法是在一个反应器内完成合成多肽的步骤，没有中间体转移导致的损失，通过简单的洗涤除去未连接到固相上的反应物和杂质，简化了每步中间体的纯化和缩短了纯化的时间。

固相合成一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）的顺序合成。侧链和氨基分别保护的氨基酸通过羧基经偶合反应连接到固相载体上；连接到固体上的保护氨基酸的氨基保护基除去后，接着进行下一个保护氨基酸的偶合反应，照此循环重复完成目标多肽的合成。多肽的固相合成方法中氨基通常采用两种保护基保护，Fmoc（9-芴甲氧羰基）和t-Boc（叔丁氧羰基）。相应的合成方法称为Fmoc法和Boc法。由于Fmoc比t-Boc 脱保护的条件温和，使得Fmoc法普遍被采用。Fmoc法合成，其中Fmoc脱保护基团的原理为Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，可被碱除去，反应条件温和。虽然理论上看，任何碱性物质都可以用于Fmoc基团的脱保护，迄今为止，根据Fmoc法合成多肽的实验结果，只有哌啶（六氢吡啶）溶液被认为是可以接受的脱去氨基酸氨基上的Fmoc保护基的试剂。

固相合成的步骤包括：

① 将多肽C末端的氨基酸的氨基和侧链分别保护后键合到固相载体上，以使肽链延长。

② 对暂不参与形成化学键的基团加以保护，反应完成后再脱除保护基。

③ 对参与形成酰胺键的羧基进行活化。

④ 用适合的试剂，将目标从载体上切割下来。

具体合成由下列几个循环组成：

① 去保护：Fmoc保护的含有氨基的载体必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团。

② 活化和偶合：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与固相载体上的游离氨基发生反应形成肽键。在此步骤使用过量的反应物驱使反应快速完成。循环①②这两步反应反复循环直到合成完成。

③裂解和脱保护：多肽从载体上裂解下来，同时，所有保护基团被裂解液脱除去，得到多肽粗品。

迄今为止，报道使用Fmoc保护氨基酸策略制备胸腺五肽的前景资料主要有：

①南京工业大学宋明媚的硕士学位论文《胸腺五肽固相合成的工艺优化与放大》采用工艺为：使用取代率为1毫摩尔/g的Wang树脂，DIC/HOBt/DMAP法连接Tyr与树脂，溶剂为45%DMF/THF，反应5h；肽链延长过程中每个氨基酸的连接均使用DIC/HOBt法，溶剂为45%DMF/THF，反应1h。切割试剂采用95%TFA/TIS/H₂O，反应3.5h，温度24℃，树脂洗涤液为95% TFA/DCM。胸腺五肽的产率为86.7%，纯度为88.9%。

②南京林业大学化学工程学院欧阳嘉等人论文《Fmoc（9-芴甲氧羰基）法固相合成胸腺五肽》所用的方法为：采用对碱敏感的Fmoc法α-氨基保护策略固相合成了胸腺五肽，并讨论了胸腺五肽不同固相载体、不同活化试剂对胸腺五肽固相合成的影响。试验结果表明Fmoc合成策略中各步的缩合率均在90%以上，同时对产品进行色谱分析纯度达到83% 。

③中国专利申请200510060558X《胸腺五肽合成工艺方法》，其以Fmoc-Tyr (tBu) -OH和Wang树脂为起始物料，然后用保护氨基酸Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(otBu）-OH,Fmoc-Lys (Boc) -OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保护氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得胸腺五肽粗品。

④中国专利CN 1865279B《固相多肽合成胸腺五肽的制备方法》揭示胸腺五肽的固相合成方法为：(1)以CTC树脂或Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH;(2)将切肽试剂加入步骤(1)的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)将步骤(2)的粗品采用C18或C8柱进行分离纯化，获得目标产物。每步接肽收率约为98，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH的方法，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用剧毒的氟化氢，三废污染少。采用C18柱进行分离纯化，避免使用三氟乙酸，减小三废，纯化收率≥50%，每步接肽收率均在98%以上；切肽后收率为88%，分离纯化收率为52%，总收率约为44 % 。  

在上述的专利和文献报道中是用哌啶（六氢吡啶）脱去氨基酸单体上的Fmoc保护基合成胸腺五肽，然而，使用哌啶在现实工业生产和科学研究中有多方面的缺点：

① 根据《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》规定哌啶为易制毒-2类化学品，该品受公安部门的严格管制，因此在日常的科学研究中不容易获得，大大降低科学研究的方便性。

② 在制药企业中需要有购买和使用哌啶的资格证书方能进行使用，使用过程中要有严格的记录档案，并且定期要接受公安和有关部门的检查，对制药企业也照成了一定的不便性。

③ 哌啶为无色液体，有吸湿性，能随水蒸气挥发，对二氧化碳敏感，其溶液很容易发生变质成为浅黄色液体，使用前需要重新蒸馏，这些性质促使了运输和储存成本增加。

因此，在固相合成胸腺五肽中需要一种简单、有效、成本低、原料易得的脱保护剂除去氨基酸上的Fmoc保护基。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，该方法中Fmoc脱保护剂采用哌嗪溶液。

进一步的，上述哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂。

进一步的，上述偶极非质子溶剂选自DMF、NMP、THF、DMSO。

进一步的，上述哌嗪溶液的浓度为0.1～1mol/L。

一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，该方法中第5个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH溶液中的溶剂是体积比为（1.8～2.2）：1的DMF和THF的混合液。

本发明的有益效果是：

本发明采用哌嗪作为脱保护剂，属于路易斯（lewis）碱，能够脱除氨基酸氨基的Fmoc保护基，不同于哌啶。哌嗪是一类不受《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》管制的化学物品，无论是科研单位还是企业在购买和使用过程中都很方便获得，价格相对哌啶便宜；哌嗪比哌啶在常温下的化学性质更稳定；哌嗪在常温下为白色针状晶体，而哌啶为液体，故哌嗪也更便于运输和储存，降低成本。

本发明以哌嗪法能够制备与传统的哌啶法一样的多肽产物，二者的实验操作过程没有明显差异，在脱Fmoc过程中，当哌嗪浓度高于0.5mol/L所用时间比2mol/L的哌啶要短，哌嗪法得到的胸腺五肽的纯度为77%～80%略高于哌啶法得到的胸腺五肽的纯度74%，说明哌嗪法在固相合成胸腺五肽中具有很多优越性，并且在多肽实际生产、科学研究中也具有很大的促进意义。

附图说明

图1 Fmoc的标准曲线；

图2不同浓度胸腺五肽HPLC图谱；

图3 胸腺五肽的标准曲线；

图4哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中脱除Fmoc保护基反应的茚三酮检测，二者检测后的颜色均为深蓝色，说明两种方法都可脱除Fmoc保护基；

图5哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中氨基酸缩合反应的茚三酮检测，二者检测后的颜色均为浅黄色，说明二者的缩合反应都进行完全；

图6哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中二肽中间体(H-Val-Tyr-OH)的HPLC图谱对照；

图7哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中三肽中间体（H-Asp-Val-Tyr-OH）的HPLC图谱对照；

图8哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中四肽中间体（H-Lys-Asp-Val-Tyr-OH）的HPLC图谱对照；

图9哌嗪法和哌啶法合成的胸腺五肽（H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH）的HPLC图谱对照；

图10哌嗪法和哌啶法合成的二肽中间体、三肽中间体、四肽中间体、胸腺五肽的HPLC图谱对照；

图11哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中三肽中间体（H-Asp-Val-Tyr-OH）质谱图对照，A为哌啶法合成的三肽中间体质谱图，B为哌嗪法合成的三肽中间体质谱图；

图12哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中四肽中间体（H-Lys-Asp-Val-Tyr-OH）质谱图对照，A为哌啶法合成的四肽中间体质谱图，B为哌嗪法合成的四肽中间体质谱图；

图13哌嗪法和哌啶法合成的胸腺五肽（H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH）质谱图对照，A为哌啶法合成的胸腺五肽质谱图，B为哌嗪法合成的胸腺五肽质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：

（1）第1个氨基酸与树脂的连接：

①称取树脂：取4g Wang树脂（取代度1.02mmol/g）于编号为1号的80ml反应器（反应前准确称其重量）中，Wang树脂的总取代量为取代度乘以质量，即4.08 mmol；

②树脂与氨基酸进行键合反应：准确称量4.08mmol（1874.90 mg）Fmoc-Tyr(tBu)-OH置于50ml离心管中，加入30ml DCM（二氯甲烷）斡旋溶解后加入1号反应器中，使树脂溶胀均匀，溶胀时间约30min；同时在另外一只50ml的离心管中加入4.08mmol（841.826 mg）DCC（二环己基碳二亚胺）、0.408mmol（49.845mg）DMAP（4-二甲氨基吡啶）和10mL DCM，斡旋溶解后快速倒入1号反应器，斡旋均匀，与溶胀均匀的树脂振荡反应约4h，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang； 

③树脂担载量的测定：对②中反应后的树脂先用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA（异丙醇）洗四遍，抽其极干，取2mg树脂于1.5ml离心管中，加1ml 2.00mol/L哌啶的DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶液摇摆处理20min，取其0.1ml用10mlDMF稀释10倍，测其吸光度，根据Fmoc的标准曲线如图1所示计算其担载量，其担载量为0.6216mmol/g，要大于0.5 mmol/g，即1gWang树脂中与0.6216mmol的氨基酸发生了键合反应，可以说明上该产物可用于后续的多肽合成，具体的测定方法见下面“一、Wang树脂担载量的测定”。

（2）过剩树脂的封头

①封头反应：将1号反应器内抽干的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang中加入30ml 含40.8mmol（3915.06μl）醋酐和40.8mmol（3303.23μl）吡啶的DMF溶液，混匀，振荡反应60min，对未与氨基酸结合的树脂进行乙酰化封闭，获得封头的未与氨基酸结合的树脂，从而防止其与后续的氨基酸发生键合；

②洗涤与分装：将经过封头处理的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其极干，分成质量相等的两份，分别置于1号反应器和2号反应器（反应前准确称其重量）中。

在接下来的反应条件中，1号和2号反应器唯一不一样的地方是1号反应器用0.5mol/L哌嗪的DMF溶液为脱保护剂，2号反应器用2.0mol/L哌啶的DMF溶液为脱保护剂，其余条件都一样，下面只对哌嗪法的操作进行描述。

（3）脱除第1个氨基酸的Fmoc保护基

①保护基的脱除反应：在1号反应器内倒入30ml 0.5mol/L哌嗪的DMF脱保护溶液，振荡反应20min，脱除Fmoc保护基；

②洗涤与检测：将反应后的产物用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽极其干，取极少树脂进行茚三酮检测，若为深蓝色，（如图4所示，为哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽过程中每一步脱除Fmoc保护基反应的茚三酮检测，检测后的颜色均为深蓝色，说明两种方法均可脱除Fmoc保护基。）则说明获得了H-Tyr(tBu)-Wang，可进行接下来的反应，若为浅色，则重新用30ml 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液处理30min。

（4）二肽-树脂的合成

①二肽的缩合反应：准确称量4.08mmol（1384.75mg）Fmoc-Val-OH于50ml的离心管中，用20mL的DMF作溶剂，斡旋溶解后，再加入4.08mmol（1555.45mg）HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）作为缩合剂，斡旋溶解完全，再加入4.08mmol（718.08uL）DIEA（N,N-二异丙基乙胺），斡旋混匀，立即倒入装有H-Tyr(tBu)-Wang的1号反应器中，振荡反应约4h，获得Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang；

②洗涤与检测：将Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang用DMF洗四遍至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其极干，置于1号反应器内，取极少反应产物进行茚三酮检测：如果测试液体和树脂微球显无色、或浅黄色，说明缩合反应进行完全，可继续下面的反应；如有蓝色、或浅紫色，则重新进行上一步①中的反应；

③脱除保护基的脱除反应：在1号反应器内倒入20mL 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液振荡反应20min，脱除保护基Fmoc；

④洗涤与检测：脱除反应后，用DMF清洗1号反应器中的产物至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽极其干，得H-Val-Tyr(OtBu)-Wang二肽-树脂中间产物，取极少量产物进行茚三酮检测，如为深蓝色，则进行接下来的反应，如浅色，则重新用20mL 0.5mol/L哌嗪DMF进行脱除保护基Fmoc反应。

（5）三肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将二肽-树脂与20mL含4.08mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DMF溶液进行缩合反应获得H-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang三肽-树脂中间产物。

（6）四肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将三肽-树脂与20mL含4.08mmol Fmoc-Lys(tBu)-OH的DMF溶液进行缩合反应获得H-Lys(tBu )-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang四肽-树脂中间产物。

（7）五肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将四肽-树脂与20mL含4.08mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶液进行缩合反应获得H-Arg(Pbf)-Lys(tBu )-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang五肽-树脂产物，其中不同的是，该步骤中溶解Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶剂为体积比为2：1的DMF和THF的混合溶液，其他操作均不变。

（8）脱除侧链保护基及肽链上的树脂

①将五肽-树脂产物（或其他多肽-树脂中间产物）置于10ml反应器中，加入五肽-树脂体积10～30倍的裂解液，所用裂解液按体积百分比含有95%TFA（三氟乙酸）、2.5% TIS（三异丙基硅烷）和2.5%水，裂解3次，裂解的时间依次约为30min、60min、90min，过滤除树脂，收集合并三次滤液于50mL离心管中；

②往滤液中加入约30mL放置于-20℃冷冻储存的冰冻乙醚，混匀，静置直到沉淀产生完全（大约2h）（在本发明中四肽中间体和五肽产物有白色沉淀产生，而二肽中间体、三肽中间体并没有白色沉淀产生，因此对二肽中间体、三肽中间体进行减压旋蒸处理得到样品不再进行离心处理），然后进行减压旋蒸至少量乙醚存在，再用乙醚对样品进行清洗，重复再减压旋蒸2~3次，最后产物用氩气吹干，可获得二肽中间体、三肽中间体）；

③对含有五肽产物或四肽中间体沉淀的溶液进行离心（5min，10000 rpm），倒出上清液，再加入约20ml乙醚，对沉淀进行斡旋摇匀，再离心（5min，10000 rpm），重复3遍，用氩气吹干即可获得胸腺五肽或四肽中间体；

④ 对经过脱除侧链保护基和树脂处理的二肽中间体、三肽中间体、四肽中间体、胸腺五肽的样品，用超纯水溶解，进行冷冻干燥处理，这样就得到用于HPLC和质谱检测的多肽样品。

经过上述同样的操作方法，也分别获得经哌啶脱除Fmoc保护基的二肽中间体、三肽中间体、四肽中间体、胸腺五肽的样品，也进行HPLC和质谱的检测，并分别与哌啶脱除Fmoc保护基的多肽进行对比（详细情况见下面“二、根据国家药典对胸腺五肽进行HPLC检测”）。

 

实施例2：

（1）第1个氨基酸与树脂的连接：

①称取树脂：取4g Wang树脂（取代度1.02mmol/g）于反应器（反应前准确称其重量）中，Wang树脂的总取代量为取代度乘以质量，即4.08 mmol；

②树脂与氨基酸进行键合反应：准确称量3.627～4.488mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH置于离心管中，加入30ml DCM斡旋溶解后加入反应器中，使树脂溶胀均匀，溶胀时间约30min；同时在另外一只离心管中加入3.627～4.488mmol DCC、0.3627～0.4488mmol DMAP和10mL DCM，斡旋溶解后快速倒入反应器，斡旋均匀，与溶胀均匀的树脂振荡反应约4h，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang。 

（2）过剩树脂的封头

①封头反应：将反应器内的所有树脂先用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其极干，加入30～40mL含4.08～44.88mmol醋酐和4.08～44.88mmol 吡啶的DMF溶液，混匀，振荡反应60～70min，对未与氨基酸结合的树脂进行乙酰化封闭，获得封头的未与氨基酸结合的树脂，从而防止其与后续的氨基酸发生键合；

②洗涤与分装：将经过封头处理的所有树脂用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其极干，置于反应器中。

（3）脱除第1个氨基酸的Fmoc保护基

①保护基的脱除反应：在反应器内倒入60ml 0.5mol/L哌嗪的DMF脱保护溶液，振荡反应20min，脱除Fmoc保护基；

②洗涤与检测：将反应后的产物用DMF洗至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽极其干，取极少树脂进行茚三酮检测，若为深蓝色，则说明获得了H-Tyr(tBu)-Wang，可进行接下来的反应，若为浅色，则重新用60ml 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液处理30min。

（4）二肽-树脂的合成

①二肽的缩合反应：准确称量4.08～8.16mmol Fmoc-Val-OH于50ml的离心管中，用20～40mL的DMF作溶剂，斡旋溶解后，再加入4.08～8.16mmol HBTU作为缩合剂，斡旋溶解完全，再加入4.08～8.16mmol DIEA，斡旋混匀，立即倒入装有H-Tyr(tBu)-Wang的反应器中，振荡反应约4h，获得Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang；

②洗涤与检测：将Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang用DMF洗四遍至洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其极干，置于反应器内，取极少反应产物进行茚三酮检测，如果无颜色，可进行接下来的反应，如有颜色，则重新进行上一步①中的反应；

③脱除保护基的脱除反应：在反应器内倒入40～60mL 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液振荡反应20min，脱除保护基Fmoc；

④洗涤与检测：脱除反应后，用DMF清洗反应器中的产物至pH值为洗涤流出液中性，再用IPA洗四遍，抽极其干，得H-Val-Tyr(OtBu)-Wang二肽-树脂中间产物，取极少量产物进行茚三酮检测，如为深蓝色，则进行接下来的反应，如浅色，则重新用40～60mL 0.5mol/L哌嗪DMF进行脱除保护基Fmoc反应。

（5）三肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将二肽-树脂与20～40mL含4.08～8.16mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DMF溶液进行缩合反应获得H-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang三肽-树脂中间产物。

（6）四肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将三肽-树脂与20～40mL含4.08～8.16mmol Fmoc-Lys(tBu)-OH的DMF溶液进行缩合反应获得H-Lys(tBu )-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang四肽-树脂中间产物。

（7）五肽-树脂的合成

按照步骤（4）的操作，将四肽-树脂与20～40mL含4.08～8.16mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶液进行缩合反应获得H-Arg(Pbf)-Lys(tBu )-Asp(OtBu)-Val-Tyr(OtBu)-Wang五肽-树脂产物，其中不同的是，该步骤中溶解Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶剂为体积比为（1.8～2.2）：1的DMF和THF的混合溶液，其他操作均不变。

（8）脱除侧链保护基及肽链上的树脂

①将五肽-树脂产物置于反应器中，加入五肽-树脂体积10～30倍的裂解液，所用裂解液按体积百分比含有94～96% TFA、2.4～3.4% TIS和2.4～3.4%水，裂解3次，裂解的时间依次约为30min、60min、90min，过滤除树脂，收集三次滤液于50mL离心管中；

②往滤液中加入-4～-20℃的乙醚，体积为滤液5～10倍，混匀，静置直到沉淀产生完全，离心5min，10000rpm，去上清，将沉淀进行减压旋蒸，减压旋蒸的产物用乙醚清洗后离心去上清得沉淀，再将沉淀重复减压旋蒸2～3次后，最后产物用氩气吹干， 即可获得胸腺五肽。

实施例3：

本发明还选用了浓度分别为0.1mol/L、0.25 mol/L、0.75 mol/L、1 mol/L哌嗪的DMF溶液作为脱保护剂，其中哌嗪溶液的溶剂还选用了NMP(N-甲基吡咯烷酮)、THF(四氢呋喃)、DMSO(二甲基亚砜)等偶极非质子溶剂，参照实施例2的操作方法，同样也能制备出相应的二肽、三肽、四肽中间体，以及胸腺五肽。

 

下面对实施例中制备的多肽中间体和胸腺五肽进行检测，并与使用传统脱保护剂哌啶制备的相应产物进行比较。

一、Wang树脂担载量的测定

(1) 制作Fmoc标准曲线

① 以Fmoc-Ala为标准物质，准确称量Fmoc-Ala-OH 39.5mg，用1ml 20%pip/NMP处理20min，取其中0.1ml用NMP稀释到10ml。

②配置成浓度为21，42，63，85，106，127μmol/L的标准溶液，测的吸光度分别为：0.18，0.34，0.5，0.67，0.82，0.98，如表1所示。

表1 Fmoc-Ala标准溶液的配制表

 

③制作Fmoc的标准曲线如图1所示，其线性回归方程为Y=0.0075X+0.0237（线性相关系数：R²=0.9999，Y：吸光度，X：浓度μmol/L）。

（2）Wang树脂担载量的测定

取实施例1中步骤（1）中获得的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang 2mg于 1.5ml离心管中，加1ml 2mol/L哌啶的DMF溶液混匀，振动处理20min除去Fmoc保护基；取0.1ml用DMF稀释10倍，测其吸光度，根据Fmoc的标准曲线如图1所示计算其担载量为0.6216mmol/g。

二、根据国家药典对胸腺五肽进行HPLC检测

①配制0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）—甲醇（体积比90:10）为流动相，本发明采用900ml超纯水溶解于室温2.738gNaH₂PO₄·2H₂O和9.8343gNa₂HPO₄·12H₂O，再加入100ml色谱纯的甲醇，接着用pH计进行检测。

②选用十八烷基硅键和硅胶为填充剂的色谱柱，本发明采用的为C18( 1.8um，2.1*100um)色谱柱；检测波长为275nm，洗脱条件为等度洗脱。

③胸腺五肽线性关系试验：取1支注射用的胸腺五肽标准品其胸腺五肽的含量为1mg，用1ml的0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）—甲醇（体积比90:10）为流动相溶解配置20，40，80，160，320 ，1000μg/ml的6个标准溶液（如表2所示）， 分别吸取10μL进样，记录HPLC色谱峰面积如图2所示，以胸腺五肽质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线如图3所示，线性回归方程为Y=1058.7X-345.8（R²=0.9998）结果表明，胸腺五肽在质量浓度20～1000mg/ml内与峰面积呈良好的线性关系。

表2胸腺五肽标准溶液配制表

 

④精密度试验

取胸腺五肽标准溶液6份，分别吸取10μL进样，连续测定5次，根据色谱峰面积计算RSD为0.5%，表明方法精密度良好。

⑤将实施例1中分别哌嗪法和哌啶法中获得的二肽中间体、三肽中间体、四肽中间体、胸腺五肽各取1mg，分别用1ml的0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）—甲醇（体积比90:10）为流动相溶解，根据国家药典的方法进行HPLC检测和质谱分析。HPLC图谱如图6～10所示；质谱图谱如图11～13所示。

HPLC和质谱图谱的结果说明哌嗪法能够制备出与传统的哌啶法一样的多肽产物，二者的实验操作过程没有明显差异，哌嗪法得到的胸腺五肽的纯度为77%～80%略高于哌啶法得到的胸腺五肽的纯度74%，在脱Fmoc过程中，当哌嗪浓度高于或等于0.5mol/L所用时间比2mol/L的哌啶要短；且哌嗪是一类不受《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》管制的化学物品，无论是个人还是企业在购买和使用过程中都很方便获得，价格相对哌啶便宜；哌嗪比哌啶在常温下的化学性质更稳定，哌嗪在常温下为白色针状晶体，而哌啶为液体，故哌嗪也更便于运输和储存，降低成本。

综上所述，哌嗪法在固相合成胸腺五肽中具有很多优越性，在多肽实际生产、科学研究中具有很大的促进意义。

Claims (5)

1.一种Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于：该方法中Fmoc脱保护剂采用哌嗪溶液。

2.根据权利要求1所述的一种固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于：所述的哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂。

3.根据权利要求2所述的一种固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于：所述的偶极非质子溶剂选自DMF、NMP、THF、DMSO。

4.根据权利要求1所述的一种固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于：所有所述的哌嗪溶液的浓度为0.1～1mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于：第5个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH溶液中的溶剂是体积比为（1.8～2.2）：1的DMF和THF的混合液。

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