CN104610433A - 一种西曲瑞克的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种西曲瑞克的制备方法，以Fmoc-Linker-氨基树脂为起始原料，从C端到N端依次连接九个具有Fmoc-保护基的氨基酸，脱去Fmoc保护基后再连接Ac-D-2-Nal-OH得到N端乙酰化的肽树脂，即Ac-全保护十肽树脂。用裂解试剂切割肽树脂，冰乙醚沉淀切割液获得西曲瑞克粗肽，再以HPLC制备色谱柱分离纯化，冷冻干燥后得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。本发明采用最小保护原则，且使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，提高了产品的纯度，粗肽产率大，有利于大规模工业化生产。

Description

一种西曲瑞克的制备方法
技术领域
本发明涉及一种西曲瑞克(包括西曲瑞克醋酸盐、三氟醋酸盐及游离肽)的制备方法，特别是固相合成西曲瑞克的制备方法。
背景技术
中文通用名：醋酸西曲瑞克
英文通用名：Cetrorelix Acetate
商品名：Cetrotide
化学名称：
Acetyl-D-3-(2′-naphtyl)-alanine-D-4-chlorophenylalanine-D-3-(3′-pyridyl)-alanine-L-serine-L-tyrosine-D-citrulline-L-leucine-L-arginine-L-proline-D-alanine-amide
氨基酸序列：
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2
分子式：C70H92ClN17O14
分子量：1431.06
CAS：120287-85-6
化学结构式：
西曲瑞克是一种注射用的促性腺激素释放激素(GnRH)的拮抗剂，是含有五个非天然氨基酸的人工合成十肽，由德国默克雪兰诺公司研发和生产，于1999年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国上市。它通过抑制促黄体生成激素(LH)的过早释放而用于辅助生殖技术，能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡的过早排出，帮助受孕；也用于治疗一些对荷尔蒙敏感的肿瘤，如前列腺癌、子宫癌和乳腺癌；对于一些良性的妇科疾病，如子宫肌瘤、子宫内膜异位症和子宫内膜变薄，也有很好的疗效。该药物作为GnRH的拮抗剂，通过阻断GnRH在脑垂体上的作用位点，从而能够快速抑制促黄体生成激素(LH)和卵泡刺激激素(FSH)的产生和作用。
西曲瑞克的分子量1431.06，可能被胃肠道中的酵素所破坏，不能口服，仅能通过皮下或肌肉注射，作用迅速，一小时内可达血清浓度高峰30ng/mL，半衰期约为一天。它对GnRH的受体结合力比GnRH本身高出约20倍。至于拮抗剂以往的普遍缺点——释放组织胺而引起过敏的现象，也已经大大降低。临床发现，在接受注射的位置，偶尔会有一点红肿瘙痒的皮肤反应，真正比较严重的全身过敏迄今只有一例报告，是一位卵巢癌病人在接受连续七个月的大剂量(10mg/d)注射后，血压降低，皮肤出现红疹，咳嗽，不过在20min内很快就恢复了正常。
由于本身属于拮抗剂，西曲瑞克不会有使用初期的刺激反应，而且抑制LH的效果可以立即显现，所以临床上使用时间可以缩短，不必像以往使用强化物般，从上一个周期的黄体期即开始使用，可以在同周期逐渐接近可能排卵日前的72-120h才开始使用，目前有两种使用方法：单一剂量注射法和多次剂量注射法。单一剂量法是在排卵针剂刺激的第七天，一次皮下注射西曲瑞克3mg；多次剂量法则是提早两天，从第五天开始每24h注射小剂量西曲瑞克0.25mg，直到施打人体绒膜促性腺激素为止。这两种方法都可以有效抑制早发性黄体刺激素的上升，避免卵质过早黄体化，影响卵的质量。
西曲瑞克的另一个优点是可以降低卵巢过度刺激的发生率，因为此药物属于GnRH的拮抗剂，药理上会拮抗GnRH、FSH和LH的所有功能，当然也包括FSH的滤泡刺激功能和LH的类似HCG诱发卵巢排卵功能，进而降低过度刺激的可能，根据报告，可以将卵巢过度刺激综合征(OHSS)的比例由现在的5～6％降低至1～2％，大大减少了其威胁，也减少了病患需要住院的可能，使不孕症的治疗更加人性化。
西曲瑞克的合成可以分为固相合成以及液相合成两种方法。由于多肽序列中有多个特殊的氨基酸如D-Cit、D-3-Pal、D-Phe(4-Cl)和D-2-Nal，在液相缩合时的难度较大，每一步的纯化也不容易，所以西曲瑞克不适宜使用液相法合成。而固相合成法有Boc法和Fmoc法，Boc法每一步都要使用TFA进行脱保护，此过程会将部分的肽从树脂上切下来，减少最终的产品收率，肽链越长损失越严重，而且最后使用有剧毒的HF切割肽树脂，对环境和人体的伤害非常大。本发明使用成熟且快速的Fmoc法固相合成西曲瑞克，采用最小保护原则，使用廉价易得的Fmoc-D-Cit-OH，大大降低生产成本，脱保护和切割的条件都较为温和；而且使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，不仅避免了对整条肽链进行乙酰化的操作，节省试剂，精简步骤，更重要的是杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，全面防止杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的出现，提高了产品的收率和纯度，有利于工业化生产。
专利文献CN 101863960 B报道了一种以Boc-氨基酸和王树脂为原料，固相合成西曲瑞克的方法。该法的不足之处在于：每连接一个氨基酸之后都使用50％～60％(v/v)的TFA/DCM脱除Boc保护基，这会造成部分肽链从树脂上脱落，降低最终的产品收率，也会使一些易酸解的侧链保护基产生副反应。使用10％(v/v)的氨水对环境和人体也是有害的，严重时使人窒息，操作不当可能会发生爆炸。以H2和Pd为脱保护试剂反应24h，这需要特殊且昂贵的设备，相应的设备对厂房要求高，投资大，使用H2的操作很危险，残留的Pd很难除，尽反应时间长，粗肽得率只有60％～70％，不利于大规模工业化生产。本发明使用成熟且快速的Fmoc法固相合成西曲瑞克，以常规的多肽固相合成仪即可进行，对设备和厂房的要求低，无特殊和危险有毒的试剂，操作简便，对环境和人员无害，脱保护和切割的条件都非常温和；使用HPLC制备色谱柱对粗肽进行纯化，工艺简单易行，大大提高了产品的收率和纯度，有利于大规模工业化生产。
专利文献CN 101284863 B报道了一种固相合成西曲瑞克的制备方法，得到全保护的十肽树脂之后再使用乙酸酐/吡啶/二氯甲烷的混合液进行乙酰化反应。此法的缺点在于，使用无侧链保护的Fmoc-D-Cit-OH，忽视了D-Cit的侧链脲基极易被乙酰化的现象，以及由此生成的杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克。同时我们还注意到，此步骤中用到有毒试剂吡啶，对操作人员的健康有一定的危害性。此杂质的氨基酸序列如下：Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit(Ac)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2，分子式为：C72H94ClN17O15，分子量为：1473.11。此杂质对人体的毒性较大，它的存在严重影响了西曲瑞克的含量和使用安全，而以现有的技术方法在纯化阶段很难将其完全除尽，同时会造成西曲瑞克本身的收率降低，所以此文献的方法不利于药物开发的大规模生产。本发明使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，不仅避免了对整条肽链进行乙酰化的操作，节省试剂，精简步骤，更重要的是杜绝了D-Cit侧链脲基被乙酰化的现象，全面防止工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的出现，提高了产品的收率和纯度，适合大规模工业化生产。
专利文献CN 104086632 A报道了一制备西曲瑞克的方法。此方法的缺点在于，肽序6位偶联使用的Fmoc-D-Orn(Dde)-OH相比于Fmoc-D-Cit-OH，成本要高很多；氨基酸全部偶联完成后仍然需要乙酸酐对N端进行乙酰化反应；该法在乙酰化之后采用水合肼脱除D-Orn侧链的Dde操作，以及用异氰酸叔丁酯使D-Orn侧链修饰反应为D-Cit的操作，都使生产工艺变得非常繁琐，大幅增加成本，降低了生产效率，而且最终的产品中并不能完全避免工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克，不适合工业化的大规模生产。本发明使用最小保护原则，使用廉价易得的Fmoc-D-Cit-OH，大大降低生产成本，同时使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，避免了对整条肽链进行乙酰化的操作，节省试剂，精简步骤，更重要的是杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，全面防止工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的出现，提高了产品的收率和纯度，有利于大规模工业化生产。
专利文献CN 104277093 A报道了一种制备醋酸西曲瑞克的方法。此方法的缺点在于，十个氨基酸全部完成缩合之后，使用含有乙酸酐的试剂对整条肽链进行乙酰化，这必然导致肽序6位上无侧链保护的D-Cit的脲基也被乙酰化，从而形成工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克。该法在氨基酸缩合的过程中对树脂进行了微波处理，这会引起外消旋体杂质的大幅增加，而且现有的微波设备都是实验室研究级别，规模很小，很难实现大规模的工业化生产，此方法的应用受到了极大的限制。本发明使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH，避免了对整条肽链进行乙酰化的操作，节省试剂，精简步骤，杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，全面防止工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的出现；本发明使用常规的多肽固相合成仪就可以实现大规模工业生产，对反应设备无特殊要求。
综合研究以往的专利文献的，可以发现其中有诸多的技术问题，比如西曲瑞克固相合成中，有的工艺落后，对厂房和设备的要求高，且操作危险；有的粗肽产率小、成本高，纯品的收率低、纯度小；有的材料成本昂贵，工艺步骤繁琐等，特别是都不能避免或除尽工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克，这些问题都不利于西曲瑞克的的大规模工业生产。
发明内容
本发明针对背景技术中涉及的这些问题(例如西曲瑞克固相合成的粗肽成本高、产率小、纯度低，特别是都不能完全避免工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克)，提供一种成本低廉、步骤精简，收率大且纯度高的西曲瑞克的制备方法。使用成熟且快速的Fmoc法固相合成，脱保护和切割的反应条件非常温和，操作简便，避免了使用Boc法固相合成时每一步脱保护造成的肽链脱落；采用廉价易得的Fmoc-D-Cit-OH，大大降低生产的物料成本；同时使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，避免了对整条肽链进行乙酰化的操作，节省试剂，精简步骤，更重要的是杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，全面防止工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的产生，提高了粗肽的得率和纯度，也相应地提高了纯品的收率和纯度，有利于大规模工业化生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种西曲瑞克的制备方法，该方法包括如下步骤：
一种西曲瑞克的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH按照西曲瑞克的氨基酸序列连接至氨基树脂上，得到Fmoc-全保护九肽树脂，即Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂；
(2)将步骤(1)得到的Fmoc-全保护九肽树脂脱除Fmoc保护基，然后以偶联剂连接Ac-D-2-Nal-OH得到N端乙酰化的Ac-全保护十肽树脂，即Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂；
(3)将步骤(2)得到的Ac-全保护十肽树脂以裂解液切割，再以冰乙醚沉淀切割液而获得西曲瑞克粗肽；
(4)将步骤(3)得到的西曲瑞克粗肽溶于醋酸的水溶液，过滤后，经反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，再经过冷冻干燥，获得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。
步骤(1)中，所述的氨基树脂为以下几种中的任选一种，Rink Amide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PAL Amide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或RinkAmide-MBHA树脂；树脂的取代值为0.1～1.5mmol/g，树脂的颗粒大小为100～400目。
步骤(1)中，采用最小保护原则，肽序6位的氨基酸连接使用无侧链保护的Fmoc-D-Cit-OH为原料。
步骤(1)和(2)中，所述的偶联剂为以下八种混合物中的任选一种：
X试剂、HATU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HCTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂与DIC按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂与EDC·HCl按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂、PyAOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、PyBOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、TBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
其中，所述的X试剂为HOBt或HOAt，Y试剂为DIEA或NMM。
步骤(1)中，优选的方式是，按照1:(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC；将Fmoc-氨基酸和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸；连接下一个氨基酸之前用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基1～10次，每次脱保护的时间分别为1～100min，每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF洗涤树脂1～20次；最后得到Fmoc-九肽全保护树脂，即Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂。
步骤(2)中，Fmoc-九肽全保护树脂脱除Fmoc保护基的方法是用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液，脱Fmoc保护基重复1～10次，每次的脱保护时间分别为1～100min，再用DMF洗涤树脂1～20次。
步骤(2)中，优选的方式是，按照树脂摩尔数的(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)倍分别称取Ac-D-2-Nal-OH、HOBt和DIC；将Ac-D-2-Nal-OH和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的九肽全保护树脂中，机械搅拌反应至茚三酮检测结果为阴性时，抽干反应液，再以DMF洗涤树脂1～20次，可获得N端乙酰化的Ac-全保护十肽树脂，即
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂。
步骤(2)中，肽序1位的氨基酸连接采用预先将N端乙酰化的Ac-D-2-Nal-OH为原料。
步骤(1)和(2)中，接肽的反应温度为0～50℃，反应时间为0.1～10.0h。
步骤(3)中，切割肽树脂所用的裂解液是将三氟醋酸、水、苯酚和三异丙基硅烷按照88:5:5:2的体积比混合，再以1g肽树脂加入1～100mL裂解液的比例，将上述裂解液加入Ac-全保护十肽树脂中，0～50℃机械搅拌反应1～24h；然后将反应液过滤至-50～0℃的冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀1～20次，0～50℃减压干燥至恒重，得到西曲瑞克粗肽。
步骤(4)中，以1～20％v/v的醋酸的水溶液溶解西曲瑞克，再以0.1～10.0μm的微孔滤膜过滤。
步骤(4)中，所述的反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为纯乙腈或甲醇，B相为0.01～10％v/v的三氟醋酸的水溶液或磷酸的水溶液；检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果判断样品的纯度，合格的样品经合并和冷冻干燥之后，就可以获得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。
有益效果：本发明所述的西曲瑞克制备方法，尤其是西曲瑞克的固相合成方法，采用Fmoc法固相合成，避免了Boc法固相合成时所产生的一系列问题：如反复用TFA脱除Boc保护基时会使部分的肽从树脂上脱落下来，肽链越长则损失越严重，TFA脱除Boc时还会带来许多侧链副反应。此外，避免了使用HF气体做肽链的切割，减少了对环境的污染和对人体的伤害。本发明采用最小保护原则，使用无侧链保护的Fmoc-D-Cit-OH，避免了使用昂贵的有侧链保护的D-Cit，大大降低了成本。本发明使用预先将N端乙酰化的氨基酸Ac-D-2-Nal-OH代替Fmoc-D-2-Nal-OH，不仅避免了乙酰化的步骤，更重要的是杜绝了乙酰化试剂中的乙酸酐对于D-Cit侧链脲基的副反应，全面防止工艺杂质[D-Cit(Ac)6]-西曲瑞克的出现，提高了产品的纯度。本发明的工艺简单稳定，条件温和，易于控制，对人体和环境影响小，粗肽的产率大、纯度高，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1西曲瑞克粗肽的高效液相色谱图。
图2西曲瑞克纯肽的高效液相色谱图。
图3西曲瑞克粗肽的质谱谱图。
图4西曲瑞克纯肽的质谱谱图。
图5西曲瑞克的制备工艺流程图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明的方法及其核心思想。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做出的若干简单推演或者替换，在具体实施方式及应用范围上所做的改变之处，比如氨基酸缩合时更换缩合剂，调整缩合剂的比例，调整反应的时间或温度，都应当视为本发明的保护范围。
说明书或权利要就书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc：9-芴甲氧羰基
Linker：链接子
Boc：叔丁氧羰基
DCM：二氯甲烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Piperidine：六氢吡啶/哌啶
HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
NMM：N-甲基吗啉
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
PyAOP：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)
tBu：叔丁基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
D-Ala：D-丙氨酸
Pro：脯氨酸
Arg：精氨酸
Leu：亮氨酸
D-Cit：D-瓜氨酸
D-Orn：D-鸟氨酸
Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基
Tyr：酪氨酸
Ser：丝氨酸
D-3-Pal：D-3-吡啶基丙氨酸
D-Phe(4-Cl)：D-4-氯-苯丙氨酸
D-2-Nal：D-2-萘基丙氨酸
Ac：乙酰基
MeOH：甲醇
TFA：三氟醋酸
TIS：三异丙基硅烷
GnRH：促性腺激素释放激素
LH：促黄体生成激素
FSH：卵泡刺激激素
HCG：人体绒膜促性腺激素
OHSS：卵巢过度刺激综合征
FDA：食品药品监督管理局
RP-HPLC：反相-高效液相色谱
实施例1
(1)Fmoc-D-Ala-AM-树脂的制备
称取1.62g(1.0mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.62mmol/g)，置于带夹套的100mL多肽固相合成器中，加入20mL DMF溶胀两次，每次1小时。树脂溶胀完全后用隔膜泵抽去DMF，用15mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用20mL DMF洗涤5次，以隔膜泵抽去DMF。用5mL DMF溶解934.0mg(3.0mmol)Fmoc-D-Ala-OH和405.3mg(3.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入560.0μL(3.6mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色的时候，以隔膜泵抽去反应液，再用20mL DMF洗涤5次，抽干DMF即得Fmoc-D-Ala-AM-树脂。
(2)Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-D-Ala-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用5mL DMF溶解1012.1mg(3.0mmol)Fmoc-Pro-OH和405.3mg(3.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入560.0μL(3.6mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，以隔膜泵抽去反应液，再用20mL DMF洗5次，抽干DMF即得Fmoc-Pro-D-Ala-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
按照西曲瑞克氨基酸序列重复上述操作，依据表1的量称取氨基酸和缩合剂，加入5mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴10min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH，即得Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂。
表1 每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用5mL DMF溶解771.9mg(3.0mmol)Ac-D-2-Nal-OH和405.3mg(3.0mmol)HOBt，冰浴10min，加入560μL(3.6mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色，以隔膜泵抽去反应液，再用20mL DMF洗5次。然后以20mL DCM洗涤三次，再分别用20mL DCM和MeOH交替洗涤3次，再以20mL MeOH洗涤1次，以隔膜泵抽干MeOH，30℃减压干燥至树脂恒重，即得Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂。脱Fmoc和DMF洗涤的操作同(1)。
(4)Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2的制备。
将上述制备的Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂置于50mL圆底烧瓶中，加入30mL切割液(三氟醋酸、水、苯酚和三异丙基硅烷按照88:5:5:2的体积比混合)，25℃油浴加热，机械搅拌反应4h。然后将反应液过滤至6000mL的-20℃冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀3次，30℃减压干燥至恒重，得到西曲瑞克粗肽1.31g，产率为90.1％。粗肽的HPLC纯度为86.05％，相关的谱图见图1。粗肽的质谱结果见图3。
(5)HPLC法制备西曲瑞克纯品
称取80.0mg的西曲瑞克粗品，加入3mL 10％(v/v)的醋酸/水溶液，再以0.45μm的微孔滤膜过滤。
HPLC纯化条件如下：柱子：纳微Unips 10-300：10×250mm；流动相A：100％乙腈；流动相B：0.1％(v/v)TFA/H2O；流速：3mL/min；检测波长：220nm；洗脱梯度：20％-40％；时间：40min。
收集HPLC纯度为99.0％以上的样品，合并后冻干得到28.5mg的纯品，收率为35.6％。纯肽的HPLC纯度为99.91％，最大单杂为0.07％，总杂为0.09％，相关的谱图见图2。纯肽的质谱结果见图4。
实施例2
(1)Fmoc-D-Ala-AM-树脂的制备
称取25.0g(15.5mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.62mmol/g)，置于带夹套的500mL多肽固相合成器中，加入250mL DMF溶胀两次，每次1小时。树脂溶胀完全后用隔膜泵抽去DMF，用200mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用250mL DMF洗涤5次，以隔膜泵抽去DMF。用70mL DMF溶解12.1g(38.8mmol)Fmoc-D-Ala-OH和5.3g(38.8mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴10min，再加入7.2mL(46.5mmol)的DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色的时候，以隔膜泵抽去反应液，再用250mL DMF洗涤5次，抽干DMF即得Fmoc-D-Ala-AM-树脂。
(2)Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-D-Ala-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用70mL DMF溶解13.1g(38.8mmol)Fmoc-Pro-OH和5.3g(38.8mmol)HOBt，冰浴10min，再加入7.2mL(46.5mmol)的DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，以隔膜泵抽去反应液，再用250mL DMF洗5次，抽干DMF即得Fmoc-Pro-D-Ala-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
按照西曲瑞克氨基酸序列重复上述操作，依据表2的量称取氨基酸和缩合剂，加入70mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴10min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH，即得Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂。
表2 每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂的固相合成。
将上述制备的Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱Fmoc保护基之后，以隔膜泵抽去DMF。用70mL DMF溶解8.0g(31.0mmol)的Ac-D-2-Nal-OH和4.2g(31.0mmol)的HOBt，冰浴10min，再加入5.8mL(37.2mmol)的DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，机械搅拌反应1h，以恒温循环水控制反应温度为25℃。茚三酮检验呈阴性，即树脂无色透明，溶液为黄色的时候，以隔膜泵抽去反应液，再用250mL DMF洗5次。然后以250mL DCM洗涤三次，再分别用250mL DCM和MeOH交替洗涤3次，再以250mL MeOH洗涤1次，以隔膜泵抽干MeOH之后，30℃减压干燥至树脂恒重，即得Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
(4)Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2的制备。
将上述制备的Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-AM-树脂置于1000mL圆底烧瓶中，加入500mL切割液(三氟醋酸、水、苯酚和三异丙基硅烷按照88:5:5:2的体积比混合)，25℃油浴加热，机械搅拌反应4h。然后将反应液过滤至-20℃的冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀3次，30℃减压干燥至恒重，得到西曲瑞克粗肽21.5g，产率为96.9％。
(5)HPLC法制备西曲瑞克纯品
称取100.0mg的西曲瑞克粗品，加入4mL 10％(v/v)的醋酸/水溶液，再以0.45μm的微孔滤膜过滤。
HPLC纯化条件如下：柱子：纳微Unips 10-300：10×250mm；流动相A：100％乙腈；流动相B：0.1％(v/v)TFA/H2O；流速：3mL/min；检测波长：220nm；洗脱梯度：20％-40％；时间：40min。
收集HPLC纯度为99.0％以上的样品，合并后冻干得到36.0mg的纯品，收率为36.0％。

Claims (10)

1.一种西曲瑞克的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH按照西曲瑞克的氨基酸序列连接至氨基树脂上，得到Fmoc-全保护九肽树脂，即Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂；
(2)将步骤(1)得到的Fmoc-全保护九肽树脂脱除Fmoc保护基，然后以偶联剂连接Ac-D-2-Nal-OH得到N端乙酰化的Ac-全保护十肽树脂，即Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂；
(3)将步骤(2)得到的Ac-全保护十肽树脂以裂解液切割，再以冰乙醚沉淀切割液而获得西曲瑞克粗肽；
(4)将步骤(3)得到的西曲瑞克粗肽溶于醋酸的水溶液，过滤后，经反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，再经过冷冻干燥，获得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氨基树脂为以下几种中的任选一种，Rink Amide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PALAmide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或Rink Amide-MBHA树脂；树脂的取代值为0.1～1.5mmol/g，树脂的颗粒大小为100～400目。
3.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述的偶联剂为以下八种混合物中的任选一种：
X试剂、HATU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HCTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂与DIC按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂与EDC·HCl按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂、PyAOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、PyBOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、TBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
其中，所述的X试剂为HOBt或HOAt，Y试剂为DIEA或NMM。
4.根据权利要求3所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，按照1:(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、HOBt、DIC；将Fmoc-氨基酸和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸；连接下一个氨基酸之前用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基1～10次，每次脱保护的时间分别为1～100min，每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF洗涤树脂1～20次；最后得到Fmoc-九肽全保护树脂，即Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂。
5.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，Fmoc-九肽全保护树脂脱除Fmoc保护基的方法是用1％～50％v/v的哌啶的DMF溶液，脱Fmoc保护基重复1～10次，每次的脱保护时间分别为1～100min，再用DMF洗涤树脂1～20次。
6.根据权利要求1和权利要求4所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按照树脂摩尔数的(1.1～20):(1.1～20):(1.1～100)倍分别称取Ac-D-2-Nal-OH、HOBt和DIC；将Ac-D-2-Nal-OH和HOBt以DMF溶解，然后加入DIC混合成均匀的溶液，再将其加入溶胀后的九肽全保护树脂中，机械搅拌反应至茚三酮检测结果为阴性时，抽干反应液，再以DMF洗涤树脂1～20次，可获得N端乙酰化的Ac-全保护十肽树脂，即Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-氨基树脂。
7.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，接肽的反应温度为0～50℃，反应时间为0.1～10.0h。
8.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，切割肽树脂所用的裂解液是将三氟醋酸、水、苯酚和三异丙基硅烷按照88:5:5:2的体积比混合，再以1g肽树脂加入1～100mL裂解液的比例，将上述裂解液加入Ac-全保护十肽树脂中，0～50℃机械搅拌反应1～24h；然后将反应液过滤至-50～0℃的冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀1～20次，0～50℃减压干燥至恒重，得到西曲瑞克粗肽。
9.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，以1～20％v/v的醋酸的水溶液溶解西曲瑞克，再以0.1～10.0μm的微孔滤膜过滤。
10.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为纯乙腈或甲醇，B相为0.01～10％v/v的三氟醋酸的水溶液或磷酸的水溶液；检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果判断样品的纯度，合格的样品经合并和冷冻干燥之后，就可以获得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。
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