CN104910257B

CN104910257B - 戈舍瑞林的固相合成方法

Info

Publication number: CN104910257B
Application number: CN201510005951.2A
Authority: CN
Inventors: 夏丹; 王良友; 孙锋
Original assignee: SUZHOU TIANMA GROUP TIANJI BIO-PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: SUZHOU TIANMA GROUP TIANJI BIO-PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-01-07
Also published as: CN104910257A

Abstract

本发明公开一种戈舍瑞林的固相合成方法，包括：采用HBTU/DIPEA作为缩合体系，依次偶联Fmoc‑Ser‑OH、Fmoc‑Trp‑OH；将全保护裂解液按树脂重量的10倍加入相应体积的量将中间产物中的载体2‑CTC Resin去除，但保留所有侧链保护基；将全保护裂解液用DIPEA（N，N‑二异丙基乙胺）调成偏碱性并将盐酸氨基脲和PyBop（1H‑苯并三唑‑1‑基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐[用于肽的偶联剂）加入全保护裂解液中进行反应偶联，得到保留侧链保护基的戈舍瑞林肽溶液；将20%TFA/DCM的裂解液加入冰冻的乙醚中沉降获得白色固体粗肽；将白色固体粗肽真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸铵和Pa/c进行氢化反应去除肽序中侧链保护基。本发明避免了许多副反应现象，提高了目的肽的纯度，收率也相对较高，操作起来方便可行中间体可以跟踪控制，整个过程利于放大生产。

Description

戈舍瑞林的固相合成方法

技术领域

本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种戈舍瑞林的固相合成方法。

背景技术

戈舍瑞林，其中文化学名：焦谷氨酰-L-组氨酰-L-色氨酰-丝氨酰-L-酪氨酰-D-丝氨酰-L-亮氨酰-精氨酰-脯氨酰-氨基脲；英文名称：Goserelin，分子式：C59H84N18O14，分子量：1269.4105；适用症：适用于可用激素治疗的前列腺癌及绝经前和绝经期的乳腺癌。子宫内膜异位症；

本药是一种合成的、促黄体生成素释放激素的类似物，长期使用可抑制垂体的促黄体生成激素的分泌，从而引起男性血清睾酮和女性血清雌二醇的下降，停药后这一作用是可逆的。男性病人在第一次用药之后21日左右，睾酮浓度可降低到去势后的水平，在每28天用药1次的治疗过程中，睾酮浓度一直保持在去势后的浓度范围内。这种睾酮抑制作用可使大多数病人的前列腺肿瘤消退，症状改善。女性患者在初次用药后21日左右，血清雌二醇浓度受到抑制，并在以后每28天的治疗中维持在绝经后水平。这种抑制与激素依赖性的乳腺癌，子宫内膜异位症相关。

药代动力学：本药具有几乎完全的生物利用度。每4周使用一注射埋植剂，可保持有效血药浓度，而无组织蓄积。诺雷德的蛋白结合能力较差，在肾功能正常的情况下，血浆清除半衰期为2-4小时，肾功能不全病人的半衰期将会延长，但对于每月都使用埋植剂的患者来说，这影响非常小，故没有必要改变这些病人的用量。在肝功能不全的病人中，药代动力学无明显的变化。

毒理研究：在长期重复使用诺雷德的雄性鼠中，曾观察到良性脑垂体肿瘤的发病率上升，这一事实与以前已观察到的行外科去势后的大鼠的情形相似，但尚未发现与人体使用的经验有任何关联。在小鼠实验中，长期重复使用数倍于人类常用剂量的诺雷德后，可发现胰岛细胞及幽门部胃粘膜细胞增生。这些事实与临床的关系尚不清楚。

从市场分析可以看出戈舍瑞林的需求量还是比较大的，前景比较可观，但是目前就戈舍瑞林的合成方法就归结于两类，一种为固相合成方法一种为液相合成方法，但每种方法都有各自的优缺点。

CN 101759777A采用的是“5+4“的一个纯液相片段合成法，主要是先合成一个五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH,选氯甲酸叔丁酯作为缩合试剂一步一步缩合而成，同样的方法再合成一个4肽片段D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2，然后将5肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和4肽片段D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2在缩合试剂的条件下缩合完成得到目的物肽序Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2。实验证明这种纯液相片段合成中，两个片段偶联时反应周期较长，时间一般是常规偶连反应的10倍左右，造成时间的浪费合成的危险性相对加大；纯液相合成法虽然省去了树脂的部分费用但是反应步骤较多，反应比较繁杂，过程中不容易控制，洗涤等操作加大难度甚至难以实行造成最终产品纯度不高给纯化制备加大难度；纯液相片段缩合法在合成片段时，片段作为一个原料其量需加倍甚至有时还会出现补投现象所以说片段合成的量一般是目的肽合成的量的5倍左右，如果放大会给生产造成很大的费用；虽然纯液相片段合成法也能很顺利的合成出目的产物，但是存在上述的一些缺陷综合考虑还是不利于大规模的生产。

CN 102446383A采用的是原始的固相合成法来完成戈舍瑞林的操作，主要是这样的一个反应：

首先1、将Rink Amide MBHA Reain 与N,N’- 羰基二咪唑反应生成

2、将上述的中间产物与Fmoc-NH-NH2反应得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin；

3、以Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin为起始物进行固相合成一次偶联带有保护基团的氨基酸至结束；

4、裂解得到粗肽进行纯化制备。

此专利中所涉及的氨基酸的支链基团都没有进行保护，完全裸露。这样首先就是会造成在合成过程中出现许多副反应现象，造成目的肽纯度低纯化难度大，还有就是在合成过程中利用Rink Amide MBHA Reain 与N,N’- 羰基二咪唑反应生成中间产物再与Fmoc-NH-NH2反应得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin整个过程无法跟踪，无法确定偶联反应程度及偶联效果，整个过程放大生产难以实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种戈舍瑞林的固相合成方法，该戈舍瑞林的固相合成方法集合了固、液相合成方法中各自的优点，避免了许多副反应现象，提高了目的肽的纯度，收率也相对较高，操作起来方便可行中间体可以跟踪控制，整个过程利于放大生产。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种戈舍瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：

步骤一、由Fmoc-Pro-OH和替代度为1.1-1.3mmol/g 的2-CTC Resin在激活剂N，N-二异丙基乙胺的作用下，室温反应1h得到Fmoc-Pro-CTC Resin，加入20%DBLK（哌啶：DMF=1：4）去除Fmoc得到H- Pro-CTC Resin；

所述Fmoc-Pro-OH的结构式如下：

所述2-CTC Resin的结构式如下：

步骤二、按照常规的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反应1h、DMF作溶剂依次偶联以下Fmoc 的氨基酸Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Tyr(Bzl) -OH得到Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin；

步骤三、采用HBTU/DIPEA作为偶联缩合体系，在DCM作溶剂的条件下，反应10min，依次偶联Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin；

步骤四、按照常规的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反应1h、DMF作溶剂依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin；

步骤五、将全保护裂解液按树脂重量的10倍（w:v=1:10）加入相应体积的量将H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-2-CTC Resin中的载体2-CTC Resin去除；

步骤六、将全保护裂解液用DIPEA（N，N-二异丙基乙胺）调成偏碱性PH=7.8-8.5优选7.8-8.2按摩尔量的3倍将称量好的盐酸氨基脲和PyBop（1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐[用于肽的偶联剂）加入PH在7.8-8.2左右的全保护裂解液中进行反应偶联，从而得到保留侧链保护基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2旋蒸浓缩成粘稠状物；

步骤七、配置20%TFA/DCM 的裂解液（v:v=1:4）缓慢加入到步骤六中的粘稠状物中使其搅拌室温裂解2h，再将其裂解液缓慢加入冰冻的乙醚中放置30min进行沉降即得到去除His(Trt)上的侧链保护基Trt前体肽II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2的白色固体物。

步骤八、将步骤七的白色固体前体肽II真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸铵和Pa/c进行氢化反应去除肽序中侧链保护基NO2和Bzl，从而得到戈舍瑞林粗肽甲醇溶液Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2；

步骤九、将含有甲醇溶液的戈舍瑞林粗品溶液进行过滤去除过量的Pa/c及甲酸铵然后加入5倍量的纯水将样品析出离心得到纯度90%的戈舍瑞林粗肽固体，制备得到戈舍瑞林。

上述技术方案进一步改进的技术方案如下：

1. 上述方案中，所述全保护裂解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1：4的体积组成，裂解条件为在室温下2h。

2. 上述方案中，所述步骤八中甲酸铵和Pa/c分别按粗肽计算质量的10%和5%投入。

3. 上述方案中，所述步骤九还包括：将步骤八的氢化反应后的甲醇溶液过滤加入5倍量的纯水将样品析出离心得到纯度90%的戈舍瑞林粗肽。

4. 上述方案中，所述步骤八中反应时间5h，反应温度40摄氏度。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1. 本发明戈舍瑞林的固相合成方法，其采用的是在液相中偶联氨基脲的这样一个过程采用固液结合首先是固体上合成肽树脂全保护裂解后液相偶联氨基脲的方法，可以随时跟踪检测氨基脲的偶联效果，解决了现有技术中无法监测的这样一个弊端。

2. 本发明戈舍瑞林的固相合成方法，步骤三中偶联Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ser-OH采用的缩合试剂组HBTU/DIPEA，DCM作溶剂反应时间为10min 与常规偶联方法采用缩合试剂组HOBT/DIC DMF作溶剂反应时间为1h相比大大的缩短了反应时间控制了Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Ser-OH两个氨基酸侧链未保护反应中产生副反应及杂质的问题。

3. 本发明戈舍瑞林的固相合成方法，其肽序中的Fmoc-His(Trt)-OH的侧链保护基采用的是Trt保护，主要是利用Trt与tBu对酸的敏感度的不同来达到去除Trt保留tBu的这样一个目的，权力要求书步骤七中主要是利用20%TFA/DCM（TFA：DCM=1：4）混合溶液一次去除Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2 肽序中的侧链保护基Trt。与现有专利0.1%-3%反复裂解五次，省去了大量成本及人力又能很好的控制保护基tBu不受影响以便确保反应质量。本发明简单易行首先利用原料Fmoc-His(Trt)-OH参与反应，因为侧链被保护所以侧链不参与合成中的反应，不会带来相应的副反应及相应的杂质，待合成完全结束后再将其侧链保护基去除，解决了现有专利技术中采用Fmoc-His-OH 在合成反应过程由于侧链没有保护又没有现有条件能控制其侧链不参与反应由此在反应中副反应大反应杂质多的这样一个缺点，同时也解决了Fmoc-His-OH采用别的保护基如：（Fmoc-His(Fmoc)-OH Fmoc-His(mmt)-OH 等）操作复杂，合成难度大,在实验过程中我们也尝试过选择Fmoc-His(Fmoc)-OH作为原料但在同样的合成条件下Fmoc-His(Trt)-OH只要反应30min就可完成而Fmoc-His(Fmoc)-OH则需反应20-40h还反应不完全Fmoc-His(mmt)-OH也存在同样的难题。

4. 本发明戈舍瑞林的固相合成方法，其采用的精氨酸和酪氨酸的侧链保护基为NO2和Bzl，可利用氢化反应一步去除成功，将带有NO2和Bzl 的Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2的白色固体粗肽用甲醇溶解后加入甲酸铵和Pa/c（按按粗肽计算质量的10%和5%分别投入）进行氢化反应，反应温度为40摄氏度反应时间5h过滤得到戈舍瑞林粗肽甲醇溶液将溶液进行过滤去除过量的Pa/c及甲酸铵然后加入5倍量的纯水将样品析出离心得到纯度90%的戈舍瑞林粗肽固体，制备得到戈舍瑞林。

5. 本发明戈舍瑞林的固相合成方法，将Fmoc-His(Trt)-OH 侧链上的Trt用酸去除，然后再利用氢化反应将Fmoc-Arg(NO2)-OH和Fmoc-Tyr(Bzl)-OH 上的NO2和Bzl去除，过滤掉钯碳后用5倍纯水析出离心得到固体戈舍瑞林粗肽，用少量的乙腈溶成糊状后加水至溶解澄清，给纯化制备带来方便,，以至于纯化制备一次可得到戈舍瑞林目的物99%，解决了现有技术中纯化的制备溶液为二氯甲烷反复上样反复冲出导致收率降低的成本较高的一个不足点，同时也很好的解决了现有技术中到纯化制备的溶液中含有大量的酸，在制备过程中需用大量的碱与其中和，才可制备纯化，整个的酸碱中和过程中会大量的放热，危险性较大，不可以实行放大生产的一个大问题。

附图说明

附图1为本发明全保护裂解后粗肽的HPLC分析图谱；

附图2为本发明全保护裂解后粗肽偶联氨基脲后的HPLC分析跟踪图谱；

附图3为本发明显示的是粗品的一个纯度情况图；

附图4为本发明仪器DIOIVEX U3000分析的戈舍瑞林粗品HPLC图谱图；

附图5为本发明双联质谱仪分析检测戈舍瑞林粗品MS图谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种戈舍瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：

步骤一、根据预设替代度sub（0.6mmol/g）=n（合成规模）/（X_{(裸2-CTC Resin+n*}M）氨基酸分子量这里指Fmoc-Pro-OH 的分子量）可计算出X(裸2-CTC Resinz的质量)=266g Fmoc-Pro-OH在合成树脂的步骤中投料量为摩尔量的1.3倍即计算得出Fmoc-Pro-OH为87g将称取替代度为1.1~1.3mmol/g 的2-CTC Resin266g（合成规模200mmol）加入反应柱中同时加入3000mlDMF溶胀20min,溶胀后抽掉DMF，在加入3000mlDMF洗涤两次，每次1min.将称量好的Fmoc-Pro-OH87g 在DMF/DCM的混合溶液中冰浴条件下加入摩尔量两倍的DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)的作用下，室温反应,反应时间由所期待的替代度决定。反应后处理DMF洗涤5次每次3000ml每次1min，然后加入3000ml封闭液（DCM：甲醇：DIPEA=80：15：5）封闭两次每次10min得到sub=0.6mmol/g 的Fmoc-Pro-CTC Resin，加入3000ml20%DBLK（哌啶：DMF=1：4）去除Fmoc两次,每次时间为10min待去除完毕后加入3000m的DMF洗涤两次，得到H-Pro-CTCResin；这里所述Fmoc-Pro-OH和2-CTC Resin的结构式同权力要求说明书步骤一

步骤二、按照常规的固相合成方法，将步骤一中的脱完Fmoc的H- Pro-CTC Resin用DMF洗涤4次，每次3000ml，洗涤时间1min,将称量好Fmoc-Arg(NO2)-OH9(摩尔量的3倍)、和HOBT(摩尔量的3倍)投入反应柱中补加DIC、反应1h、待反应完毕后取树脂20-30粒用少量DMF洗涤两遍进行茚三酮检测显阳性则表明反应未完全需继续反应或是重复偶联，若检测显阴性则表明反应完全可进行下一步的偶联反应，按以上步骤依次偶联以下Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Tyr(Bzl) -OH得到Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin；

步骤三、将Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin加入3000mlDBLK去除Fmoc 后DMF洗涤4次，每次3000ml,时间1min，加入称量好HBTU（摩尔量的3倍）和Fmoc-Ser-OH(摩尔量的3倍)投入反应柱中补加DIPEA和DCM使其搅拌均匀反应10min抽掉反应液加入DMF洗涤3次，每次3000ml，洗涤时间1min取树脂20-30粒茚三酮检测显阳性则表明反应未完全需继续反应或是重复偶联，若检测显阴性则表明反应完全可进行下一步的偶联反应按以上步骤偶联Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin；

步骤四、按照常规的固相合成方法同步骤二，采用HOBT/DIC、反应1h、DMF作溶剂依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin肽树脂520g；

步骤五、按1:10（w:v）的树脂与裂解液的比例配制全保护裂解液5200mL（V_三氟乙醇:V_{二氯甲烷=}1:4）加入到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-2-CTC Resin肽树脂中的搅拌反应2h，待反应完毕后过滤抽掉树脂保留溶液目的去除其载体2-CTC Resin；

步骤六、将全保护裂解液取出1ml作HPLC分析定位出峰时间1，然后再将其溶液用DIPEA（N，N-二异丙基乙胺）调成偏碱性PH=7.8-8.5优选7.8-8.2按摩尔量的3倍将称量好的盐酸氨基脲和PyBop（1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐[用于肽的偶联剂）加入PH在7.8-8.2左右的全保护裂解液中进行反应偶联，反应时间1h ，待反应完毕后取出1ml同样条件下作HPLC分析定位出峰时间2，然后根据峰型的变化及有无前移情况从而判断跟踪氨基脲的偶联情况，如峰型有变化但反应前的峰1没有完全转变到反应1h后的峰2说明还未反应完全需继续反应，若反应前的峰1完全转变为反应1h后的峰2说明已经反应完全则可以进行下一步实验最后得到保留侧链保护基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2再将其溶液旋蒸浓缩1h后变为淡黄色粘稠状物；

步骤七、配置20%TFA/DCM 的裂解液（v:v=1:4）缓慢加入到步骤六中的粘稠状物中使其搅拌室温裂解2h，再将其裂解液缓慢加入冰冻的乙醚中放置30min进行沉降即得到去除His(Trt)上的侧链保护基Trt前体肽II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO2）-Pro-Azgly-NH2 320g

步骤八、将步骤七的白色固体粗肽真空抽干按1g/4ml用甲醇溶解溶解体积为1110ml，加入甲酸铵32g和Pa/c 16g进行氢化反应去除肽序中侧链保护基NO2和Bzl，从而得到戈舍瑞林粗肽Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2甲醇溶液；

步骤九、将步骤八的氢化反应后的甲醇溶液过滤后得到995mL加入5倍量的纯水将样品析出离心得到纯度90%的戈舍瑞林粗肽固体

步骤十、制备得到戈舍瑞林。

上述全保护裂解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1：4的体积份组成，裂解条件为在室温下2h。

上述步骤八中甲酸铵和Pa/c分别按粗品计算质量的10%和5%投入。

上述步骤八中反应时间5h，反应温度40摄氏度。

本实施例中所采用的氨基酸原料及去除条件如下表1所示：

表1

实施实例过程中所涉及的碱为：二异丙基乙胺（DIEA）

实施实例过程中所涉及的缩合试剂为：HOBT/DIC、HBTU/DIPEA

实施实例过程中所涉及的Fmoc脱除试剂为20%DBLK（哌啶：DMF=1：4）

根据树脂投料量W1以及替代度sub，计算出氨基酸（W2）， DIPEA等的的投料量：

W2=W1×sub ×n×M2

VDIPEA：W1×sub×n×3×MDIPEA/ρDIPEA

其中n为氨基酸相当于树脂摩尔量的投料比，Ｍ2为氨基酸的分子量。

图1显示全保护裂解后粗肽的HPLC分析图谱，图谱充分显示目的物的出峰时间，有待生产人员观察当次合成效果也为下步全保护裂解中偶联氨基脲峰型有无变化及偶联效率和偶联结果有个很好的把控；

图2显示全保护裂解后粗肽偶联氨基脲后的HPLC分析跟踪图谱图谱显示偶联氨基脲后分析图谱时间前移主要目的是与图一进行相比较使生产人员能够跟踪样品的偶联结果这也是本发明为什么在液相中偶联氨基脲的一个原因；

图3 可以充分证明20%TFA/DCM的混合溶液去除Fmoc-His(Trt)-OH 侧链的Trt 效果是很好的，可以看出去除比较彻底，峰型比较单一。

图4 显示的是粗品的一个纯度情况，纯度90%，相对较好纯化制备比较容易。

图5，在实验过程中粗品的MS确认为1269 与戈舍瑞林成品分子量符合

图1图2分析条件：

仪器：DIOIVEX U3000，

色谱柱：100A 5um C18 4.6*250mm，

检测波长：254，

流动相：A相：0.1/%TFA B相：乙腈，

梯度：5-95，

可以根据图谱定位分析，判断氨基脲偶联效果。

附图3

图3分析条件：

仪器：DIOIVEX U3000，

色谱柱：100A 5um C18 4.6*250mm，

检测波长：254，

流动相：A相：0.1/%TFA B相：乙腈，

梯度：5-95。

HPLC分析检测氢化反应效果判断是否反应完全

加入纯水析出得到目的肽戈舍瑞林粗肽（附图4HPLC,附图5 MS）

Pyr-His-Trp-Ser-Tyr- D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2 MW：1269；

图4分析条件：

仪器：DIOIVEX U3000，

色谱柱：100A 5um C18 4.6*250mm，

检测波长：254，

流动相：A相：0.1/%TFA B相：乙腈，

梯度：5-95，

图5分析条件：

双联质谱仪分离，

使用仪器：液联质谱（赛墨菲），

制备条件：流动相，A相：水 B相：100%乙腈，

流速：0.2mL/min；

时间（min）	A相（%，V/V）	B相（%， V/V）
			0-2	50→50	50→50

综上，本发明戈舍瑞林的固相合成方法，其戈舍瑞林的固相合成方法集合了固、液相合成方法中各自的优点，避免了许多副反应现象，提高了目的肽的纯度，收率也相对较高，操作起来方便可行中间体可以跟踪控制，整个过程利于放大生产。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、由Fmoc-Pro-OH和替代度为1.1-1.3mmol/g 的2-CTC Resin在激活剂N，N-二异丙基乙胺的作用下，室温反应得到Fmoc-Pro-CTC Resin，加入20%DBLK（哌啶：DMF=1：4）去除Fmoc得到H- Pro-CTC Resin；

所述Fmoc-Pro-OH的结构式如下：

所述2-CTC Resin的结构式如下：

步骤二、按照常规的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反应1h、DMF作溶剂依次偶联以下Fmoc 保护的氨基酸Fmoc-Arg(NO₂)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Tyr(Bzl) -OH得到Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO₂)-Pro-CTC Resin；

步骤三、采用HBTU/DIPEA作为缩合体系，在DCM作溶剂的条件下，反应10min，依次偶联Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO₂)-Pro-CTC Resin；

步骤四、按照常规的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反应1h、DMF作溶剂依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO₂)-Pro-CTC Resin；

步骤五、将全保护裂解液按树脂重量的10倍加入到步骤四的肽树脂中充分搅拌均匀将H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO₂)-Pro-2-CTC Resin中的载体2-CTC Resin去除，但保留所有侧链保护基；所述全保护裂解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1：4的体积组成，裂解条件为在室温下2h；

步骤六、将全保护裂解液用DIPEA（N，N-二异丙基乙胺）调成偏碱性PH= 7.8-8.2按摩尔量的3倍将称量好的盐酸氨基脲和PyBop（1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐）加入PH在7.8-8.2的全保护裂解液中进行反应偶联，从而得到保留侧链保护基的戈舍瑞林前体肽I Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO₂）-Pro-Azgly-NH₂的溶液状态将其溶液旋蒸浓缩成粘稠状物或是固体状物；

步骤七、配置20%TFA/DCM 的裂解液缓慢加入到步骤六中的粘稠状物中使其搅拌室温裂解2h，再将其裂解液缓慢加入冰冻的乙醚中放置30min进行沉降即得到去除His(Trt)上的侧链保护基Trt得到前体肽II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg（NO₂）-Pro-Azgly-NH₂的白色固体物；

步骤八、将步骤七中的前体肽II白色固体物真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸铵和Pa/c进行氢化反应去除肽序中侧链保护基NO₂和Bzl，从而得到戈舍瑞林粗肽Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂的甲醇溶液；

步骤九、将含有甲醇溶液的戈舍瑞林粗品进行过滤去除过量的Pa/c及甲酸铵然后加入5倍量的纯水将样品析出离心得到纯度90%的戈舍瑞林粗肽固体，

制备得到戈舍瑞林。

2.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述步骤八中甲酸铵和Pa/c分别按粗肽计算质量的10%和5%投入。

3.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的固相合成方法，其特征在于：所述步骤八中反应时间5h，反应温度为40摄氏度。