CN104277093A - 以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及醋酸西曲瑞克的制备方法。本发明以Rink Amide-AM Resin为载体，以低成本的DIC/HOBt为缩合剂，采用特有的微波反应技术，缩短了反应时间，提高了缩合效率，其粗品收率达到90％以上；得到的西曲瑞克粗品经反相高效液相色谱纯化以及我们特有的醋酸转盐技术，制得的醋酸西曲瑞克纯品收率达到30％以上，彻底清除了三氟醋酸对生物体的毒性。本发明优化了缩合反应步骤，合成多肽工艺简单易行，生产成本低且产品收率高，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。

Description

以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法。 

背景技术

中文名：醋酸西曲瑞克 

英文名：cetrorelix Acetate 

结构式：Ac-D-2-Nal-D-Cpa-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 

分子式及分子量：C70H92N17014C1    1431.06 

醋酸西曲瑞克(cetrorelix Acetate)，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素(LH-RH)受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕，因此常作注射用西曲瑞克制剂。 

抗癌药西曲瑞克是一种新合成的促性腺激素释放激素(GNRH)拮抗剂，通过与内源性LHRH竞争垂体细胞上的膜受体，从而控制黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的释放，推迟女性LH峰的出现，进而控制排卵。西曲瑞克通过剂量依赖抑制脑垂体腺的黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的分泌，抑制作用是直接的，并通过连续的治疗来维持，不引起黄体激素受体活性在初始时高涨随后下调。西曲瑞克作为第三代GnRHA有其独特的药物动力学和稳定性，大量研究表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维瘤、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有预防和改善作用。 

西曲瑞克及其类似物的制备方法早期主要是液相合成工艺，操作复杂，难以纯化，不利于工业生产、应用价值不高；目前在国内外关于西曲瑞克合成报道不多，专利CN101284863A以Fmoc-Linker-MBHA-Resin为起始原料，以Fmoc保护基的氨基酸为原料，使用20％哌啶/DMF溶液进行脱保护，并以醋酐/比啶/二氯甲烷混合溶液进行乙酰化，经切割沉降得到西曲瑞克粗品；该合成方法中常用到有毒试剂吡啶，吡啶易燃，有强烈刺激性，能麻醉中枢神经系统，对眼及上呼吸道有刺激作用，长期吸入会出现头晕、头痛、失眠及消化道功能紊乱。专利CN101863960A以Boc氨基酸及Wang树脂为原料，用氨解的方法以H2和pd为脱保护试剂，经过旋蒸滤液得到西曲瑞克粗品；该方法以TFA/DCM为氨基端的脱保护试剂，采用 氨解的方法制备西曲瑞克粗品，其中氨水有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息，与酸中和反应产生热，有燃烧爆炸危险；氨水用以除去三氟乙酸，以避免三氟乙酸影响西曲瑞克的醋酸含量，但氨水会和多余的TFA形成盐，不易进行后续的纯化过程。 

以上描述的西曲瑞克制备方法中，都用到了毒性较大的试剂，若用于西曲瑞克的大量制备，定会长期接触此类试剂，对人身体伤害较大。本发明利用Fmoc固相合成原理，开发了固相高效合成技术，采用常见易得、低成本的试剂合成制备，通过工艺优化以及特有的微波反应技术处理，西曲瑞克粗品收率高达92％以上，其纯品得率达到30～40％，大大提高了西曲瑞克的得率；本发明还采用强阴离子交换树脂-醋酸转盐技术处理西曲瑞克纯品，大大降低了纯品中三氟醋酸的含量，彻底清除了三氟醋酸对生物体的毒性；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于大规模生产。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法，该制备方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有合成醋酸西曲瑞克原料的广泛的应用前景。 

本发明醋酸西曲瑞克的制备方法，包括固相多肽合成法制备西曲瑞克树脂，西曲瑞克树脂切割沉降后得到西曲瑞克粗品，西曲瑞克粗品纯化、转盐冻干后得到醋酸西曲瑞克纯品；为实现上述目的，本发明采取以下技术方案制备醋酸西曲瑞克： 

(1)以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接西曲瑞克氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，得到西曲瑞克前体肽I-氨基树脂如下： 

Fmoc-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基树脂 

(2)脱掉D-Nal保护基，进行N端乙酰化反应，得到两曲瑞克前体肽II-氨基树脂如下： 

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基树脂 

(3)切割、沉降后，得到西曲瑞克粗肽III如下： 

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 

(4)纯化、转盐及冻干得到醋酸两曲瑞克IV。 

上述的西曲瑞克固相合成工艺中，步骤(1)所述氨基树脂优选为Rink Amide-AM Resin。反应中以20％哌啶/DMF溶液为脱保护试剂，以反应器1/3～1/2容积的溶液体积进行洗脱；以 DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，进行多肽的缩合反应。 

步骤(2)所述乙酰化反应，以醋酐∶DIEA∶DMF=1∶1∶4(体积比)比例的混合液为乙酰化试剂，混合液体积为反应器容积的1/3～1/2。 

步骤(3)所述切割、沉降反应，切割试剂的用量为1g树脂10ml切割试剂，需额外配制部分切割试剂，用于洗涤切割后树脂的二次沉降；沉降试剂的用量为1ml切割试剂8ml乙醚沉降。离心沉淀去上清，重复操作3次得到多肽粗产品。 

步骤(4)所述纯化工艺，选用C18制备柱进行反相高效液相色谱纯化，采用醋酸-强阴离子交换树脂转盐技术处理西曲瑞克多肽，最终得到醋酸西曲瑞克IV纯品。 

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。 

实施例1 

1.氨基树脂的溶胀 

称量取代度为0.3～0.87mmol/g的Rink-AM-Resin0.16g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。 

2.Fmoc-西曲瑞克树脂的合成 

西曲瑞克前体肽I-氨基树脂为： 

Fmoc-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基树脂 

本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1～10个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示： 

本发明中一些常用的缩写具有以下含义： 

Fmoc：芴甲氧羰基pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰 

D-Cit：D-瓜氨酸tBu：叔丁基3-pyridyl-D-Ala：3-D-苯丙氨酸 

D-2-Nal：D-2-萘基丙氨酸HOBt：1-羟基苯并三唑 

DIC：N，N-二异丙基碳化二亚胺DIEA：N，N-二异丙基乙胺 

DMF：N，N-二甲基甲酰胺Pip：六氢吡啶TFA：三氟醋酸 

(1)保护氨基酸的活化方法 

以Fmoc-D-Ala-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取22.4lmgFmoc-D-Ala-OH和20.92mg HOBt于离心管中，加2ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。 

(2)脱保护后树脂的洗涤方法 

将脱保护溶液抽干，再向抽干的树脂中加入1/3～1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，用真空泵将溶液抽干，重复操作3次。 

茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应20～50min。采用上述同样方法，依次接入第2～10个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即得到西曲瑞克前体肽I-氨基树脂。 

3.西曲瑞克粗肽III的粗品收率 

由于收到的粗品中含有大量的TFA盐和部分切割试剂，为了更好的计算粗品的得率，本发明采用C18(20*250mm)色谱柱进行除盐步骤。 

样品完全溶解后过滤，以9ml/min的流速(流动相：A0.1％乙酸/水，B0.1％乙酸/乙腈)在214nm下按照如下程序进样分析： 

收集样品峰溶液，冻干后称重得样品为70.1mg，根据粗品的量和合成测定实际取代度 (SD=0.33mmol/g)计算的理论量，计算粗品收率达到92.7％，比现有技术仅60％的收率有大幅度成倍的提高。 

4.醋酸两曲瑞克Ⅳ的制备 

将西曲瑞克粗品III溶于乙酸/乙腈/水中，经反相高效液相色谱法纯化得到西曲瑞克多肽，制备条件为：C18制备柱，流动相为A(0.1％乙酸/水)/B(0.1％乙酸/乙腈)，流速9ml/min，检测波长210nm；将纯化、冻干后的西曲瑞克多肽用1％醋酸溶解，采用强阴离子交换树脂室温搅拌吸附1h，之后将吸附液补加醋酸含量到5％，经冻干、称量得到醋酸西曲瑞克纯品23.3mg，纯度达到99.631％，纯品收率为30.8％；分别称取转盐前后的西曲瑞克多肽各1mg，按药典方法测定醋酸含量，转盐前醋酸含量为1.73％，转盐后醋酸含量为6.8％，符合药典要求(醋酸含量在4％～8％)，目标物醋酸西曲瑞克产品合格。 

实施例2 

本发明进行了西曲瑞克制备方法收率的对比实验，即缩合反应①正常缩合反应20～50min后洗涤②正常缩合反应25～30min后，加0.5ml DIEA，微波氨基树脂10～20s后洗涤；经过上述实验方法合成得到的西曲瑞克粗品的收率为①92.7％、②95.2％，经纯化、转盐制备得到醋酸西曲瑞克纯品①23.3mg、②25.8mg，纯品收率为①30.8％、②34.1％。 

实施例3 

为确定实验结果的稳定性，本发明又进行了二次重复合成，缩合反应①正常缩合反应20～50min后洗涤②正常缩合反应25～30min后，加0.5ml DIEA，微波氨基树脂10～20s后洗涤；得到西曲瑞克粗品的纯度达78～85％，粗品收率为①93.7％、②94.98％，经纯化、转盐制备得到醋酸西曲瑞克纯品①31.7mg、②34.76mg，纯品收率为①31.01％、②34.0％；证实本发明实验数据的正确性及稳定性。 

经上述实施例2和例3实验，得出正常合成后微波制备得到的醋酸西曲瑞克纯品的收率更高，效果较佳。 

Claims (8)

1.一种以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于包括以下步骤：以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次缩合西曲瑞克氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到西曲瑞克前体肽I-氨基树脂，之后脱掉D-Nal保护基，进行N端乙酰化反应，得到西曲瑞克前体肽II-氨基树脂，再进行切割沉降反应，得到西曲瑞克粗肽III，经纯化、醋酸转盐技术以及冻干得到醋酸西曲瑞克IV。

2.根据权利要求1所述的制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于所述的氨基树脂为RinkAmide-AM Resin，取代度为0.3～0.87mmol/g。

3.根据权利要求1所述的制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala(3-pyridyl)-OH、Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH、Fmoc-D-2-Nal-OH，所述缩合反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的2～4倍，缩合反应温度为20～40℃。

4.根据权利要求1所述的制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC/HOBt，缩合反应时间为20～50min；所述脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液，洗脱时间为15～30min。

5.根掘权利要求1所述的制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于乙酰化反应的乙酰化试剂为醋酐∶DIEA∶DMF=1∶1∶4(体积比)比例的混合液，乙酰化反应时间为20～40min。

6.根据权利要求1所述的制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于切割沉降反应的切割试剂100ml配方为：87.5ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5ml EDT+5g苯酚，切割反应温度为20～30℃；多肽的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚。

7.根据权利要求1所述的制备醋酸两曲瑞克的方法，其特征在于纯化工艺中选用C18，10μm，250mmI.D.×20[cm]制备柱进行反相高效液相色谱纯化，按照如下优化的制备梯度程序

纯化粗肽III；将粗肽III冻干，以醋酸溶解多肽并采用强阴离子交换树脂转换三氟醋酸盐，得到醋酸西曲瑞克Ⅳ纯品。

8.一种以RinkAmide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法，其特征在于：

(1)根据权利要求1～7所述的方法制得醋酸西曲瑞克纯品；

(2)一种提高醋酸西曲瑞克收率的方法，其特征在于：在权利要求4中的缩合反应步骤，在氨基酸缩合反应25～30min后，将氨基树脂微波反应10～20s。