CN107573408A

CN107573408A - 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法

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Publication number: CN107573408A
Application number: CN201710899431.XA
Authority: CN
Inventors: 单连民; 刘兵; 王林鹏; 安宁; 万龙岩; 张道桂; 江晓漫
Original assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107573408B

Abstract

本发明提供一种制备亮丙瑞林的方法，包括步骤：(1)由Fmoc‑Pro‑CTC‑OH和CTC树脂为起始原料，经处理得Fmoc‑Pro‑CTC树脂；(2)将Fmoc‑Pro‑CTC树脂采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂；(3)以20％三氟乙醇/DCM溶液作为切割试剂，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽‑树脂进行切割，得侧链全保护的亮丙瑞林前体肽；(4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化，得侧链全保护亮丙瑞林；(5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，得亮丙瑞林粗肽；(6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得高纯亮丙瑞林原料药。本发明方法操作简单，周期短，成本低，产品收率高，环境污染小，非常适于工业化生产。

Description

一种高纯度亮丙瑞林的合成方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域，特别涉及一种固相法和液相法结合的高纯度亮丙瑞林合成方法。

背景技术

亮丙瑞林，制剂中文名称为醋酸亮丙瑞林、抑那通或者简称亮丙瑞林，英文名称为Leuprorelinacetate、Enanton，Lucrin等。亮丙瑞林的适应症为子宫内膜异位症；伴有月经过多、下腹痛、腰痛及贫血等的子宫肌瘤；绝经前乳腺癌，且雌激素受体阳性患者；前列腺癌；中枢性性早熟症。临床主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症。

亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的Fujino Masahiko等人首先发现，并且发明合成工艺，其作为促黄体激素释放激素的九肽酰胺类似物，具有很好的活性。其先后在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为 JP19740027442、DE2446005、US4008209等。随后，又有一些研究机构和个人发表了一些合成工艺，专利号为EP1088555、EP1777232、US5480868 等。

在中国专利CN200610119341.6公开的制备方法为在粗品合成肽键接肽时采用机械搅拌，氨基酸单体、HOBt和DIC用DMF溶解后倒入树脂中，室温下反应1-2h。抽干溶剂，再以DMF洗涤8次、抽干，kaiser试剂检测反应是否完全。然而，机械搅拌死角较多，不利于反应充分混匀反应，脱保护产生的CO₂和缩合反应产生的H₂O，残留在反应液中，导致消耗更多的单体和试剂，并容易发生副反应，接肽反应率下降，粗品纯度和含量降低。

在中国专利CN200910104993.6公开的制备方法为在亮丙瑞林粗肽制备时，将侧链全保护，即将亮丙瑞林10mmol加入到250ml反应瓶中，将配制好的裂解试剂200mL倒入至上述反应瓶中，室温反应2小时。反应结束，将反应液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重得亮丙瑞林粗肽。裂解沉淀过程时，需要消耗大量乙醚，增加了生产成本和后期废液处理的成本，不利于工业化生产。同时，该法无法完全避免二酮哌嗪副反应，放大生产时，二酮哌嗪副反应造成肽链脱落，显著降低收率。

目前已经公布的亮丙瑞林制备工艺都有着一定的缺陷，不能在操作复杂性、危险性、生产周期、产品总收率、产品成本和污染环境等方面达到一种较好的结合，应用价值不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的亮丙瑞林的合成工艺，解决现有技术存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种合成高纯度亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：

(1)由Fmoc-Pro-CTC-OH和CTC树脂为起始原料，经反应得到 Fmoc-Pro-CTC树脂；

(2)将Fmoc-Pro-CTC树脂用Fmoc/tBu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂；

(3)配制体积比为20％的三氟乙醇的DCM溶液作为切割试剂，切割试剂冷却后加入，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂进行切割，得到全保护亮丙瑞林前体肽；

(4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林；

(5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，得到亮丙瑞林粗肽；

(6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。

在本发明方法的步骤(1)中，以DCM作为反应的溶剂。具体来说，用 DCM将CTC树脂溶胀，溶胀时间为0.8-1h，加入反应釜中；用DCM将 Fmoc-Pro-OH溶解后，加入一定量的DIEA，然后再加入到反应釜中；从反应釜底部通入氮气，反应时间为2-3h；反应完成后，对树脂进行封头，配制甲醇：DIEA：DCM(体积比1∶1∶2)的混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用DMF洗涤2-6次。

在现有的技术文献中，大部分的科研人员选用了HMPB-AM树脂或Wang树脂作为起始原料。然而，本发明的科研人员在长期的实验过程中发现，使用该两种树脂均十分容易产生副反应：二酮哌嗪反应，特别是Wang 树脂，该副反应主要出现在第一个氨基酸为Pro的时候，当第二个氨基酸脱 FMOC的时候，α-氨基被游离出来之后，立即对Wang树脂的苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同时从Wang树脂上释放出来，导致反应终止。该反应非常迅速，文献报道采用50％Pip/DMF，脱1min，4min 的条件，但是我们实验证明在多数情况下，即使是1min左右反应就超过了 20％。因此，经过理论摸索和实践验证，我们尝试了采用2-Cl-Trt树脂合成，该树脂的巨大空间阻力完全消除了该副反应。

同时，在步骤(1)中，采用了氮气搅拌，可以使反应更加充分地进行，并意想不到地通过带走反应产生的H₂O，降低反应中氨基酸单体数量至1.5 倍。

本发明方法的步骤(2)所述的具有保护基团的氨基酸采用Fmoc基团保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu的形式应用。

本发明方法的步骤(2)所述的Fmoc保护基通过20％哌啶/DMF溶液处理来除去。

在本发明方法的步骤(2)所述的逐一偶联时，氨基酸相对于合成规模的投料比为1-6倍；所述逐一偶联剂的体系是DCC/HOBt，或者是EDC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是 PyAOP/HOAt，或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt；偶联反应溶剂是四氢呋喃(THF)，或者是二氧六环、 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，或者是二氯甲烷(DCM)，或者是N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或者是二甲基亚砜(DMSO)；偶联反应的有机碱是N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，或者是三乙胺(TEA)，或者是N-甲基吗啡啉(NMM)，或者是2,4,6-三甲基吡啶(TMP)；偶联反应时间为1-3小时。

本发明方法的步骤(3)所述的切割试剂，根据亮丙瑞林前体肽-树脂的质量多少进行投料，每克干燥树脂配制10ml切割试剂。

在本发明方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，需加入HATU、2,4,6- 三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，反应在25℃恒温进行，搅拌，反应0.5-3h。

在本发明方法的步骤(4)所述的乙胺化修饰中，加入HATU、2,4,6-三甲基吡啶作为反应试剂。其中，前体肽、HATU、2,4,6-三甲基吡啶三者的摩尔比为1∶2-3∶1.5-2；最佳地，三者的摩尔比为1∶2∶2。

本发明方法的步骤(4)所述的实验过程是将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，得到侧链全保护的亮丙瑞林。在现有的文献中，公开的实验方案虽多，但是实验反应所需的时间均在12-24小时之间，通常需要反应过夜。本发明的步骤(4)在已公开的实验技术基础上，反复优化实验条件，使得反应进行所需的时间大大地得到缩短，仅需0.5-3h即可完成。优选地，步骤(4)所述的乙胺化修饰得到侧链全保护的亮丙瑞林的反应时间为1h。本发明的步骤(4)中，反应釜中加入HATU、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺的摩尔比为1∶1∶1。

本发明方法的步骤(5)所述的对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割需使用切割液，切割液为TFA：水(体积比为95∶5)。先低温下0-5℃加入侧链全保护的亮丙瑞林，再缓慢恢复至室温，反应1.5-3.5h。反应完成后，在 33℃下低温旋蒸，去除反应液至原体积的1/3，再加入冰无水乙醚沉淀，离心过滤收集沉淀。

本发明方法步骤(5)所述的对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割的反应在0-5℃下进行，可以有效避免反应过于剧烈，使反应趋于温和，减少消旋副反应的发生。

本发明方法的步骤(6)所述的CM纯化是将亮丙瑞林粗品用pH6.0、 0.05mol/L的乙酸钠溶液溶解(按1g粗品加入80～100ml溶液)，0.45μm膜过滤，上层析柱CM-SephadexG25。上样完毕后用pH6.0、0.05mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤至稳定，再用pH6.0、0.5mol/L乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，出峰时开始收集，至吸光值不在变化时停止收集。收集的洗脱液经HPLC分析纯度，并计算含量。

CM纯化：为弱阳离子交换树脂纯化，为HPLC纯化前的预纯化。粗品经过预纯化处理后，一方面可将大部分短肽和大分子肽分离去除，将其纯度提高至少10％，有利于实现生产出高纯度肽(纯度可达到99.5％以上)。另一方面则可提前去除粗品中的各种有机溶剂(极性有机溶剂)，不溶性颗粒，使之避免进入HPLC系统内，保护和延长HPLC系统使用寿命，大大降低设备使用成本；同时可使HPLC柱在梯度精细分离过程中避免极性有机溶剂干扰，保持良好的重复性和分离度，从而实现产品质量的持续稳定性。CM预纯化后，获得较高纯度的洗脱液可显著提高后期HPLC纯化的单次上样量，从而实现工业化生产。

本发明方法的步骤(6)所述的HPLC纯化是收集的预处理洗脱液经 0.45μm膜过滤后上已经过溶剂A(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)平衡好的制备型HPLC柱。用溶剂A(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)和溶剂B(0.5％乙酸、 80％乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥99.5％的收集液即得醋酸亮丙瑞林中间体，杂质总含量小于0.5％。

本发明方法的步骤(6)中，使用的溶剂A和溶剂B避免了使用较复杂的磷酸三乙胺体系、或者酸性强且不容易保存和配制的三氟乙酸体系，采用乙酸/乙腈体系，大大简化了纯化过程，降低了生产成本和人力成本。采用乙酸/乙腈体系，可避免引入磷酸，三乙胺，三氟乙酸等试剂，简化了后续有机溶剂去除工艺，降低原料药有机溶剂残留风险。

本发明方法的步骤(6)所述的浓缩过程为：醋酸亮丙瑞林中间体用1～ 2倍注射用水稀释后再吸附到HPLC制备柱上，用溶剂C(0.1M醋酸铵溶液、 pH＝5.0)洗涤，溶剂A(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)洗涤，最后用溶剂D(0.5％乙酸、40％乙腈溶液)洗脱，收集有吸收值部分；旋转浓缩：上述的柱浓缩液，经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1Mpa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。

本发明方法的步骤(6)所述溶解、冻干过程为：将浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个0.22μm过滤器过滤，再用注射用水冲洗过滤器。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％；进箱：过滤后的药液，倒入冻干盘中，进冻干箱冻干；冻干工艺条件为：预冻：导热油温度小于-40℃，保温2小时左右。升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度不大于30pa。导热油温度达约38℃时，保温约8小时至干燥终点；出箱后即得醋酸亮丙瑞林原料药。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如表1所示：

表1缩略词表

实施例1

Fmoc-Pro-CTC树脂制备

1.1称量CTC树脂200g，加入到反应釜中，加入1500ml DCM，使树脂完全溶胀在DCM溶剂中，溶胀1h，抽干。若溶胀过程出现试剂不能完全浸泡树脂的情况，应酌量补加试剂。称量Fmoc-Pro-OH 54.0g，用700ml DCM 溶解，加入28ml DIEA混匀，然后加入到反应釜中，从反应釜底部通入氮气，反应120min。

1.2封头，配制甲醇：DIEA：DCM(体积比1：1：2)混合溶液800ml；加入到反应釜中，氮气振摇反应20min。将反应液抽干，用DMF洗涤4次。

1.3分光光度计测定取代度，检测替代度为0.51mmol/g。

实施例2

侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-CTC树脂的制备

Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTCResin

2.1、接二肽

脱保护：DMF洗涤完毕后，向反应釜中加入20％哌啶/DMF溶液700ml (此数值可调整，以树脂充分混合均匀为宜，反应20min。将脱保护液抽干， DMF洗涤8次，每次700ml。洗完可用kaiser试剂检测，若数值呈红褐色，则表明脱保护成功。

接肽：Fmoc-Arg(pbf)-OH 97g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

将称取的Fmoc-Arg(pbf)-OH和HOBT放于烧杯中，加入DMF将其溶解，再向烧杯中加入DIC活化20s，混合均匀。加入到反应釜中反应60min。在缩合过程中，视情况补加DMF溶液，使反应中树脂呈流沙状。

检测：用长勺取少量树脂于试管中，用kaiser试剂检测，树脂呈无色透明状，说明反应完全。将反应液抽干，再向反应釜中加入700ml DMF，混合振摇洗涤3min，抽干，重复操作8次。

2.2、接三肽

去保护基、洗涤：方法同接二肽项目

接肽：Fmoc-Leu-OH 61g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

2.3、接四肽

去保护基、洗涤，方法同接二肽项下。

接肽：Fmoc-D-Leu-OH 61g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

2.4、接五肽

接肽：Fmoc-Tyr(tbu)-OH 79g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

2.5、接六肽

接肽：Fmoc-Ser(tbu)-OH 66g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

2.6、接七肽

去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽项下。

接肽：Fmoc-Trp(Boc)-OH 90g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽项目。

2.7、接八肽

脱保护、洗涤：方法同接二肽项下。

接肽：Fmoc-His(trt)-OH 108g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

2.8、接九肽

脱保护、洗涤：方法同接二肽项下。

接肽：pGlu 22g(150mmol)

Hobt 20g(150mmol)

DIC 54ml(300mmol)

方法同接二肽。

洗涤：DMF洗涤4次、甲醇洗涤4次，抽干。

干燥：树脂于50℃烘箱中干燥5小时以上，再置P₂O₅干燥箱中干燥至恒重，称重得亮丙瑞林前体肽-树脂167g。

实施例3

制备侧链全保护的亮丙瑞林前体肽：

Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH

称量亮丙瑞林前体肽-树脂，加入到两个3L三角瓶中。按每g干燥树脂 10ml切割试剂，配制20％的三氟乙醇/DCM溶液，在冰箱冷却1h后，分别加入到两个反应瓶中，振摇速度100r/min，反应120min；将上述切割后溶液置于旋转蒸发器中，35℃减压蒸干，得亮丙瑞林前体肽175.2g，MS：1889。

实施例4

制备侧链全保护的亮丙瑞林：

pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHCH₂CH₃

取冻干后的上述肽46mmol(87g)，溶于5.75L二氯甲烷中，进行乙胺化修饰，按摩尔比，称取92mmol(35g，2n)的HATU，92mmol(11.1g，2n)的2,4,6-三甲基吡啶和92mmol(4.1g，2n)的乙胺加入到上述混合溶液中，25℃恒温搅拌1h。乙胺化修饰完成后，将上述反应液旋转浓缩至干，再冻干。得侧链全保护的亮丙瑞林91.5g(HPLC纯度94.0％，收率98％，MS1916)。

实施例5

制备亮丙瑞林粗肽：

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHCH₂CH₃

取冻干后的上述肽，按50mg/ml的多肽浓度，进行侧链切割。按TFA：水＝95：5配制切割液，先低温加入肽，再缓慢恢复至室温，反应120min。反应结束后，在33℃下低温旋蒸，去除反应液至原体积的1/3。再加入冰无水乙醚沉淀，离心/过滤收集沉淀，真空干燥得亮丙瑞林粗品91g。(HPLC 纯度88.0％，收率98％，MS1209)。

实施例6

CM纯化

将上述亮丙瑞林粗品91克，用pH6.0、0.05mol/L的乙酸钠溶液溶解(按 1g粗品加入80～100ml溶液)，0.45μm膜过滤，上层析柱CM-SephadexG25。上样完毕后用pH6.0、0.05mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤至稳定，再用pH6.0、 0.5mol/L乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，出峰时开始收集，至吸光值不在变化时停止收集。收集的洗脱液经HPLC分析纯度(纯度应≥90％)，并计算含量。

实施例7

HPLC纯化

收集的预处理洗脱液经0.45μm膜过滤后上已经过溶剂A(0.5％乙酸、 5％乙腈溶液)平衡好的制备型HPLC柱。用溶剂A(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)和溶剂B(0.5％乙酸、80％乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥99.5％的收集液即得醋酸亮丙瑞林中间体，有关物质总纯度≤0.5％。 (HPLC纯度99.8％，收率89％)。

实施例8

浓缩

8.1、醋酸亮丙瑞林中间体用1～2倍注射用水稀释后再吸附到HPLC制备柱上，用溶剂C(0.1M醋酸铵溶液、pH＝5.0)洗涤，溶剂A(0.5％乙酸、 5％乙腈溶液)洗涤，最后用溶剂D(0.5％乙酸、40％乙腈溶液)洗脱，收集有吸收值部分。

8.2、旋转浓缩：上述的柱浓缩液，经40～45℃减压浓缩(真空度为 -0.08～-0.1Mpa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。

实施例9

溶解、冻干

9.1、溶解：将浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个0.22μm过滤器过滤，再用注射用水冲洗过滤器。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％。

9.2、进箱：过滤后的药液，倒入冻干盘中，进冻干箱冻干。

9.3、冻干工艺条件为：预冻：导热油温度小于-40℃，保温2小时左右。升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度不大于30pa。导热油温度达约38℃时，保温约8小时至干燥终点。

9.4、出箱后即得醋酸亮丙瑞林原料药49克。

实施例10

1、实验A按照以下实验步骤进行：

1)Fmoc-Pro-HMPB-AM树脂的制备

将HMPB-AM树脂111.0g，替代度为0.9mmol/g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，将77.6g Fmoc-Pro-OH，加入上述装有树脂的反应柱中搅拌反应2小时。反应结束，用DMF洗涤3 次，DCM洗3次，用甲醇封闭30分钟，后用甲醇收缩得到Fmoc-Pro-HMPB-AM树脂，检测替代度为0.6mmol/g。

2)侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-HMPB-AM树脂的制备

称取100gFmoc-Pro-HMPB-AM树脂(0.6mmol/g，60mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀0.5小时。溶胀结束，用20％DBLK 去除Fmoc保护，后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将77.76g Fmoc-Arg(pbf)-OH(120mmol)，24.315g HOBt(180mmol)，37.8g DCC溶于 DCM中(可以加入少量DMF助溶)，加入固相反应器中，室温搅拌反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准)。重复以上步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr-OH、、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu等剩余氨基酸的连接。当pGlu偶联结束后，将树脂用DMF洗涤3次，DCM洗3次，后用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-HMPB-AM树脂 201.082g(树脂增重率99.1％)。

3)pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH的制备(侧链全保护的亮丙瑞林前体肽的制备)

将201.082g侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-HMPB-AM树脂(60mmol) 加入到3000ml圆底烧瓶中，配制裂解试剂2000ml(三氟乙醇1800ml， DCM200ml)，将裂解试剂倒入树脂中，室温反应1小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液，将滤液减压蒸干，并且真空干燥，得到侧链全保护的亮丙瑞林前体粗肽104.2g(HPLC纯度86.5％，收率92.04％，MS1889)。

4)pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHCH₂CH₃的制备(侧链全保护的亮丙瑞林)

将104.2g侧链全保护的亮丙瑞林前体粗肽(55.2mmol)加到2000ml的三口烧瓶中，加入500ml二氯甲烷使其完全溶解。称取115.9g DCC和74.25g HOBt(552mmol)加入到上述反应瓶中，剧烈搅拌反应30min。30min后再反应瓶中加入550ml 1mol/L乙胺的二氯甲烷溶液，室温反应过夜。反应结束，用1M盐酸洗、水洗、10％碳酸氢钠洗、水洗、饱和氯化钠洗，然后用无水硫酸镁干燥1小时。干燥结束，过滤滤液浓缩蒸干，减压干燥得侧链全保护的亮丙瑞林105.2g(HPLC纯度80.5％，收率99.5％，MS1916)。

5)亮丙瑞林粗肽的制备

将19.2g侧链全保护的亮丙瑞林(10mmol，纯度80.5％)加入到250ml 反应瓶中，将配制好的裂解试剂200mL(三氟乙酸190ml，水10ml)倒入至上述反应瓶中，室温反应2小时。反应结束，将反应液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重得亮丙瑞林粗肽11.872g (HPLC纯度85.7％，收率98.2％，MS1209)。

6)亮丙瑞林精肽的制备

将11.872g亮丙瑞林粗品使用高效液相制备色谱纯化，流动相：A相： 0.1％-0.3％磷酸水溶液用三乙胺调pH至2.0-3.0；B相：乙腈和甲醇(V乙腈∶ V甲醇＝4∶1)混合液。流速：70-80ml/min。检测波长：280nm。梯度：B％： 12％～43％(55min)，收集纯度大于98.5％以上馏分，浓缩、冻干得到7.242g 亮丙瑞林的精肽(HPLC纯度＞98.5％，收率51.0％，MS1209)，总收率46.0％。

2、实验B按照本说明书实施例1-9依次进行

3、实验C按照本说明书实施例1-5、7-9，依次进行

4、实验结论分析

实验A、B、C三者的比较情况如表1。由表1分析对比可知，运用氮气搅拌反应，可以使氨基酸单体数量和HOBT数量减半，粗品纯度也有所提高。旋蒸去除反应液可使乙醚用量大大降低，采用CM纯化预处理和乙酸/ 乙腈HPLC纯化体系，不仅简化了生产过程，降低生产成本，进一步提高了成品质量和稳定性。

实验B所得粗品，当经过实施例6步骤(CM柱预纯化)后，所得洗脱液再进行实施例7步骤(HPLC纯化)，所得纯度≥99.5％的合格中间体，纯化收率比实验C由60％提高至89％，中间体有关物质也明显偏低，进一步提高了成品质量。

表1工艺结果对比

实施例11

偶联试剂的选择

取冻干后的亮丙瑞林前体肽，按8mmol/ml的多肽浓度，进行乙胺化修饰，按摩尔比，加入偶联试剂，到上述混合溶液中，25℃恒温搅拌1h。乙胺化修饰完成后，将上述反应液旋转浓缩至干，再冻干，得侧链全保护亮丙瑞林。(表2中，n表示摩尔量的倍数)

表2不同偶联试剂的实验结果比较

实验结论：由上述表格数据分析可知，使用不同组合的缩合剂进行乙胺化，反应1小时后，DCC+HOBt反应率最低，纯度也最低。DIC+HOBt 所得侧链全保护亮丙瑞林，颜色最浅，为类白色，但是纯度较低。对偶联试剂HATU和2,4,6-三甲基吡啶(TMP)的用量进行对比试验，随着2,4,6- 三甲基吡啶用量的增加，所得侧链全保护的亮丙瑞林，颜色加深。当前体肽：HATU：TMP摩尔比例为1∶2-3∶1.5-2时，实验的收率与纯度较优；当HATU、TMP的比例均为肽投料量的2倍摩尔量(2n)时，为浅黄色，收率可达到98％，纯度最优，且HATU、TMP都是工业上易得价廉的原料，非常有利于规模化的大生产。

Claims

1.一种固相法和液相法结合的制备亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：

1)将CTC树脂置于反应釜中，加入DCM溶胀；将Fmoc-Pro-OH溶解于DCM，加入DIEA混匀后，加入到反应釜中，从反应釜底部通入氮气，进行搅拌、反应；配制甲醇∶DIEA∶DCM混合溶液，加入反应釜中，继续通入氮气振摇反应，将反应液抽干，用DMF洗涤，得到Fmoc-Pro-CTC树脂；

2)将Fmoc-Pro-CTC树脂用Fmoc/tBu固相法以逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂；

3)配制三氟乙醇/DCM溶液作为切割试剂，浓度优选为20％v/v，切割试剂冷却后，加入到反应釜中反应，对侧链全保护的亮丙瑞林前体肽-树脂进行切割，得到侧链全保护的亮丙瑞林前体肽；

4)将侧链全保护的亮丙瑞林前体肽进行乙胺化修饰，向反应釜中加入HAT U、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺作为反应试剂，搅拌，反应0.5-3h，得到侧链全保护的亮丙瑞林；

5)对侧链全保护的亮丙瑞林进行侧链切割，切割液为TFA/水混合溶液，混合比优选体积比95/5，先低温下加入侧链全保护的亮丙瑞林，再缓慢恢复至室温，反应1.5-3.5h，低温下旋蒸、沉淀、离心，得到亮丙瑞林粗肽；

6)对亮丙瑞林粗肽进行CM纯化、HPLC纯化，浓缩，溶解、冻干，得到高纯度的亮丙瑞林原料药。

2.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤4)中的侧链全保护的亮丙瑞林前体肽与HATU、2,4,6-三甲基吡啶三者的摩尔量比为1∶2-3∶1.5-2。

3.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤4)中的侧链全保护的亮丙瑞林前体肽与HATU、2,4,6-三甲基吡啶三者的摩尔量比为1∶2∶2。

4.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤4)中的HATU、2,4,6-三甲基吡啶、乙胺的摩尔比为1∶1∶1。

5.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤4)中的反应时间为1h。

6.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤5)中的反应是在0-5℃下进行的。

7.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤6)中的CM纯化包括：将亮丙瑞林粗品用pH6.0、0.05mol/L的乙酸钠溶液溶解，0.45μm膜过滤，上层析柱CM-Sephadex G25，上样完毕后用pH6.0、0.05mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤至稳定，再用pH6.0、0.5mol/L乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，出峰时开始收集，至吸光值不在变化时停止收集。

8.根据权利要求1所述的制备亮丙瑞林的方法，其中步骤6)中所述HPLC纯化的操作为：收集的预处理洗脱液经0.45μm膜过滤后上已经过溶剂A平衡好的制备型HPLC柱；用溶剂A和溶剂B进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥99.5％的收集液即得醋酸亮丙瑞林中间体；其中溶剂A为0.5％v/v乙酸和5％v/v乙腈混合水溶液，溶剂B为0.5％v/v乙酸和80％v/v乙腈混合水溶液。