CN103435687B

CN103435687B - 一种卡贝缩宫素的纯化方法

Info

Publication number: CN103435687B
Application number: CN201310399939.5A
Authority: CN
Inventors: 路杨; 杨东晖; 周亮; 张阳萍
Original assignee: HANGZHOU ADLAI NORTYE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU ANUO BIOLOGICAL MEDICINE TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103435687A

Abstract

本发明涉及一种卡贝缩宫素的纯化方法，其特征包括以下步骤：步骤1.将卡贝缩宫素粗品用水溶解，调节pH到酸性；步骤2.按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相填料柱；步骤3.将步骤1溶液载入聚合物反相填料中；步骤4.按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。收集全部洗脱馏分；步骤5.将洗脱馏分经过干燥得到纯品卡贝缩宫素。

Description

一种卡贝缩宫素的纯化方法

技术领域：

本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物的纯化方法。

背景技术：

卡贝缩宫素为一种环状多肽，结构式如下：

化学式如下：

卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。

中国专利CN101531705公开了一种卡贝缩宫素的纯化方法，具体步骤为：先对卡贝缩宫素粗肽溶液进行反相色谱梯度洗脱纯化，然后采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。该法收率不高，且不能有效分离卡贝缩宫素与杂质D-Cys5-卡贝缩宫素。

现有卡贝缩宫素的固相合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已知的杂质包括：D-Cys5-卡贝缩宫素，D-Asn4-卡贝缩宫素，Gly8-OH-卡贝缩宫素等，未知杂质还有很多。有关杂质中D-Cys5-卡贝缩宫素，结构如下：

该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，易变色，该杂质的存在严重影响卡贝缩宫素的色泽，含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1%以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成卡贝缩宫素本身收率降低。为此，本发明人重点研究如何去除杂质D-Cys5-卡贝缩宫素而不影响卡贝缩宫素的收率问题。

本发明人用现有的纯化方法，对用固相合成法制备的卡贝缩宫素进行了纯化，发现杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量均无法达到预订目标0.1%。为此，本发明人对卡贝缩宫素的纯化方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高收率、高纯度以及低杂质的卡贝缩宫素的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一种卡贝缩宫素的纯化方法，解决(1)卡贝缩宫素成品纯度不高，(2)卡贝缩宫素成品收率不高，(3)卡贝缩宫素与杂质D-Cys5-卡贝缩宫素不能有效分离的问题。

本发明中一些常用的缩写具有以下含义；

Fmoc：芴甲氧羰基

Fmoc-AA：芴甲氧羰基保护的氨基酸

tBu：叔丁基

HOBt：1-羟基苯骈三唑

DIC：N，N′-二异丙基碳化二亚胺

Tyr(Me)：酪氨酸侧链用甲基保护

Ile：异亮氨酸

Gln：谷氨酰胺

Asn：天门冬酰胺

Cys：半胱氨酸

Pro：脯氨酸

Leu：亮氨酸

Gly：甘氨酸

Trt：三苯甲基

Me：甲基

DMF：N，N′-二甲基甲酰胺

Piperidine：六氢吡啶

TFA：三氟醋酸

TIS：三异丙基硅烷

MeOH：甲醇

DCM：二氯甲烷

DMAP：4-二甲氨基吡啶

Kniser test检测试剂为：茚三酮

本发明的技术方案为：

使用聚合物反相填料柱可以使卡贝缩宫素与杂质D-Cys5-卡贝缩宫素得到有效分离。

为此本发明提供一种卡贝缩宫素的纯化方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，将卡贝缩宫素粗品用水溶解，调节pH到酸性；

步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相填料柱；

步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相填料中；

步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。收集全部洗脱馏分；

步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品卡贝缩宫素。

聚合物反相填料柱为(UniPS^TM10，10μm，50mm×250mm)；

流动相：A为0.3%醋酸水溶液;

流动相B为乙腈；

梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，

检测波长为220nm。

优选的操作步骤如下：

步骤1，样品处理：

将1.70g的卡贝缩宫素粗肽溶解于1000ml纯净水中，使用醋酸调节pH为3.4。

步骤2，平衡

按体积分数设置梯度，使用100%的流动相A冲洗交换柱10min；步骤3，上样

将样品溶液载入交换柱中；

步骤4，洗脱

按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，分部收集洗脱馏分。

步骤5，冻干

将洗脱馏分经过冻干得到纯品卡贝缩宫素。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

采用中国专利CN101531705的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.15%

采用中国专利201110151928的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.16%

采用中国专利200910106758的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.12%

采用本发明的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质[Gly9-OH]-阿托西班的含量如下：0.07%。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1、聚合物反相填料的选择：

UniPS^TM10；UniPS^TM20

2、流动相的选择：

醋酸水/乙腈；TFA/乙腈

3、梯度洗脱程序的选择：

梯度程序为:（1）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。（2）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。

为此提出了6种实验条件：

实验条件1：聚合物反相填料柱(UniPS^TM10，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件2：聚合物反相填料柱(UniPS^TM20，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件3：聚合物反相填料柱(UniPS^TM10，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件4：聚合物反相填料柱(UniPS^TM20，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件5：聚合物反相填料柱(UniPS^TM10，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件6：聚合物反相填料柱(UniPS^TM20，10μm，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

采用实验条件1的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质[Gly9-OH]-卡贝缩宫素的含量如下：0.07%

采用实验条件2的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.12%

采用实验条件3的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.10%

采用实验条件4的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.11%

采用实验条件5的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.12%

采用实验条件6的方法纯化粗品卡贝缩宫素，测定杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量如下：0.14%

以上结果表明，实验条件1的纯化效果最优。

本发明方法得到的卡贝缩宫素40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下：

时间，天

外观、性状

有关物质

0	为白色粉末	未见杂质斑点
			10	为白色粉末	未见杂质斑点
30	为白色粉末	未见杂质斑点
			60	为白色粉末	未见杂质斑点
90	为白色粉末	未见杂质斑点

现有技术得到的卡贝缩宫素40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下

时间，天	外观、性状	有关物质
			0	为白色粉末	未见杂质斑点
10	为白色粉末	未见杂质斑点
			30	为白色粉末	未见杂质斑点
60	为白色粉末	未见杂质斑点
			90	为浅黄色粉末	可见杂质斑点

本发明的有益效果是：提供了一种高纯度（99.5%）、高收率（50%—80%）以及低杂质（D-Cys5-卡贝缩宫素含量小于0.1%）的卡贝缩宫素纯化方法。

附图说明

图1纯化前卡贝缩宫素HPLC杂质分析图谱（杂质D-Cys5-卡贝缩宫素含量大于0.5%）

图2纯化后卡贝缩宫素HPLC杂质分析图谱（杂质D-Cys5-卡贝缩宫素含量小于0.1%）

图3卡贝缩宫素标准品HPLC图谱

具体实施方式：

实施例1：

卡贝缩宫素的固相合成：

规模为：1.0mmol卡贝缩宫素合成：

步骤（1）肽树脂反应：称取1.38g(1.1mmol)Wang Resin（替代度为0.80mmol/g）加入到反应釜中，加入15ml DCM，在15-35℃下搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。称取1.17g(3.3mmol)Fmoc-Leu-OH、0.45g(3.3mmol)HOBt装入溶解罐。量取6ml的DMF溶剂加入罐中，搅拌溶解，完全溶解后冰浴降温至0-15℃左右，加入510μl(3.3mmol)的DIC，搅拌均匀后控温10-25℃保持5min，加入0.04g(0.3mmol)DMAP,然后加入到反应釜内，25-35℃反应5h，取样检测替代度为0.73mmol/g，抽除反应液。量取10ml DMF加入反应釜，搅拌洗涤3分钟，重复洗涤3次。量取525μl(5.5mmol)乙酸酐，445μl(5.5mmol)吡啶，10mlDMF溶液，混合均匀后加入反应釜内搅拌反应60min，抽除反应液。量取10ml DMF加入反应釜，搅拌洗涤3分钟，重复洗涤3次。量取10ml MeOH加入反应釜，搅拌洗涤3分钟，重复洗涤3次。量取15ml DCM加入反应釜，搅拌洗涤3分钟，重复洗涤3次。

步骤（2）去保护：加入V _Piperidine:V_DMF=20:80混合溶液，搅拌反应后抽去，再次加入上述混合溶液，搅拌反应后抽去，如此进行2次脱保护，然后用DMF洗涤后，去除Fmoc保护基。Fmoc-Leu-OH、

Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、

Fmoc-Gln(Trt)-OH、

步骤（3）偶联Fmoc-Pro-OH：将1.01g(3.0mmol)Fmoc-Pro-OH和0.41g(3.0mmol)HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0～10℃，加入465μl DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35℃下反应2小时，取少量树脂使用Kniser test检测为阴性，抽除液体，DMF洗涤3次完成肽树脂反应。

步骤（4）偶联：重复接肽反应步骤及去除Fmoc保护基的操作，按照卡贝缩宫素氨基酸序列，依次偶联：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、4-氯丁酸。

步骤（5）裂解：将上述肽树脂用15ml DCM溶液洗涤，抽去，再重复一次DCM洗涤；用15ml甲醇溶液洗涤，抽去，再重复一次甲醇洗涤;用15ml DCM溶液洗涤，抽去，再重复一次DCM洗涤；用15ml甲醇溶液洗涤，抽去，再重复一次甲醇洗涤。转出树脂，真空干燥。干燥所得的卡贝缩宫素环肽树脂，用V_TFA:V_Tis=95:5裂解液裂解2小时，过滤树脂得到滤液，浓缩裂解液至原体积的20～30%，使用6倍浓缩后裂解液体积的的乙醚（小于0℃）在小于0℃条件下沉降0.5小时，离心，弃上清液，固体用3倍体积的乙醚洗涤6次，所得固体室温15～35℃干燥1小时，油泵减压干燥4小时，碾磨成粉，然后环化。2小时后过滤除去树脂，滤液加入到乙醚中，沉降后离心，离心洗涤5次后，真空干燥制得8肽线性肽片段：0.84g。

步骤（6）环化：将0.84g的8肽线性肽片段加入到500ml纯净水和500ml的乙腈混合水溶液中，加入1ml DIEA，在40～45℃反应：18h。

步骤（7）纯化：使用醋酸调pH值至3.5～4.5，粗肽环化液在30±5oC、减压条件下旋蒸浓缩，浓缩至650ml以下，再加入纯化水稀释至1000ml。使用0.45μm的有机系滤膜减压过滤，待纯化。

制备条件设置如下：

色谱柱：色谱填料为Daisogel的C18填料，粒径为10μm，色谱柱尺寸5×25cm

检测波长：230nm

上样流速：50ml/min

洗脱流速：80ml/min

流动相A：0.3%HAc水溶液

流动相B：ACN

流动相配制：按V_HAc:V_纯化水=0.3:100配制0.3%HAc水溶液20L，即得流动相A：0.3%HAc水溶液。

冲柱：

按体积分数设置梯度，使用50%的ACN+50%水，冲洗10min；然后使用5%的ACN+95%水，冲洗15min。

平衡：

按体积分数设置梯度，使用95%流动相A+5%流动相B平衡15min。上样：

使用流动相A管道上样。

洗脱：

按体积分数设置梯度，使用0.3%HAc的水溶液(A相)和ACN(B相)梯度洗脱，洗脱梯度为:

步骤	时间	流动相B(%)
			1	0	5
2	2	5
			3	7	25
4	43	40

馏分收集：

待检测器信号出峰时（起始出峰时间在20-25min之间），分部收集主峰各馏分，纯度过低、浓度过稀(目的肽浓度低于0.1g/L的或主峰纯度低于10%的馏分)的可舍去，将其余含有目的肽的组分合并收集。

冻干：

将纯化峰顶在30±5℃、减压条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。将冻干盘放入冰箱冷冻室(-20℃)中，预冻6h。开启冻干机，打开制冷，预冷30min以上，设置冻干曲线如下：

第一段：在-27℃运行16h；第二段：在-5℃运行4h；第三段：在5℃运行2h；第四段：在30℃运行16h。

冻干后得到8肽环肽精肽片段：0.61g，纯度：95.55%。

（8）偶联：0.61g(0.62mmol)卡贝缩宫素8肽环肽片段、68.5mg(0.62mmol)H-Gly-NH_2.HCl和83.8mg(0.62mmol)HOBt、89.6μl(0.62mmol)三乙胺加入5ml DMF中搅拌溶解，冷却到0℃，将127.9mg(0.62mmoll)DCC加入上述溶液中，在0℃反应2小时，然后在25℃反应4小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，得到卡贝缩宫素粗肽：0.85g，纯度：57.73%。如图1。合成收率：54.32%。

上述方法得到的卡贝缩宫素粗品用以下方法进行纯化。

（1）样品处理：

将固相合成得到的1.70g卡贝缩宫素粗品溶解于1000ml纯净水中，使用醋酸调节pH为3.4。

（2）平衡

使用100%的流动相A冲洗交换柱10min；

（3）上样

使用流动相A管道上样，将样品溶液载入交换柱中；

（4）洗脱

流动相由100％A，60min内转换至100％B，分部收集35-45min洗脱馏分。冻干后得到1.63g，纯度：99.97%（图2）。纯化收率：74.41%。纯化的实验条件：

聚合物反相填料柱为(UniPS^TM10，10μm，50mm×250mm)；

流动相：A为0.3%醋酸水溶液;

流动相B为乙腈；

检测波长为220nm。

含量测定方法如下：

色谱柱：YMC-Pak ODS-AQ,(3μm)(150mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；流动相：流动相A：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.355g，磷酸氢二钠二水合物3.563g，加水溶解并定容至1000ml。）-乙腈（76:24）；流动相B：乙腈；

洗脱流速：1ml/min；

检测波长：220nm；柱温：40℃；

洗脱梯度：洗脱梯度的初始状态为20%B，在35分钟内将流动相B增至35%，然后再在1分钟内将流动相B减至20%，保持6分钟。

卡贝缩宫素的含量测定方法：

卡贝缩宫素的含量=卡贝缩宫素对照品含量×卡贝缩宫素精肽峰面积×卡贝缩宫素对照品浓度/(卡贝缩宫素对照品峰面积×卡贝缩宫素粗肽浓度)100%=92.25%×96.942×1.5/212.455×100%=63.14%

注：卡贝缩宫素对照品和卡贝缩宫素精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。

卡贝缩宫素对照品浓度：1.5mg/ml

卡贝缩宫素对照品峰面积：212.455mAU*min（图3）

卡贝缩宫素对照品含量：92.25%

卡贝缩宫素粗肽配置浓度：1.0mg/ml

卡贝缩宫素粗肽峰面积：96.942mAU*min

杂质D-Cys5-卡贝缩宫素的含量测定方法：

纯化前D-Cys5-卡贝缩宫素的含量=卡贝缩宫素对照品含量×[Gly⁹-OH]-卡贝缩宫素峰面积×卡贝缩宫素对照品浓度×校正因子/（托西班对照品峰面积×卡贝缩宫素粗肽浓度)×100%=92.25%×1.112×1.04×1.5/212.455×100%=0.75%

注：卡贝缩宫素对照品和卡贝缩宫素精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。校正因子D-Cys5-卡贝缩宫素的校正因子＝1.04。

卡贝缩宫素对照品浓度：1.5mg/ml

卡贝缩宫素对照品峰面积：212.455mAU*min（图3）

卡贝缩宫素对照品含量：92.25%

卡贝缩宫素粗肽配置浓度：1.0mg/ml

卡贝缩宫素粗肽峰面积：1.112mAU*min

纯化后D-Cys5-卡贝缩宫素的含量=卡贝缩宫素对照品含量×[Gly⁹-OH]-卡贝缩宫素峰面积×卡贝缩宫素对照品浓度×校正因子/（托西班对照品峰面积×卡贝缩宫素粗肽浓度)×100%=92.25%×0.109×1.04×1.5/212.455×100%=0.07%

卡贝缩宫素对照品浓度：1.5mg/ml

卡贝缩宫素对照品峰面积：212.455mAU*min（图3）

卡贝缩宫素对照品含量：92.25%

卡贝缩宫素粗肽配置浓度：1.0mg/ml

卡贝缩宫素粗肽峰面积：0.109mAU*min

纯化前和后的卡贝缩宫素HPLC杂质分析图谱详见图1和2。（图1为杂质[Gly⁹-OH]-卡贝缩宫素含量大于0.5%的HPLC杂质分析图谱，图2为杂质[Gly⁹-OH]-卡贝缩宫素含量小于0.1%的HPLC杂质分析图谱。）

Claims

1.一种纯化卡贝缩宫素的方法，该方法采用聚合物反相色谱法，可使成品卡贝缩宫素中的杂质D-Cys5-卡贝缩宫素含量降低到0.1%以下，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，样品处理：

将1.70g卡贝缩宫素粗肽溶解于1000ml 纯净水中，使用醋酸调节pH为3.4；

步骤2，平衡

按体积分数设置梯度，使用100%的流动相A冲洗聚合物反相填料柱10min；

步骤3，上样

将步骤1得到的样品溶液载入步骤2冲洗过的聚合物反相填料柱中；

步骤4，洗脱

按体积分数设置梯度，梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，分部收集洗脱馏分；

步骤5，冻干

将步骤4得到的洗脱馏分经过冻干得到纯品卡贝缩宫素；

其中，

聚合物反相填料柱为UniPS^TM10，10μm，50mm ×250 mm；

流动相：A为0.3%醋酸水溶液;

流动相B为乙腈；

梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，流速为：80 mL／min，

检测波长为220 nm。