CN103992391A

CN103992391A - 一种纯化特利加压素的方法

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Publication number: CN103992391A
Application number: CN201410051178.9A
Authority: CN
Inventors: 路杨; 杨东晖; 周俊; 周亮
Original assignee: HANGZHOU SINOPEP PHARMACEUTICAL Inc
Current assignee: HANGZHOU SINOPEP PHARMACEUTICAL Inc
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-02-14
Also published as: CN103992391B

Abstract

本发明涉及一种纯化特利加压素的方法，其特征包括以下步骤：步骤1，将特利加压素粗品用水溶解，调节pH到3-4；步骤2，使用含有表面活性剂的离子对流动相A冲洗C18反相填料柱；步骤3，将步骤1溶液载入C18反相填料中；步骤4，梯度程序为：洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持5min，然后60min内将流动相B比例增至30%，收集部分目的峰洗脱馏分；步骤5，纳滤膜脱盐后，经过冷冻干燥得到纯品特利加压素。

Description

一种纯化特利加压素的方法

技术领域

本发明涉及一种多肽类药物——特利加压素的纯化方法，是一种具有长效血管加压素类似物的纯化方法。

背景技术

特利加压素，英名为：Terlipressin，为一种环状多肽，结构式如下：

化学式如下：

。

特利加压素为人工合成的三甘氨酸-赖氨酸-加压素，是合成的血管加压素类似物，它是一种前体药物，本身无活性，在体内经氨基肽酶作用，脱去其N末端的3个甘氨酰残基后，缓慢“释放”出有活性的赖氨酸加压素，因此特利加压素相当于一个能以稳定速率释放出赖氨酸加压素的储藏库。特利加压素的主要作用是收缩内脏血管平滑肌，减少内脏血流量（如减少肠系膜、脾、子宫等的血流），从而减少门静脉血流、降低门静脉压，同时也可作用于食道和子宫等平滑肌，是一种安全有效的治疗急性静脉曲张出血的药物。

中国专利CN201110171151.X公开了一种特利加压素的制备方法，具体步骤为：先对特利加压素粗肽溶液进行反相色谱梯度洗脱纯化，然后采用阴离子交换法将三氟醋酸盐转成醋酸盐。该法总收率43%，纯度为99.60 %，且不能有效分离特利加压素与杂质[βAsp⁸]-特利加压素。

现有特利加压素的合成过程中，Asn水解会产生杂质[Asp⁸]-特利加压素，而[Asp⁸]-特利加压素可以通过形成琥珀酸亚胺的中间态进而生成杂质[βAsp⁸]-特利加压素，[βAsp⁸]-特利加压素为特利加压素已知杂质中离主峰最近、最大的杂质，其结构如下：

。

该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，该杂质的存在严重影响特利加压素的含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1 %以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成特利加压素本身收率降低。为此，本发明人重点研究如何去除杂质[βAsp⁸] 特利加压素而不影响特利加压素的收率问题。

本发明人用现有的纯化方法，对用固相合成法制备的特利加压素进行了纯化，发现杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量均无法达到预订目标0.1 %。为此，本发明人对特利加压素的纯化方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种高收率、高纯度以及低成本的特利加压素的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一种特利加压素的纯化方法，解决(1)特利加压素成品纯度不高，(2) 特利加压素成品收率不高，(3) 特利加压素与杂质[βAsp⁸]-特利加压素不能有效分离的问题。

本发明中一些常用的缩写及术语具有以下含义；

Fmoc ：芴甲氧羰基

Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸

tBu ：叔丁基

HoBt ：1-羟基苯骈三唑

DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺

Gly ：甘氨酸

Lys ：赖氨酸

Pro ：脯氨酸

Asn ：天门冬酰胺

Gln ：谷氨酰胺

Phe ：苯丙氨酸

Tyr ：酪氨酸

Cys ：半胱氨酸

Trt ：三苯甲基

Boc ：叔丁氧羰基

DMF ：N，N′-二甲基甲酰胺

Piperidine ：六氢吡啶

TFA ：三氟醋酸

MeOH ：甲醇

DCM ：二氯甲烷。

本发明的技术方案为：

使用含表面活性剂的反相色谱法可以使特利加压素与杂质[βAsp⁸]-特利加压素得到有效分离。

为此本发明提供一种特利加压素的纯化方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，将特利加压素粗品用水溶解，调节pH到3-4；

步骤2，使用含有表面活性剂的离子对流动相A冲洗C18反相填料柱；

步骤3，将步骤1溶液载入C18反相填料中；

步骤4，梯度程序为：洗脱梯度的初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %，收集部分目的峰洗脱馏分；

步骤5，纳滤膜脱盐后，经过冷冻干燥得到纯品特利加压素。

其中，C18反相填料柱为（10 μm，50 mm ×250 mm)；

流动相A：5 mmol/L磷酸二氢铵+25 mmol/L 表面活性剂（使用磷酸调pH：3-4）；

流动相B：乙腈；

梯度程序为: 初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %，收集部分目的峰洗脱馏分；流速为：80 mL/min；检测波长为220 nm。

优选的操作步骤如下：

步骤1，样品处理：

将1.00 g特利加压素粗肽溶解于100 mL纯净水中，使用磷酸调节pH为3.5±0.2；

步骤2，平衡：

使用95 %的流动相A冲洗C18反相填料柱5 min；其中，C18反相填料柱为（10 μm，50 mm ×250 mm)；流动相A：5 mmol/L 磷酸二氢铵+25 mmol/L 癸烷磺酸钠（使用磷酸调pH：3.5）；流动相B：乙腈；

步骤3，上样：

将样品溶液载入制备柱中；

步骤4，洗脱：

梯度程序为：初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %；流速为：80 mL/min；检测波长为220 nm；收集目的峰纯度大于99.80 %的洗脱馏分，中控检测：用C18 （5 um，150×3.0mm）色谱柱；以硫酸铵缓冲液（取硫酸铵1.32 g，加水2000 mL，加硫酸0.4 mL）－甲醇（1440：320）为流动相A，硫酸铵缓冲液－甲醇（550：240）为流动相B；流速为0.6m1/min；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；洗脱梯度的初始状态为15 ％流动相B，保持35 min，然后在20 min内将流动相B升至100 ％，保持5 min，然后在1 min内回到初始状态，保持19 min；

步骤5，脱盐：

将洗脱馏分经过纳滤膜脱盐，收集截留液；

步骤6，冻干：

将截留液经过冻干得到纯品特利加压素。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

采用中国专利CN201310214366.4的方法纯化粗品特利加压素，测定杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量如下：0.21 %；

采用中国专利CN201210248083.7的方法纯化粗品特利加压素，测定杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量如下：0.33 %；

采用中国专利CN201210214758.6的方法纯化粗品特利加压素，测定杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量如下：0.40 %；

采用中国专利CN201110171151.X的方法纯化粗品特利加压素，测定杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量如下：0.47 %；

采用本发明的方法纯化粗品特利加压素，测定杂质[βAsp8]-特利加压素的含量如下：0.03 %。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1、表面活性剂的选择：

己烷磺酸钠；庚烷磺酸钠；癸烷磺酸钠；十二烷基磺酸钠

2、梯度洗脱程序的选择：

①：；②：

3、缓冲盐的选择：

硫酸铵；磷酸二氢铵。

为此提出了16种实验条件：

实验条件1：（1）样品处理：将固相合成得到的10.00 g特利加压素粗品溶解于1000 mL纯净水中，使用磷酸调节pH为3.5±0.2；

（2）平衡：使用95 %的流动相A冲洗制备柱5 min，其中，C18反相填料柱为（10 μm，50 mm ×250 mm)；流动相A：5 mmol/L磷酸二氢铵+25 mmol/L己烷磺酸钠（使用磷酸调pH：3.5）；流动相B：乙腈；

（3）上样：将样品溶液载入制备柱中；

（4）洗脱：梯度程序为：梯度的初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %；流速为：80 mL/min；检测波长为220 nm；收集目的峰纯度大于99.80 %的洗脱馏分，中控检测：用C18 （5 um，150×3.0mm）色谱柱；以硫酸铵缓冲液（取硫酸铵1.32 g，加水2000 mL，加硫酸0.4 mL）－甲醇（1440：320）为流动相A，硫酸铵缓冲液－甲醇（550：240）为流动相B；流速为0.6m1/min；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；洗脱梯度的初始状态为15 ％流动相B，保持35 min，然后在20 min内将流动相B升至100 ％，保持5 min，然后在1 min内回到初始状态，保持19 min；

（5）脱盐：脱盐的实验条件：纳滤膜组件为：卷式；纳滤膜组件的材料为：醋酸纤维素；纳滤操作中的温度为：20-50 ℃；压力为：0.4 Mpa-1.0 Mpa；DK1812C-34D纳滤膜组件的截留分子量为300 Da；采用WTM-1812G实验室纳滤膜分离设备对上述洗脱馏分溶液进行纳滤脱盐，循环8小时，得到脱盐后溶液800 mL，冻干后得到特利加压素精肽。

实验条件2―16，实验操作如实验条件1所示，各实验条件及实验结果如下：

以上结果表明，实验条件7的纯化效果最优。

本发明的有益效果是：提供了一种高纯度、高收率以及低成本的特利加压素纯化方法。

附图说明

图1特利加压素粗肽HPLC谱图

图2 特利加压素粗肽制备谱图

图3特利加压素精肽HPLC谱图

图4特利加压素对照品HPLC谱图

图5特利加压素精肽质谱图。

具体实施方式

实施例1：

特利加压素的固相合成：规模为10 mmol的特利加压素合成

（1）肽树脂去保护：将13.89 g 的Rink amide AM 树脂（取代度为0.72 mmol/g）加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30 min后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5 min，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10 min，DMF洗涤6次。

（2）偶联：将8.92 g Fmoc-Gly-OH（30 mmol）和4.05 g HOBt（30 mmol）用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0-10 ℃，加入5 mL DIC（30 mmol），激活5min后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35 ℃下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。

（3）去保护：采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5 min，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10 min，DMF洗涤6次，去除Fmoc保护基。

（4）偶联：重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照特利加压素主链肽序，依次完成：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH 、Fmoc-Phe-OH 、Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、Fmoc-Cys(Trt)-OH 、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH。

（5）氧化：将7.62g碘（30 mmol）加入200 mL的DCM溶解，加入上述肽树脂中，搅拌反应4小时后抽去，DMF洗涤6次。

（6）去保护：采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5 min，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10 min，DMF洗涤6次。

（7）收样：偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到32.60 g 特利加压素-Rink amide AM树脂。

（8）裂解：将上述32.60 g特利加压素-Rink amide AM树脂加入到500 mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚=90:5:5的体积比配置裂解液330 mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到特利加压素粗肽12.30 g，HPLC纯度88.20 %（图 1），合成收率85 %。

上述方法得到的特利加压素粗品用以下方法进行纯化：

（1）样品处理：

将固相合成得到的12.30 g特利加压素粗品溶解于1230 mL纯净水中，使用磷酸调节pH为3.5±0.2。

（2）平衡

使用95 %的流动相A冲洗制备柱5 min；其中，C18反相填料柱为（10 μm，50 mm ×250 mm)；流动相A：5 mmol/L 磷酸二氢铵+25 mmol/L 癸烷磺酸钠（使用磷酸调pH：3.5）；流动相B：乙腈。

（3）上样

将样品溶液载入制备柱中。

（4）洗脱

梯度程序为：梯度的初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %；流速为：80 mL／min；检测波长为220 nm；收集目的峰纯度大于99.80 %的洗脱馏分，中控检测：用C18 （5 um，150×3.0mm）色谱柱；以硫酸铵缓冲液（取硫酸铵1.32 g，加水2000 mL，加硫酸0.4 mL）－甲醇（1440：320）为流动相A，硫酸铵缓冲液－甲醇（550：240）为流动相B；流速为0.6m1/min；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；洗脱梯度的初始状态为15 ％流动相B，保持35 min，然后在20 min内将流动相B升至100 ％，保持5 min，然后在1 min内回到初始状态，保持19 min。

（5）脱盐

脱盐的实验条件：纳滤膜组件为：卷式；纳滤膜组件的材料为：醋酸纤维素；纳滤操作中的温度为：20-50 ℃；压力为：0.4 Mpa -1.0 Mpa；

DK1812C-34D纳滤膜组件的截留分子量为300 Da；采用WTM-1812G实验室纳滤膜分离设备对上述洗脱馏分溶液进行纳滤脱盐，循环8小时，得到脱盐后溶液1000 mL，冻干后得到6.26 g，纯度：99.82 %（图3），总收率：51 %。

（6）杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量测定

取上述特利加压素精肽，使用高效液相色谱检测杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量。

杂质[βAsp⁸]-特利加压素的含量计算公式如下：

[βAsp⁸]-特利加压素的含量=特利加压素对照品含量×[βAsp⁸]-特利加压素峰面积×校正因子/特利加压素对照品峰面积×100 %=92.25 %×0.416×1.00/1489.574×100 %=0.03 %。

注：特利加压素对照品和特利加压素精肽的检测条件和进样量一致，都为：25 μl。校正因子[βAsp⁸]-特利加压素的校正因子＝1.00；

特利加压素对照品浓度：1.0 mg/mL；

特利加压素对照品峰面积：1489.574 mAU*min （图4）；

特利加压素对照品含量：92.25 %；

特利加压素精肽配置浓度：1.0 mg/mL ；

[βAsp⁸]-特利加压素峰面积：0.416 mAU*min。

Claims

1.一种纯化特利加压素的方法，该方法使用C18反相填料，流动相采用含有表面活性剂的离子对试剂，可使成品特利加压素中的杂质[βAsp⁸]-特利加压素含量降低到0.1 %以下，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，将特利加压素粗品用水溶解，调节pH到3-4；

步骤3，将步骤1溶液载入C18反相填料中；

步骤5，纳滤膜脱盐后，经过冷冻干燥得到纯品特利加压素；

其中，C18反相填料柱为（10 μm，50 mm ×250 mm)；

流动相B：乙腈；

梯度程序为：初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %，收集部分目的峰洗脱馏分；流速为：80 mL/min；检测波长为220 nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步骤：

步骤1，样品处理：

将1.00 g特利加压素粗肽溶解于50-100 mL纯净水中，使用磷酸调节pH为3.5±0.2；

步骤2，平衡

使用含有表面活性剂的离子对流动相A冲洗C18反相填料柱5 min；

步骤3，上样

将样品溶液载入制备柱中；

步骤4，洗脱

梯度程序为：梯度的初始状态流动相B为5 %，保持5 min，然后60 min内将流动相B比例增至30 %；流速为：80 mL/min；检测波长为220 nm；收集目的峰纯度大于99.80 %的洗脱馏分，中控检测：用C18 （5 um，150×3.0mm）色谱柱；以硫酸铵缓冲液（取硫酸铵1.32 g，加水2000 mL，加硫酸0.4 mL）－甲醇（1440：320）为流动相A，硫酸铵缓冲液－甲醇（550：240）为流动相B；流速为0.6m1/min；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；洗脱梯度的初始状态为15 ％流动相B，保持35 min，然后在20 min内将流动相B升至100 ％，保持5 min，然后在1 min内回到初始状态，保持19 min；

步骤5，脱盐

将洗脱馏分经过纳滤膜脱盐，收集截留液；

步骤6，冻干

将截留液经过冻干得到纯品特利加压素。

3.如权利要求1所述的表面活性剂，其特性在于该表面活性剂为：己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠的中的一种，优选癸烷磺酸钠。