CN105131079B

CN105131079B - 一种醋酸去氨加压素的纯化方法

Info

Publication number: CN105131079B
Application number: CN201510440924.8A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 王仁友; 石鑫磊; 李同金; 刘娟
Original assignee: JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-07-25
Filing date: 2015-07-25
Publication date: 2018-09-14
Anticipated expiration: 2035-07-25
Also published as: CN105131079A

Abstract

本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种醋酸去氨加压素的纯化方法。本发明提供了一种使用反相高效制备液相色谱纯化醋酸去氨加压素的方法，该方法使用硫酸铵/水溶液‑乙腈和醋酸/水‑乙腈两种流动相体系，通过反相纯化和转盐获得纯度达99.5%以上的醋酸去氨加压素，并且使所含的[5‑Asp]‑去氨加压素、[4‑Glu]‑去氨加压素、[8‑L‑Arg]‑去氨加压素、[9‑Gly]‑去氨加压素四种杂质的含量均在0.1%以下。本发明提供的醋酸去氨加压素纯化方法操作简单易行，所用试剂和溶剂简单易得，纯化成本低；获得的醋酸去氨加压素纯化收率高、纯度高，符合产业化要求。

Description

一种醋酸去氨加压素的纯化方法

技术领域

本发明涉及多肽合成中的纯化方法领域，特别涉及一种醋酸去氨加压素的纯化方法。

背景技术

醋酸去氨加压素（desmopressin，1-去氨基-8-D-精氨酸，DDAVP）是合成的天然精氨酸加压素的结构类似物，通过对1位半胱氨酸Cys脱氨及8位采用D-Arg置换L-Arg后衍生得到的。该药在血液中稳定性增加，半衰期延长，较血管加压素和赖氨加压素具有更强和更持久的抗利尿活性，且加压的副作用比精加压素降低400-800倍，同样也可激活血液因子Ⅷ和纤溶酶原活性，该药适用于中枢性尿崩症、多尿、多饮、夜间遗尿症、血友病A、冯·威利布兰德病以及控制出血和手术前预防出血等，其药效更强，副作用小，是一种极具市场前景的药物，肽链结构式如下：

醋酸去氨加压素的合成方法主要有固相合成法和液相合成法，目前固相合成方法应用广泛，具体方法为：氨基酸在固相载体上逐一偶联获得线性肽，然后通过用适当的氧化剂氧化获得去氨加压素粗肽，这种方法克服了液相合成方法耗时、操作繁杂、收率低、不易产业化的缺点，但是在固相合成的方法中粗肽纯化成为影响产品最终质量的关键环节，如何在保证产品收率前提下，获得优质标准级别的产品（所有杂质含量均在0.1%以下）用于药物生产，是每个药物生产企业期待的目标。

目前关于醋酸去氨加压素的文献报道主要集中在其合成方法和制剂加工上，对于纯化的方法，目前的专利文献有CN201310399955.4一种醋酸去氨加压素的纯化方法，该文献中公开了采用聚合物反相填料柱（Unips^TM10-100,50mm*250mm）,以0.3%的醋酸/水为A相，乙腈为B相，按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将B相比例增至25%，然后在30分钟内将B相比例增至40%，分部收集洗脱馏分，经过干燥获得纯品的方法，但其中只控制了杂质des-Gln⁴-去氨加压素含量达到0.1%以下，在合成过程中的其它杂质未见报道。

CN101372504B一种纯化去氨加压素的方法公开了采用两步纯化和一步转盐三步获得醋酸去氨加压素的方法。第一步纯化采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸二氢钾和氢氧化钠配成的缓冲液（pH=5.0-7.0）为A相，纯乙腈为B相，梯度洗脱纯化。第二步纯化以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1-10%的冰醋酸水溶液为A相，纯乙腈为B相，梯度洗脱纯化；转盐采用阴离子树脂将磷酸盐、三氟醋酸盐转化成醋酸盐。该方法路线长，而且离子树脂会吸附大量产物，致使成品收率较低,该专利虽报道了成品的纯度在99%以上，但对具体的杂质含量并未做出说明。

专利CN201210551550.3公开了为了获得高纯度醋酸去氨加压素精肽，先对合成过程中的中间体线性粗肽以0.1%的TFA/水为A相，0.05%～2%（V/V）TFA/乙腈为B相进行初步纯化后再进行氧化反应获得醋酸去氨加压素粗品；后续又采用0.1～0.4%（V/V）磷酸三乙胺水溶液为A相（PH=3.0～6.8），乙腈为B相进行纯化；并以0.1%-0.5%（V/V）的醋酸铵水溶液为A1相（PH=5.0～6.5），以0.05～0.2%（V/V）的醋酸/水为A2相，乙腈为B相，对上述溶液进行转盐获得醋酸去氨加压素精肽。该方法为获得高纯度的精肽，从中间体到产品共经过3次纯化和1次转盐，不仅增加了纯化的成本，而且经纯化后线性肽溶液由于体积变大，再进行氧化时导致获得的产品浓度低；本专利实施例中公开了经该方法获得的醋酸去氨加压素精肽纯度为99.5～99.85%，且其中仍含有含量大于0.1%的杂质。

在现有醋酸去氨加压素的合成过程中会产生脱酰胺、消旋、缺失肽等多种杂质，根据欧洲药典EP7.0报道的已知杂质中[5-Asp]-去氨加压素、[4-Glu]-去氨加压素、[8-L-Arg]-去氨加压素、[9-Gly]-去氨加压素的结构和性质与产品相近且不易纯化，而目前醋酸去氨加压素纯化方法研究中还无法达到精肽产品所含上述杂质含量均小于0.1%的目标。为此，本发明主要研究了，如何在保证收率前提下，使精肽产品的纯度大于99.5%，并使所含[5-Asp]-去氨加压素、[4-Glu]-去氨加压素、[8-L-Arg]-去氨加压素、[9-Gly]-去氨加压素四种杂质的含量均小于0.1%。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用反相高效制备液相色谱纯化醋酸去氨加压素的方法，该方法通过在硫酸铵/水溶液-乙腈和醋酸/水-乙腈两种流动相体系中经纯化、转盐获得优质醋酸去氨加压素。本发明具体要求为：提供一种醋酸去氨加压素的纯化方法，在保证产品收率的前提下，使其纯度大于99.5%，并且使杂质[5-Asp]-去氨加压素、[4-Glu]-去氨加压素、[8-L-Arg]-去氨加压素、[9-Gly]-去氨加压素的含量均小于0.1%。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将醋酸去氨加压素粗品用乙腈/水溶液进行溶解，然后用0.45μm滤膜过滤获得粗品溶液。

步骤2：以50mmol/L的硫酸铵水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，在C18反相填料柱上进行梯度洗脱。

步骤3：以醋酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，在C18反相填料柱上进行梯度洗脱。

作为优选，步骤1中醋酸去氨加压素粗品溶于体积比浓度为3%～10%的乙腈水溶液中。

作为优选，骤1中醋酸去氨加压素粗品溶解后溶液的浓度为5～15mg/ml。

作为优选，步骤2中流动相A硫酸铵溶液用酸调节pH值为1.8～2.0。

进一步优选的，步骤2中流动相A硫酸铵水溶液调节pH值用酸为硫酸、醋酸、磷酸一种或几种。

作为优选，步骤2中梯度洗脱过程为：将色谱柱先用5%的B相平衡后上样，进样后先用15%B相等度洗脱，再用15%～18%B相梯度洗脱，分段收集目的峰。

作为优选，步骤3中流动相A中醋酸的浓度为0.2%～0.5%（V/V）。

进一步优选的，步骤3中流动相A中醋酸的浓度为0.25%～0.4%（V/V）。

作为优选，步骤3中梯度洗脱过程为：将色谱柱用5%B相平衡后上样，先用5%～18%B相梯度洗脱，再用18%～24%B梯度洗脱，分段收集目的峰。

作为优选，纯化所用C18反相填料色谱柱规格（柱子直径*长度）为5cm*25cm、10cm*25cm或15cm*25cm。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的醋酸去氨加压素纯化方法，通过两步使用反相高效制备液相色谱实现了对醋酸去氨加压素的纯化与转盐，该方法操作简单易行；

2、获得的醋酸去氨加压素纯度高，产品中杂质[5-Asp]-去氨加压素、[4-Glu]-去氨加压素、[8-L-Arg]-去氨加压素、[9-Gly]-去氨加压素的含量均降至0.1%以下，产品可达到优质药用级别。

3、与现有技术相比，本发明工艺操作简单，所用试剂、原料价格低廉易得，纯化成本低，产品纯度高，利于工业大规模生产。

附图说明

图1示实施例1中醋酸去氨加压素粗品经乙腈水溶解后HPLC谱图

图2示实施例1中醋酸去氨加压素粗品经反相纯化后HPLC谱图

图3示实施例1中醋酸去氨加压素粗品经反相转盐后HPLC谱图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施范围内；所有类似的替换和改动如改变溶剂浓度、流动相比例及洗脱梯度等，均在本发明的保护范围内。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即可得到本发明各较佳实例。

实施例1：

样品处理：将醋酸去氨加压素的粗品固体碾碎，用5%的乙腈水溶液按照5mg/ml的浓度溶解粗肽，溶解完全后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。说明书附图1为样品溶于乙腈的HPLC谱图，此时样品纯度为87.7075%，样品中含有多种杂质。

纯化条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：5cm*25cm；流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，硫酸调节pH值为1.81；B相为乙腈，流速为50ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡10分钟后上样，上样量为300ml（1.5g）。进样后先用15%B等度洗脱5分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱40分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。说明书附图2为经反相纯化后HPLC谱图，经纯化后的样品纯度为99.855%，且只含有两种杂质。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱，柱子直径和长度为：5cm*25cm。流动相A为0.25%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为50ml/min，检测波长220nm。

转盐过程：将色谱柱用5%B平衡后将上述浓缩液压入制备柱中，上样后将B相浓度从5%提高到18%梯度洗脱5分钟，然后将B相浓度从18%提高到24%B梯度洗脱30分钟，分段收集目的峰。

将纯度大于99.5%，杂质小于0.1%的馏分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到说明书附图3中纯度99.9749%的醋酸去氨加压素1.22g，所含杂质 [9-Gly]-OH含量 0.0251%，纯化收率81.3%。

实施例2：

样品处理：将醋酸去氨加压素的粗品固体碾碎，用3%的乙腈水溶液按照10mg/ml的浓度溶解粗肽，溶解完全后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。

纯化条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：10cm*25cm。流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，硫酸调节pH值为1.88；流动相B为乙腈。流速为300ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡15分钟后上样，上样量为600ml（6g）。进样后先用15%B等度洗脱7分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱50分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱，柱子直径和长度为：10cm*25cm。流动相A为0.2%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为300ml/min，检测波长220nm。

将纯度大于99.5%，杂质小于0.1%的分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度为99.8993%的醋酸去氨加压素5.2g，所含杂质[8-L-Arg]-去氨加压素0.0507%、[5-Asp]-去氨加压素0.0500%（均小于0.1%），收率86.7%。

实施例3：

样品处理：将醋酸去氨加压素的粗品固体碾碎，用10%的乙腈水溶液按照15mg/ml的浓度溶解粗肽，溶解完全后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。

纯化条件：色谱条件：色谱柱：以C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：15cm*25cm。流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，磷酸调节pH值为1.85； B相为乙腈。流速为500ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡8分钟后上样，上样量为1400ml（21g）。进样后先用15%B等度洗脱10分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱55分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：以C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：15cm*25cm。流动相A为0.3%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为500ml/min，检测波长220nm。

转盐过程：将色谱柱用5%B平衡后将上述浓缩液压入制备柱中，上样后将B相浓度从5%提高到18%梯度洗脱10分钟，然后将B相浓度从18%提高到24%B梯度洗脱35分钟，分段收集目的峰。

将纯度大于99.5%，杂质小于0.1%的馏分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度为99.932%的醋酸去氨加压素17.7g，所含杂质 [4-Glu]-去氨加压素0.030%、[5-Asp]-去氨加压素0.038%（均小于0.1%），收率84.3%。

实施例4：

纯化条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：5cm*25cm。流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，磷酸调节pH值为1.92； B相为乙腈。流速为50ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡10分钟后上样，上样量为100ml（1.5g）。进样后先用15%B等度洗脱10分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱60分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：5cm*25cm。流动相A为0.4%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为50ml/min，检测波长220nm。

转盐过程：将色谱柱用5%B平衡后将上述浓缩液压入制备柱中，上样后将B相浓度从5%提高到18%梯度洗脱10分钟，然后将B相浓度从18%提高到24%B梯度洗脱40分钟，分段收集目的峰。

将纯度大于99.5%，杂质含量小于0.1%的馏分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度为99.7442%的醋酸去氨加压素1.2g，所含杂质[4-Glu]-去氨加压素0.0878%、[5-Asp]-去氨加压素0.0632%、[8-L-Arg]-去氨加压素0.0724%、[9-Gly]-去氨加压素0.0324%（均小于0.1%），收率80%。

实施例5：

样品处理：将醋酸去氨加压素的粗品固体碾碎，用7%的乙腈水溶液按照10mg/ml的浓度溶解粗肽，溶解完全后用滤膜过滤，收集滤液备用。

纯化条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：10cm*25cm。流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，醋酸调节pH值为2.0；流动相B为乙腈。流速为300ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡5分钟后上样，上样量为600ml（6g）。进样后先用15%B等度洗脱10分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱70分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱；柱子直径和长度为：10cm*25cm。流动相A为0.25%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为300ml/min，检测波长220nm。

转盐过程：将色谱柱用5%B平衡后将上述浓缩液压入制备柱中，上样后将B相浓度从5%提高到18%梯度洗脱10分钟，然后将B相浓度从18%提高到24%B梯度洗脱50分钟，分段收集目的峰。

将纯度大于99.5%，杂质含量小于0.1%的馏分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度为99.9351%的醋酸去氨加压素5.1g，杂质[4-Glu]-去氨加压素0.0387%、[5-Asp]-去氨加压素0.0262%（含量均小于0.1%），收率85%。

实施例6：

样品处理：将醋酸去氨加压素的粗品固体碾碎，用7%的乙腈水溶液按照10mg/的浓度溶解粗肽，溶解完全后用滤膜过滤，收集滤液备用。

纯化条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱，柱子直径和长度为：15cm*25cm。流动相：A相为50mmol硫酸铵水溶液，醋酸调节pH值为2.3， B相为乙腈。流速为500ml/min，检测波长为220nm。

纯化过程：将色谱柱用5%B平衡5分钟后上样，上样量为2000ml（20g）。进样后先用15%B等度洗脱8分钟后，再将B相浓度从15%逐渐提高到18%梯度洗脱65分钟，分段收集目的峰。将纯度大于99%，所含杂质小于0.2%的馏分合并，在水温30℃的条件下进行减压旋蒸浓缩，除去乙腈后备用。

转盐条件：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱，柱子直径和长度为：15cm*25cm。流动相A为0.25%醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为500ml/min，检测波长220nm。

转盐过程：将色谱柱用5%B平衡后将上述浓缩液压入制备柱中，上样后将B相浓度从5%提高到18%梯度洗脱9分钟，然后将B相浓度从18%提高到24%B梯度洗脱70分钟，分段收集目的峰。

将纯度大于99.5%，杂质含量小于0.1%的馏分合并后，在30℃的水温条件下进行旋蒸浓缩至约50mg/ml后转移入西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度为99.9621%的醋酸去氨加压素17.3g，所含杂质[5-Asp]-去氨加压素0.0379%（含量小于0.1%），收率86.5%。

Claims

1.一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：样品处理：将醋酸去氨加压素粗品用乙腈/水溶液溶解，然后用0.45μm滤膜过滤获得粗品溶液；

步骤2：纯化：以50mmol/L的硫酸铵水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，在C18反相填料柱上进行梯度洗脱；

步骤3：转盐：以醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，在C18反相填料柱上进行梯度洗脱；

所述步骤2中流动相A硫酸铵溶液pH值为1.8～2.0；

所述步骤3中A相醋酸浓度为0.2％～0.5％(V/V)。

2.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，步骤1中醋酸去氨加压素粗品溶于体积百分比为3％～10％的乙腈水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，步骤1中粗品溶液浓度为5～15mg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，步骤2中流动相A硫酸铵溶液调节pH值用酸为硫酸、醋酸、磷酸中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，步骤2中梯度洗脱过程为：将色谱柱用5％B相平衡后上样，进样后先用15％B相等度洗脱，再用15％～18％B梯度洗脱，分段收集目的峰。

6.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，步骤3中梯度洗脱过程为：将色谱柱用5％B相平衡后，将步骤2中纯化浓缩后的样品压入色谱柱中，进样后先用5％～18％B相梯度洗脱，再用18％～24％B相梯度洗脱，分段收集目的峰。

7.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化方法，其特征在于，纯化所用C18反相填料色谱柱规格(柱子直径*长度)为5cm*25cm、10cm*25cm、15cm*25cm中的一种。