CN114907449A - 一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽合成中的纯化方法领域，提供一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，解决现有纯化技术分离得到醋酸去氨加压素纯度低的问题，包括以下步骤：（1）一次纯化：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液（V/V，1:1000）为流动相A、纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；（2）转盐；（3）二次纯化：以冰醋酸水溶液（V/V，1:1000）为流动相A，纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，合并洗脱流份减压浓缩后干燥，即得高纯度的醋酸去氨加压素。

Description

一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法
技术领域
本发明涉及多肽合成中的纯化方法领域，尤其涉及一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法。
背景技术
醋酸去氨加压素(Desmopressin Acetate)是合成的天然精氨酸加压素的结构类似物，通过对1位半胱氨酸Cys脱氨及8位采用D-Arg置换L-Arg后衍生得到的。醋酸去氨加压素具有良好止血效果且不会产生深静脉血栓的特点，主要用来治疗血友病、尿崩症及治疗性控制出血和手术前预防出血。
醋酸去氨加压素结构如下：
Figure BDA0003704936630000011
醋酸去氨加压素的合成方法主要有固相合成法和液相合成法，目前固相合成方法应用广泛，具体方法为：氨基酸在固相载体上逐一偶联获得线性肽，然后通过用适当的氧化剂氧化获得去氨加压素粗肽，这种方法克服了液相合成方法耗时、操作繁杂、收率低、不易产业化的缺点，但是在固相合成的方法中粗肽纯化成为影响产品最终质量的关键环节，如何在保证产品收率前提下，获得优质标准级别的产品(所有杂质含量均在0.1％以下)用于药物生产，是每个药物生产企业期待的目标。
关于醋酸去氨加压素的纯化方法已有一些专利文献做了报道，比如专利公开号CN101372504A公开了一种纯化去氨加压素的方法，两步纯化后进行转盐处理，获得醋酸去氨加压素。第一步纯化采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲液为A相，纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。第二步纯化以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以冰醋酸水溶液为A相，纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化；转盐处理采用阴离子树脂将磷酸盐、三氟醋酸盐转化成醋酸盐。离子交换树脂对肽类物质具有较强的吸附性能，会吸附大量产物，为充分洗脱需要大量洗脱剂；且离子交换树脂使用后需要再生，如工艺控制不当导致转盐效能降低存在无法完全转盐风险。
比如专利公开号CN103102395A公开了一种醋酸去氨加压素的制备方法，首先采用固相合成法合成线性去氨加压素肽树脂，裂解得到线性去氨加压素粗肽；然后通过反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽后再进行液相氧化，最后转盐得到醋酸去氨加压素。虽然该方法氧化后得到色谱纯度较高但增加了纯化风险，氧化剂以及其它杂质等经过转盐处理难以完全去除，转盐时的流动相A为磷酸三乙胺水溶液，成品中可能含有杂质磷酸去氨加压素。
发明内容
因此，针对以上指出的缺陷，本发明提供一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，操作简单，产品纯度高。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，包括以下步骤：
(1)一次纯化：将醋酸去氨加压素溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A、纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并收集洗脱流份；
(2)转盐：洗脱流份减压浓缩后以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈/乙酸铵水溶液(V/V，5:95)冲洗柱子5～6个柱体积，然后用乙腈/纯化水(V/V，5:95)冲洗柱子5～6个柱体积，完成转盐；
(3)二次纯化：以冰醋酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A，纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并分段收集洗脱流份，合并洗脱流份减压浓缩后干燥，即得纯度大于99.0％的醋酸去氨加压素。
进一步的改进是：所述乙酸铵水溶液的浓度为50mmol/L。
进一步的改进是：步骤(1)中所述醋酸去氨加压素溶液浓度为15～30mg/ml。
进一步的改进是：步骤(1)中所述醋酸去氨加压素上样量占填料重量的0.5～0.8％。
进一步的改进是：步骤(1)洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
2 95 5
7 84 16
20 80 20
35 77 23
38 77 23
75 70 30
运行时间为75min。
进一步的改进是：步骤(2)中醋酸去氨加压素上样量占填料重量的0.3～0.5％。
进一步的改进是：步骤(3)洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
20 95 5
25 85 15
38 80 20
70 70 30
75 70 30
运行时间为75min。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明工艺操作简单，所用试剂、原料价格低廉易得，利于工业大规模生产，并且制得的醋酸去氨加压素产品纯度高(＞99.0％)，单个杂质小于0.1％，达到优质药用级别。醋酸去氨加压素粗品经历两次纯化处理，且二次纯化的流动相中仅含有醋酸，不引入其他试剂，确保了产品的纯度以及安全性。二次纯化洗脱前使用醋酸铵溶液进行转盐，转盐效果彻底，并且提高了生产效率，降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明实施例中醋酸去氨加压素一次纯化后的HPLC谱图；
图2是本发明实施例中醋酸去氨加压素二次纯化后的HPLC谱图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
实施例
一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，包括以下步骤：
(1)一次纯化：将醋酸去氨加压素溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A、纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并收集洗脱流份；
色谱条件：C18色谱柱，柱子直径为50mm；纯化水用0.45μm尼龙膜(水系)过滤，然后按体积比1:1000配制三氟乙酸水溶液作为流动相A，纯乙腈用0.45μm尼龙膜(有机系)过滤后作为流动相B；检测波长210nm，流速50mL/min；
系统平衡：按流动相A/流动相B(V/V，95:5)平衡色谱柱15min；
醋酸去氨加压素溶液浓度为15mg/ml，醋酸去氨加压素上样量为填料重量的0.6％。
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
2 95 5
7 84 16
20 80 20
35 77 23
38 77 23
75 70 30
将面积归一化纯度不低于90.0％，且[des-Asn5]去氨加压素不高于0.10％、[Gly9'-Gly9]去氨加压素不高于0.10％、Dimer-[1.6',6.1']去氨加压素不高于0.10％、其他单杂不高于5.0％的洗脱流份合并。在35℃下减压浓缩，真空度≤-0.075Mpa，浓缩至原体积。如图1所示，经过一次纯化后醋酸去氨加压素样品的纯度为98.76％，样品中还含有多种杂质。
(2)转盐：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈/乙酸铵水溶液(V/V，5:95)冲洗柱子5个柱体积，然后用乙腈/纯化水(V/V，5:95)冲洗柱子5个柱体积，完成转盐。其中，乙酸铵水溶液的浓度为50mmol/L。
色谱条件：C18色谱柱，柱子直径为50mm，检测波长210nm，流速50mL/min。
系统平衡：按浓度为0.1％的醋酸水溶液/纯乙腈(V/V，95:5)平衡色谱柱15min。
醋酸去氨加压素上样量占填料重量的0.4％。
(3)二次纯化：以冰醋酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A，纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并分段收集洗脱流份，合并洗脱流份减压浓缩后后干燥，即得纯度大于99.0％的醋酸去氨加压素。
洗脱梯度为
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
20 95 5
25 85 15
38 80 20
70 70 30
75 70 30
将面积归一化纯度大于99.0％且单杂小于0.1％的样品合并，合并流份下减压浓缩后冻干即得醋酸去氨加压素纯品。如图2所示，经过二次纯化后醋酸去氨加压素样品的纯度达到99.98％，且只含有两种杂质，杂质的含量仅为0.01％。
以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

Claims (7)

1.一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)一次纯化：将醋酸去氨加压素溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A、纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并收集洗脱流份；
(2)转盐：洗脱流份减压浓缩后以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈/乙酸铵水溶液(V/V，5:95)冲洗柱子5～6个柱体积，然后用乙腈/纯化水(V/V，5:95)冲洗柱子5～6个柱体积，完成转盐；
(3)二次纯化：以冰醋酸水溶液(V/V，1:1000)为流动相A，纯乙腈为流动相B，进行梯度洗脱纯化并分段收集洗脱流份，合并洗脱流份减压浓缩后干燥，即得纯度大于99.0％的醋酸去氨加压素。
2.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：所述乙酸铵水溶液的浓度为50mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：步骤(1)中所述醋酸去氨加压素溶液浓度为15～30mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：步骤(1)中所述醋酸去氨加压素上样量占填料重量的0.5～0.8％。
5.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：步骤(1)洗脱梯度为：
Figure FDA0003704936620000011
Figure FDA0003704936620000021
运行时间为75min。
6.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：步骤(2)中醋酸去氨加压素上样量占填料重量的0.3～0.5％。
7.根据权利要求1所述的一种醋酸去氨加压素的纯化精制方法，其特征在于：步骤(3)洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 95 5 20 95 5 25 85 15 38 80 20 70 70 30 75 70 30
运行时间为75min。
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