CN111363024A - 多肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽纯化领域,特别涉及多肽的纯化方法。本发明提供了一种多肽纯化方法,区别于传统纯化方法,可以弥补传统纯化多次回收成本增加,周期较长,废液排放量大缺点,大大提高收率,并且易于放大生产。通过本发明对比工艺可以出,有机溶剂主要用于脱盐部分,甚至有的项目工艺全程均不采用有机相,所以通过对比数据看出,有机溶剂使用量减少约80%以上。该方法可以提高产品的纯度,纯度大于99%,单杂小于0.15%,特别是降低有机溶剂的使用量,大大降低成本和环保压力。
Description
技术领域
本发明涉及多肽纯化领域,特别涉及多肽的纯化方法。
背景技术
利拉鲁肽,英文名liraglutide,其肽序为:
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gl y-Arg-Gly-OH。
利拉鲁肽(liraglutide)由丹麦制药企业诺和诺德公司研制,是生物合成的人肠促胰素G LP-1(胰高血糖素样肽1)类似物。利拉鲁肽是GLP-1受体激动剂,在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与人GLP-1相似。GLP-1主要是膜岛细胞和肠道(主要是远端小肠和结肠)的L细胞分泌的膜高血糖素的衍生物,由30个氨基酸组成的多肽。GLP-1(7-36)是由前胰高血糖素原经过加工修饰的含30个氨基酸的多肽。利拉鲁肽系在GLP-1的第34位将赖氨酸替换为精氨酸,并在第26位增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链,与天然GLP-1有97%同源,半衰期约12~14h,每天1次皮下给药就能起到良好的降糖作用。利拉鲁肽与人体天然GLP-1高度同源.同源性高达97%,保留了GLP-1的全部生物活性;非同源性仅3%,显著减少不良反应;庞大的脂肪酸侧链,使利拉鲁肽具有与GLP-1完全不一样的体内过程。
据IDF预测,2040年全球糖尿病患者将增长至6.42亿,较2015年增加2.27亿,我国患者数量将上升至1.54亿。糖尿病患者的不断增长,拉动糖尿病药物市场,预计未来几年全球糖尿病药物市场规模仍将保持高增长态势,预计到2022年全球糖尿病药物市场规模将增长至1205.6亿美元。
对于多肽的纯化主要是通过反相色谱纯化,采用的固定相相一般包括C18,C8,C4,C1等等,个别多肽项目采用聚合物填料进行纯化甚至其它反相填料,但无论采用何种类型的填料,都需要大量的有机介质进行洗脱,进而造成大量的污水废液,特别是大量有机溶剂废液,既难处理又非常危险。多肽的现有纯化方式决定了多肽规模放大后,周期较长,有机溶剂使用量大,废液排放多,最终产品的成本变高,质量风险和有机溶剂危险系数也变大。
目前利拉鲁肽纯化,主要是采用高效液相制备系统制备,采用乙腈、氨水和盐酸作为流动相,使用量较大,产生大量的有机废水溶液,毒性较大,废水较多,因含有盐酸等物质,回收难度较大。有的采用聚合物填料,同样需要用到三氟乙酸、乙腈、醋酸做为流动相,同样需要产生大量的有机非水溶液,后处理难度大。废液回收难处理,危险性也较大,随着肽序的延长,废液排放量将会更庞大,纯化周期也相应变长,企业成本也较大。环保、安全和成本问题已经制约着制药企业的发展,急需要一种降低企业成本和废液排放量的纯化方法,最大限度的降低有机废液储存中的危险性。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种多肽的纯化方法。可以提高产品的纯度,纯度大于99%,单杂小于0.15%,特别是降低有机溶剂的使用量,大大降低成本和环保压力。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了多肽的纯化方法,包括如下步骤:
步骤1:取所述多肽粗品经第一双水相系统粗提纯;
步骤2:取所述步骤1的产物经第二双水相系统精制;
步骤3:取所述步骤2的产物反相脱盐,收集最大峰对应的溶液;
所述第一双水相系统包括第一聚合物和第一制剂;
所述第二双水相系统包括第二聚合物和第二制剂;
所述第一聚合物或所述第二聚合物独立选自聚乙二醇、聚丙二醇或葡聚糖;所述第一聚合物或所述第二聚合物可以相同也可以不同;
所述第一制剂为硫酸铵、碳酸氢铵、醋酸铵、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸、氯化钠;
所述第二制剂为磷酸盐、冰醋酸、氯化钾、醋酸铵。
在本发明的一些具体实施方案中,所述步骤1包括如下步骤:
步骤1-1、取所述多肽粗品与第三聚合物、硫酸铵溶液混合,弃上层聚合物相;
步骤1-2、取步骤1-1的产物与第四聚合物混合,弃下层盐相,收集上层聚合物相;
所述第一聚合物包括所述第三聚合物和所述第四聚合物;所述第三聚合物或所述第四聚合物独立选自聚乙二醇、聚丙二醇或葡聚糖;所述第三聚合物与所述第四聚合物相同或不同;
所述步骤2具体为:取步骤1制得的粗纯化产物与所述第二聚合物和所述磷酸盐混合,收集下层盐相。
在本发明的另一些具体实施方案中,所述步骤1包括如下步骤:
步骤1-a、取所述多肽粗品与第三聚合物,弃下层盐相;
步骤1-b、取步骤1-a的产物与硫酸铵溶液混合,收集下层盐相;
步骤1-c、取步骤1-b的产物与第四聚合物混合,收集下层盐相;
所述第一聚合物包括所述第三聚合物和所述第四聚合物;所述第三聚合物或所述第四聚合物独立选自聚乙二醇、聚丙二醇或葡聚糖;所述第三聚合物与所述第四聚合物相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中,所述聚乙二醇的分子量选自3000、4000、6000或8000。
在本发明的一些具体实施方案中,所述第一聚合物的浓度为10mmol/L~50mmol/L;所述第一制剂的浓度为10mmol/L~100mmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中,所述第二聚合物的浓度为5mmol/L~100mmol/L,所述第二制剂的浓度为20mmol/L~100mmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中,所述第一双水相系统的pH值为7.5~9.5;所述第二双水相系统的pH值为2.0~4.0。
在本发明的一些具体实施方案中,所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
在本发明的一些具体实施方案中,所述反相脱盐的固定相为C18,C8,C4,粒径为10μm。
在本发明的一些具体实施方案中,所述反相脱盐的溶液为95%醋酸铵溶液和5%乙腈溶液,所述反相脱盐的时间为15~30min。
在本发明的一些具体实施方案中,所述反相脱盐采用梯度洗脱,洗脱液中A相为水,B相为乙腈,B相洗脱梯度为10%~45%(60min)。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽选自利拉鲁肽、萨摩鲁肽、卡贝缩宫素、特利加压素、特立帕肽、去氨加压素、西曲瑞克、胸腺法新、爱啡肽或艾塞那肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为利拉鲁肽。所述利拉鲁肽的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L PEG8000,浓度为40mmol/L硫酸铵,将40克利拉鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氨水调节pH至7.5-9.5,至利拉鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为10mmol/L PEG3000和浓度为10mmol/L PEG4000,浓度为75mmol/L磷酸二氢钾溶液,用磷酸调节pH至2.0-4.0,移除上层聚合物相,下层盐相为利拉鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将制备柱C18用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,乙腈梯度:B%:30%—45%,60min,收集RT约28min的主成分,将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准利拉鲁肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为利拉鲁肽,所述利拉鲁肽的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:5L纯化水中,包含浓度为50mmol/L PEG8000,浓度为100mmol/L硫酸铵,将200克利拉鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氨水调节pH至7.5-9.5,至利拉鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L PEG3000和浓度为40mmol/L PEG4000,浓度为100mmol/L磷酸二氢钾溶液,用磷酸调节pH至2.0-4.0,移除上层聚合物相,下层盐相为利拉鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,乙腈梯度:B%:30%—45%,60min,收集RT约28min的主成分,将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准利拉鲁肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为萨摩鲁肽,所述萨摩鲁肽的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L葡聚糖8000,浓度为80mmol/L碳酸氢铵,将60克萨摩鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氢氧化钠调节pH至8.0-9.0,至索马鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为萨摩鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为萨摩鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L PEG3000和浓度为50mmol/L PEG4000,浓度为20mmol/L磷酸二氢钾和0.4%冰醋酸溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为萨摩鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将C4制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,纯化水:80%-60%,乙腈:20%-40%,洗脱50min,收集RT约32min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的萨摩鲁肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为特利加压素,所述特利加压素的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚乙二醇3000,浓度为40mmol/L醋酸铵,将100克特利加压素研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用磷酸氢二钠调节pH至5.4-5.6,至特利加压素完全溶解,然后混合均匀。将下层盐溶液移除,然后加入10mmol/L硫酸铵,硫酸调节pH至2.3-2.7,混合均匀,将上层聚合物相去除。下层盐相为特利加压素粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为特利加压素粗产品,加入1/2体积的的另一双水相系统,包含浓度为20mmol/L聚丙二醇1000和浓度为20mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L氯化钾溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为特利加压素精制产品。
③反相转盐
将C18制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用0.1%冰醋酸进行梯度洗脱,0.1%冰醋酸:90%-75%,乙腈:10%-25%,洗脱60min,收集RT约25min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的特利加压素。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为卡贝缩宫素,所述卡贝缩宫素的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚丙二醇2000,10mmol/L聚丙二醇1000,浓度为40mmol/L磷酸二氢钾,将100克卡贝缩宫素研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用醋酸调节pH至3.0-3.7,至卡贝缩宫素完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物相去除。下层盐相为特利加压素粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为特利加压素粗产品,加入1/2体积的的另一双水相系统,包含浓度为30mmol/L聚丙二醇1000和浓度为5mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L醋酸铵溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为卡贝缩宫素精制产品。
③反相转盐
将C18制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用0.1%冰醋酸进行梯度洗脱,0.1%冰醋酸:85%-75%,乙腈:15%-25%,洗脱60min,收集RT约19min主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的卡贝缩宫素。
在本发明的一些具体实施方案中,所述多肽为爱啡肽,所述爱啡肽的纯化方法为:
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚丙二醇1000,浓度为0.3%磷酸,将100克爱啡肽氧化液,缓慢加入上述双水相系统,用氢氧化钠调节pH至7.5-8.5,至两相缓慢分层。将下层盐相去除,然后加入10mmol/L氯化钠,混合均匀,将上层聚合物相去除。下层盐相为爱啡肽粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为爱啡肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L聚丙二醇1000和浓度为20mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L醋酸铵溶液,用醋酸调节pH至2.3-2.6,移除上层聚合物相,下层盐相为爱啡肽精制产品。
③凝胶脱盐
将凝胶柱2000用纯化水冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,收集RT约9min主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的爱啡肽。
本发明提供了一种新的纯化方法,可以提高产品的纯度,纯度大于99%,单杂小于0.15%,特别是降低有机溶剂的使用量,大大降低成本和环保压力。
本发明提供了一种新的多肽纯化方法,区别于传统纯化方法,并且易于放大生产。传统工艺需要经过反相色谱多次的回收纯化,每步纯化均需要用到大量的有机溶剂,回收次数较多,周期较长,进而产生大量的有机废水,例如,每100克利拉鲁肽粗肽纯化,需要消耗乙腈约80-100L,有机废水约为800L,通过本法明对比工艺可以出,有机溶剂主要用于脱盐或转盐部分,甚至有的项目工艺全程均不采用有机相,所以通过对比数据看出,有机溶剂使用量减少约80%以上,从工艺本身来讲,本发明只有转盐或脱盐步骤用到反相,仅本步骤用到有机相,工艺用到有机相的步骤本身就比传统工艺少两步,进而有机废水排放明显变少。本法明的优势在工艺放大中优势更明显,主要体现在传统工艺放大后,用的有机相会相应的大幅提高,同时更会产生大量的有机废水,里面还有较多的乙醚、DMF、TFA等,非常难于废液回收。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1结果;
图2示实施例2结果;
图3示实施例3结果;
图4示实施例4结果;
图5示实施例5结果;
图6示实施例6结果;
图7示对比例1结果。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽的纯化方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种新的多肽纯化方法,采用液液双水相进行纯化,然后将合格的利拉鲁肽,经过反相纯化脱盐后得到利拉鲁肽精肽。
本发明还提供了一种新的利拉鲁肽的纯化方法,采用双水相进行粗纯和精制,然后经过反相脱盐,其中第一步以一定浓度的聚合物和硫酸铵溶液进行粗提纯,第二步以一定浓度聚合物和磷酸盐进行精制,将精制得样品进行反相梯度洗脱脱盐,收集溶液冻干即得到利拉鲁肽。
利拉鲁肽的肽序较长,杂质较多,反相色谱载量较低,每次纯化上样量有限,所以需要经过反相多次上样纯化,进而需要大量的有机溶剂,本发明通过两相水系统进行粗纯和精制,然后经过反相脱盐,整个工艺过程中,只有反相脱盐过程使用有机溶剂,整个工艺中有机溶剂使用量大大降低,甚至个别多肽可以完全不借助有机相进行粗纯、精制、转盐或脱盐。本发明解决传统纯化方法费时费力污染重的缺点,操作简便,有利于实现规模化的制备,并提供了一种新思路的多肽纯化方法。
作为优选,本发明所述双水相系统第一步粗纯聚合物浓度为10mmol/L-50mmol/L,硫酸盐的浓度为40mmol/L-100mmol/L。
作为优选,所述聚合物为聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖的一种或几种。
作为优选,本发明所述第一步双水相系统的pH的范围为7.5-9.5。
其中,作为优选,所述聚乙二醇分量量为3000、4000、6000、8000中的一种或几种。
作为优选,本发明所述双水相系统第二步精制聚合物浓度为50mmol/L-100mmol/L,磷酸盐的浓度为20mmol/L-80mmol/L。
其中,作为优选,所述缓冲盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或几种
作为优选,本发明所述第二步双水相系统的pH的范围为2.0-4.0。
作为优选,本发明所述纯化反相HPLC方法脱盐的固定相为C18,C8,C4,粒径10微米。
其中,作为优选,反相流动相脱盐的A相为纯化水,B相为乙腈,B相洗脱梯度为10%-50%(60min,梯度变化3min一个梯度)。
作为优选,所述多肽包括利拉鲁肽、萨摩鲁肽、卡贝缩宫素、特利加压素、特立帕肽、去氨加压素、西曲瑞克、胸腺法新、爱啡肽、艾塞那肽等。
本发明提供了一种新的纯化方法,可以提高产品的纯度,纯度大于99%,单杂小于0.15%,特别是降低有机溶剂的使用量,大大降低成本和环保压力。
双水相纯化是利用两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物和盐之间的分子空间阻碍作用,无法相互渗透,当聚合物和无机盐达到某种浓度时,就会分成两种不互溶的两相,进而实现物质的分离。过程中未使用有机相,并且操作简单,易于放大。对废液处理、废液安全、环境压力均有较大的改善。
本发明提供的多肽的纯化方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:利拉鲁肽纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L PEG8000,浓度为40mmol/L硫酸铵,将40克利拉鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氨水调节pH至7.5-9.5,至利拉鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为10mmol/L PEG3000和浓度为10mmol/L PEG4000,浓度为75mmol/L磷酸二氢钾溶液,用磷酸调节pH至2.0-4.0,移除上层聚合物相,下层盐相为利拉鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将制备柱C18用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,乙腈梯度:B%:30%—45%,60min,收集RT约28min的主成分,将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准利拉鲁肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽18g。纯度99.02%,总收率47%,经过计算,本发明乙腈用量约为7L,有机废水约为35L,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,传统反相色谱纯化有机溶剂使用量约50L,有机废水约为200L,与对比例1相比,本发明有机废液排放减少约80%,具有极显著差异(P<0.01)。
实施例2:利拉鲁肽纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:5L纯化水中,包含浓度为50mmol/L PEG8000,浓度为100mmol/L硫酸铵,将200克利拉鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氨水调节pH至7.5-9.5,至利拉鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为利拉鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L PEG3000和浓度为40mmol/L PEG4000,浓度为100mmol/L磷酸二氢钾溶液,用磷酸调节pH至2.0-4.0,移除上层聚合物相,下层盐相为利拉鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将制备柱C18用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,乙腈梯度:B%:30%—45%,60min,收集RT约28min的的主成分,将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准利拉鲁肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽91g。纯度99.28%,总收率45.6%,经过计算,本发明乙腈用量约为20L,有机废水约为100L,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,传统反相色谱纯化有机溶剂使用量约150L,有机废水约为750L,与对比例1相比,本发明有机废液排放减少约85%,具有极显著差异(P<0.01)。
实施例3:萨摩鲁肽纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L葡聚糖8000,浓度为80mmol/L碳酸氢铵,将60克萨摩鲁肽研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用氢氧化钠调节pH至8.0-9.0,至索马鲁肽完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物溶液移除,然后加入50mmol/LPEG3000,混合均匀,将下层盐相去除。上层聚合物相为萨摩鲁肽粗产品。
②第二步精制纯化
将上层聚合物相为萨摩鲁肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L PEG3000和浓度为50mmol/L PEG4000,浓度为20mmol/L磷酸二氢钾和0.4%冰醋酸溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为萨摩鲁肽精制产品。
③反相脱盐
将C4制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用纯化水进行梯度洗脱,纯化水:80%-60%,乙腈:20%-40%,洗脱50min,收集RT约32min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温不超30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的萨摩鲁肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽29g。纯度98.50%,总收率48.3%,经过计算,本发明有机溶剂使用量约为7L,有机废水约为35L,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,传统反相色谱纯化有机溶剂使用量约50L,有机废水约为250L,与对比例1相比,本发明有机废液排放减少约80%,具有极显著差异(P<0.01)。
实施例4:特利加压素纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚乙二醇3000,浓度为40mmol/L醋酸铵,将100克特利加压素研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用磷酸氢二钠调节pH至5.4-5.6,至特利加压素完全溶解,然后混合均匀。将下层盐溶液移除,然后加入10mmol/L硫酸铵,硫酸调节pH至2.3-2.7,混合均匀,将上层聚合物相去除。下层盐相为特利加压素粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为特利加压素粗产品,加入1/2体积的的另一双水相系统,包含浓度为20mmol/L聚丙二醇1000和浓度为20mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L氯化钾溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为特利加压素精制产品。
③反相脱盐
将C18制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用0.1%冰醋酸进行梯度洗脱,0.1%冰醋酸:90%-75%,乙腈:10%-25%,洗脱60min,收集RT约25min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的特利加压素。
冻干后得白色粉末状固体精肽36.7g。纯度99.15%,单个杂质均小于0.15%,总收率36.7%,经过计算,本发明有机溶剂使用量约为12L,有机废水约为50L,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,传统反相色谱纯化有机溶剂使用量约45L,有机废水约为250L,与传统反相色谱比,本发明有机废液排放减少约85%,具有极显著差异(P<0.01)。
实施例5:卡贝缩宫素纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚丙二醇2000,10mmol/L聚丙二醇1000,浓度为40mmol/L磷酸二氢钾,将100克卡贝缩宫素研磨粉碎,缓慢加入上述双水相系统,用醋酸调节pH至3.0-3.7,至卡贝缩宫素完全溶解,然后混合均匀。将上层聚合物相去除。下层盐相为特利加压素粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为特利加压素粗产品,加入1/2体积的的另一双水相系统,包含浓度为30mmol/L聚丙二醇1000和浓度为5mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L醋酸铵溶液,移除上层聚合物相,下层盐相为卡贝缩宫素精制产品。
③反相脱盐
将C18制备柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,以95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐,然后用0.1%冰醋酸进行梯度洗脱,0.1%冰醋酸:85%-75%,乙腈:15%-25%,洗脱60min,收集RT约19min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的卡贝缩宫素。
冻干后得白色粉末状固体精肽41.2g。纯度99.15%,总收率41.2%,经过计算,本发明有机溶剂使用量约为10L,有机废水约为60L,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,传统反相色谱纯化有机溶剂使用量约40L,有机废水约为250L,与传统反相色谱纯化相比,本发明有机废液排放减少约75%,具有极显著差异(P<0.01)。
实施例6:爱啡肽纯化
①第一步粗纯化
纯化条件:1L纯化水中,包含浓度为10mmol/L聚丙二醇1000,浓度为0.3%磷酸,将100克爱啡肽氧化液,缓慢加入上述双水相系统,用氢氧化钠调节pH至7.5-8.5,至两相缓慢分层。将下层盐相去除,然后加入10mmol/L氯化钠,混合均匀,将上层聚合物相去除。下层盐相为爱啡肽粗产品。
②第二步精制纯化
将下层盐相为爱啡肽粗产品,加入等体积的的另一双水相系统,包含浓度为50mmol/L聚丙二醇1000和浓度为20mmol/L聚丙二醇2000,浓度为20mmol/L醋酸铵溶液,用醋酸调节pH至2.3-2.6,移除上层聚合物相,下层盐相为爱啡肽精制产品。
③凝胶脱盐
将凝胶柱2000用纯化水冲洗干净后上样步骤2得到的精制产品,收集RT约9min的主成分。将收集的目的肽溶液于水温30℃±2℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的爱啡肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽67g。纯度99.32%,单个杂质均小于0.20%,总收率67%,因本发明纯化过程中未使用有机相,有机废水为0,与传统反相色谱纯化工艺相比较,纯化工艺采用有机相进行每步的梯度洗脱,有机溶剂使用量约45L,有机废水约为250L,与传统反相色谱纯化相比,本发明有机废液排放减少100%,具有极显著差异(P<0.01)。
对比例1:利拉鲁肽纯化
样品处理:将固相合成所得的利拉鲁肽用质量百分浓度为10%左右的稀氨水来溶解(溶解浓度约为15mg/ml),用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用;
①第一步纯化条件:色谱柱:以聚苯乙烯二乙烯苯基质的填料为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:3cm×25cm.流动相:A相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水水溶液;B相:配比含有质量百分浓度为0.1%的氨水乙腈溶液。流速:25-30ml/min。检测波长:245nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:20-65%,梯度处理时间40-55min。进样量为0.8g;
纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为溶解过滤之后的样品溶液。线性梯度洗脱,收集目的峰,纯度为92%左右,将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用;将纯化后收集的肽溶液用20%的碳酸氢胺调样品溶液PH值至偏中性,减压浓缩至一定体积50-100ml除过多的乙腈,为了第二步纯化做准备)
②第二步纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:3cm×25cm,流动相:A相配比含有质量百分浓度为0.01%的盐酸水溶液;B相:色谱纯乙腈溶液;流速:25-30ml/min;检测波长:245nm.梯度:流动相B的质量百分浓度:40-60%,梯度处理时间45-60min;进样量为第一步纯化浓缩之后含量92%的样品溶液;
纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为第一步纯化浓缩之后含量92%的样品溶液,线性梯度洗脱,收集目的峰,纯度为98%左右,将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用;
③转盐:取100g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中,用超纯水,乙醇,碱洗,酸洗,再碱洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用,将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中,通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的,同时收集转盐后的肽溶液;将转盐后所得的所有肽溶液,进行减压浓缩至1g/50ml,浓缩温度不超过40℃,然后冷冻干燥得纯度大于98.5%的利拉鲁肽,纯化收率可得60%以上。本对比例两步工艺用到乙腈,每100克粗肽需要消耗乙腈约80-100L,有机废水约为800L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.多肽的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:取所述多肽粗品经第一双水相系统粗提纯;
步骤2:取所述步骤1的产物经第二双水相系统精制;
步骤3:取所述步骤2的产物反相、凝胶或离子脱盐,收集最大峰对应的溶液;
所述第一双水相系统包括第一聚合物和第一制剂;
所述第二双水相系统包括第二聚合物和第二制剂;
所述第一聚合物或所述第二聚合物独立选自聚乙二醇、聚丙二醇或葡聚糖;所述第一聚合物或所述第二聚合物可以相同也可以不同;
所述第一制剂为硫酸铵、碳酸氢铵、醋酸铵、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸、氯化钠;
所述第二制剂为磷酸盐、冰醋酸、氯化钾、醋酸铵。
2.如权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述聚乙二醇的分子量选自3000、4000、6000或8000。
3.如权利要求1或2所述的纯化方法,其特征在于,所述第一聚合物的浓度为10mmol/L~50mmol/L;所述第一制剂的浓度为10mmol/L~100mmol/L。
4.如权利要求1至3任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述第二聚合物的浓度为5mmol/L~100mmol/L,所述第二制剂的浓度为20mmol/L~100mmol/L。
5.如权利要求1至4任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述第一双水相系统的pH值为2.3~9.5;所述第二双水相系统的pH值为2.0~4.0。
6.如权利要求1至5任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
7.如权利要求1至6任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述反相脱盐的固定相为C4、C8、C18,粒径为10μm。
8.如权利要求1至7任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述反相脱盐的溶液为95%醋酸铵溶液和5%乙腈溶液,所述反相脱盐的时间为15~30min。
9.如权利要求1至8任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述反相脱盐采用梯度洗脱,洗脱液中A相为水,B相为乙腈,B相洗脱梯度为10%~45%(60min)。
10.如权利要求1至9任一项所述的纯化方法,其特征在于,所述多肽选自利拉鲁肽、萨摩鲁肽、卡贝缩宫素、特利加压素、特立帕肽、去氨加压素、西曲瑞克、胸腺法新、爱啡肽或艾塞那肽。
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