CN103524612B

CN103524612B - Peg/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白的方法

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Publication number: CN103524612B
Application number: CN201310460499.XA
Authority: CN
Inventors: 徐明芳; 成希飞; 李子超; 李昀锴; 向明霞
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN103524612A

Abstract

本发明公开了一种PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，属于乳清蛋白组分分离技术。本发明通过对乳源乳清蛋白进行提取；在PEG/磷酸盐双水相体系分离α-La和β-Lg，其中双水相体系中PEG质量分数为10.4%～14.4%，磷酸盐浓度为10.8%～18.8%，体系pH为7.3；后采用考马斯亮蓝法测量蛋白质浓度和用SDS-PAGE电泳进行鉴定检测。本发明的方法提供一种廉价、操作简便、易于放大并且可以应用于工业化大规模生产的乳清蛋白分离技术；分离得到的乳源乳清蛋白α-La和β-Lg在功能性食品及生物活性产品的生产中应用。

Description

PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白的方法

技术领域

本发明属于乳清蛋白组分分离技术，特别涉及一种PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法。

背景技术

乳制品因其乳蛋白含量丰富，营养价值高，容易被人体消化吸收而被公认为是对人身体和智力发育有良好的作用的健康食品，乳中最有价值的成分也就是乳蛋白，主要包含酪蛋白和乳清蛋白，还有少量脂肪球蛋白，其中乳清蛋白约占乳蛋白的20%。乳清蛋白以一种溶解的形式存在于乳清中，是一些小而紧密的球状蛋白，具有广泛的功能特性。乳清蛋白具有蛋白含量高，胆固醇、脂肪和乳糖含量低的特点，并且容易消化吸收，具有很高的营养价值，大约含有50%以上鲜奶中的营养成分。乳清蛋白是完全蛋白质，可以促进人体生长发育，乳清蛋白中的胆固醇含量很低，而钙和其他矿物质却很高。乳清蛋白中还含有很多生物活性物质，因而具有较高的生物利用价值。随着食品加工业高新技术的发展与应用，乳清蛋白已成为运动营养产品、婴儿配方奶粉、减肥和情绪调节产品、蛋白质补充剂中的重要功能成分。

乳清蛋白中富含半胱氨酸和蛋氨酸，这种含硫氨基酸对人体来说是重要的，它具有抗机体氧化及在细胞分裂时能保持稳定的功能。乳清蛋白被证明具有促进免疫系统、阻碍化学致癌的发展、增加骨骼强度、减少低密度脂蛋白和胆固醇作用。乳清蛋白在婴儿食品中得到了很大的应用，母乳中酪蛋白与乳清蛋白比例约为3:7，而牛乳中二者比例约为8:2，α-酪蛋白组分也认为是引起婴儿过敏的主要过敏源之一。所以现有的婴儿配方奶粉添加了脱盐乳清粉增大奶粉中乳清蛋白的比例，防止婴儿牛乳过敏，因此β-Lg（β-lactoglobulin，β-乳球蛋白）的含量较高。但需要注意的是，母乳中α-La（α-lactalbumin，α-乳白蛋白）和乳铁蛋白占主导地位，含量分别为40%和25%，而β-Lg在母乳中含量很低甚至没有。因此目前针对于婴儿奶粉中乳清蛋白的研究主要集中在去除β-Lg这一过敏原或消除其致敏性,使其更加接近母乳乳清蛋白。

双水相技术（Aqueous two-phase systems,ATPS）开始于20世纪60年代，1896年Beijerinck发现明胶与琼脂或明胶与可溶淀粉混合时，可以得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相，这个现象被称为聚合物的不相溶性，这就是双水相系统。1979年德国GBF的Kula等首次将双水相萃取分离技术应用于从细胞匀浆中提取蛋白质和酶类，大大改善了胞内酶的提取效果。双水相萃取技术是一种操作简单、易于放大、可连续操作的分离方法。双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：体系含水量高，可达80%以上，有利于蛋白质保持活性和原有结构；分相时间短，一般只需要5-15min；易于放大和进行连续性操作；大量杂质能与所有固体物质一同除去，省去了去除杂质的步骤；设备投资少；萃取环境温和，生物相容性高等。当生物物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于两相中生物物质的浓度比，由于蛋白质的K值不同（大致在0.1-10之间）因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有极好的选择性。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法。该方法以乳清蛋白为原料，采用PEG/磷酸盐双水相体系将α-La（α-乳白蛋白）萃取至上相（PEG相）而β-Lg（β-乳球蛋白）萃取至下相（磷酸盐相），基本实现了乳清蛋白中主要的两种组分的分离。本发明所述的方法提供一种廉价、操作简便、易于放大并且可以应用于工业化大规模生产的乳清蛋白分离技术。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，具体分离鉴定步骤如下：

（1）乳源乳清蛋白提取：动物乳脱脂，脱脂乳调节pH4.6，静置30min，离心后弃去沉淀，上清液经过滤透析后冻干，获得乳清蛋白；

（2）PEG/磷酸盐双水相体系分离α-La和β-Lg：取步骤（1）中获得乳清蛋白以0.1～0.5mg/mL的浓度分布在PEG/磷酸盐双水相体系中；充分摇匀溶解，离心后，于25℃静置待完全分相后分别收集上、下两相液体；

（3）分别测定上、下两相液体中乳清蛋白浓度和进行SDS-PAGE电泳鉴定检测。

步骤（1）中所述的动物乳优选为牛乳或羊乳中的一种；

步骤（1）中所述的脱脂条件优选为4000r/min，4℃离心20min，弃去上层脂肪；

步骤（1）中所述的调节pH4.6优选为用5M HCl进行调节；

步骤（1）中所述的离心条件优选为4000r/min，4℃离心20min；

步骤（1）中所述的过滤透析条件优选为用0.22μm滤膜过滤，4℃用蒸馏水透析过夜；

步骤（2）中所述的PEG/磷酸盐双水相体系为PEG质量分数10.4%～14.4%，磷酸盐质量分数10.8%～18.8%，体系pH7.3的PEG/磷酸盐双水相体系；所述的PEG/磷酸盐双水相体系优选为PEG1500质量分数12.4%，磷酸盐质量分数18.8%，体系pH7.3的PEG/磷酸盐双水相体系；

步骤（2）中所述的PEG为PEG-1000、PEG-1500或PEG-4000中的一种；优选为PEG1500；

步骤（2）中所述的磷酸盐为磷酸钠、磷酸钾或磷酸氢二钾中的一种；

步骤（2）中所述的分离的条件优选为4000r/min离心40min；

步骤（2）中分离的获得的上、下相液体中分别含有乳清蛋白中α-La和β-Lg，即实现乳清蛋白中α-La和β-Lg的分离；

步骤（3）中所述的测定乳清蛋白浓度的方法为采用考马斯亮蓝法测量蛋白质浓度；其中，考马斯亮蓝试剂：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（w/v）磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，于避光处静置过夜，双层滤纸过滤后最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸；制定蛋白浓度的标准曲线：加入0.1mg/mL标准牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加入生理盐水溶液1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4mL，接着各管加入5mL考马斯亮蓝溶液在595nm处测吸光度，得到标准曲线；

步骤（3）中所述的SDS-PAGE电泳检测的分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。

所述的乳源乳清蛋白α-La和β-Lg通过上述PEG/磷酸盐双水相体系的分离鉴定方法制备得到。

上述分离得到的乳源乳清蛋白α-La和β-Lg在功能性食品及生物活性（功能肽）产品的生产中应用，并且对婴儿配方奶粉除去β-Lg这一过敏源的工业化生产提供一定的理论指导。

本发明技术方案的分离原理主要为：乳清蛋白中的主要成分为：α-La和β-Lg，两种蛋白分子量大小相似，共占乳清蛋白含量的80%左右；本发明的方法以乳清蛋白为原料，采用双水相体系PEG/磷酸盐对乳清蛋白进行分离，PEG/磷酸盐体系将乳清蛋白中α-La萃取至上相（PEG相）而β-Lg萃取至下相（磷酸盐相），基本实现了乳清蛋白中主要的两种组分的分离。本发明所述的方法提供一种廉价、操作简便、易于放大并且可以应用于工业化大规模生产的乳清蛋白分离技术。

本发明具有如下的优点和效果：

1.本发明的方法具有操作简单，价格低廉，分离效果良好，易于放大到工业化生产的优点。

2.本发明的分离方法操作条件温和，不会破坏蛋白质的二级结构，有利于蛋白质生物活性的保持。

3.本发明所用的PEG/磷酸盐双水相体系可以一步将乳清蛋白的主要组分α-La和β-Lg进行分离，克服了乙醇/碳酸钠双水相体系等无法实现α-La和β-Lg的分离缺陷。

4.本发明分离得到的α-La、β-Lg可以应用于功能性食品及生物活性（功能肽）产品的生产，并且对婴儿配方奶粉除去β-Lg这一过敏源的工业化生产提供一定的理论指导。

附图说明

图1是发明实施例1的流程图。

图2是实施例2中的PEG和磷酸盐相图。

图3是实施例3中PEG种类和质量分数对β-Lg分配系数的影响结果图。

图4是实施例3中PEG种类和质量分数对α-La分配系数的影响结果图。

图5是实施例4中磷酸盐质量分数对β-Lg和α-La分配系数的影响结果图。

图6是实施例5中最佳PEG/磷酸盐双水相萃取条件分离南方水牛乳乳清蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7是实施例6中乙醇/碳酸钠双水相体系萃取水牛乳乳清蛋白SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

采用PEG/磷酸盐双水相体系对乳清蛋白进行分离。分离步骤如下：

（1）标准乳清蛋白溶液的配制：标准α-La溶液（1mg/mL)；标准β-Lg溶液(1mg/mL)。

（2）南方水牛乳乳清蛋白提取：市售水牛乳4000r/min，4℃离心20min脱脂，弃去上层脂肪，脱脂乳用5M HCl调节pH4.6，静置30min，4000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀，清液用0.22μm滤膜过滤，4℃对蒸馏水透析过夜后冻干，-20℃冷冻保存。

（3）采用浊点法绘制双水相体系的相图，实验方法如下：取一定质量的无机盐（m1）加入一定量的蒸馏水（m2），溶解，定容，尽量配置成接近饱和溶液，记录体积，制成无机盐储液；同理，取一定质量PEG（m3）加入一定质量的蒸馏水（m4），溶解，定容，尽量配置成接近饱和溶液，记录体积，制成PEG储液。然后往盐溶液中逐滴加入PEG溶液直至混合溶液恰好出现浑浊，在平衡这个过程中，只要再滴加一滴水，溶液马上变得澄清；再多加一点PEG溶液，溶液又马上浑浊，则可以判定该组成点为临界点。各组成质量分数计算公式如下：

y_{PEG} = \frac{m_{3}}{m_{1} + m_{2} + m_{3} + m_{4}}

（4）取一定量的标准α-La、β-Lg溶液，分别向其中加入不同质量的PEG溶液和磷酸盐溶液，使体系中蛋白浓度约为0.1-0.5mg/mL。分别考察体系PEG种类、PEG和磷酸盐的质量分数对乳清蛋白在两相分配的影响。双水相体系配制好后充分摇匀，溶解，4000r/min低速离心40min，25℃静置12h待完全分相。接着分别取上、下相样品测定乳清蛋白浓度，计算乳清蛋白的分配系数（K）和回收率（Y）。

K = \frac{C_{t}}{C_{b}}

其中，Ct、Cb分别是上、下相乳清蛋白的浓度（mg/mL）。

Y = \frac{M_{t}}{M} \times 100 %

其中，Mt为上相蛋白质的总质量；M为体系中蛋白的总质量。

（5）采用考马斯亮蓝法测量蛋白质浓度。考马斯亮蓝试剂：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（w/v）磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，于避光处静置过夜，双层滤纸过滤后最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸。制定蛋白浓度的标准曲线：加入0.1mg/mL标准牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加入生理盐水溶液1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4mL，接着各管加入5mL考马斯亮蓝溶液在595nm处测吸光度，得到标准曲线。

（6）最佳双水相条件下萃取南方水牛乳乳清蛋白，上下相蛋白溶液SDS-PAGE电泳检测（分离胶为12%，浓缩胶为4%）。

所述的PEG/磷酸盐双水相体系对乳清蛋白进行分离的流程图如图1所示。

实施例2：分析四种PEG与磷酸盐的成相能力

在实施例1的步骤（3）中采用浊点法做PEG1000、1500、4000、6000与磷酸氢二钾双水相相图，了解四种PEG与磷酸盐的成相能力。双水相相图中的双节线越长，说明两种物质分相能力越强，PEG和磷酸盐相图如图2所示。

实施例3：最佳PEG种类和体系中PEG质量分数的确定

分别配制PEG质量分数为10.4%、11.4%、12.4%、13.4%、14.4%，PEG种类为1000、1500、4000，磷酸盐浓度为14.8%，体系pH为7.3的PEG/磷酸盐双水相体系对α-La、β-Lg的萃取效果，分别计算α-La、β-Lg的分配系数和回收率，α-La、β-Lg的分配系数之比越大说明分离效果越好，确定最佳PEG种类和PEG质量分数。其中，PEG种类和质量分数对β-Lg分配系数的影响，以及PEG种类和质量分数对α-La分配系数的影响的结果图分别如图3和图4所示。

实施例4：最佳磷酸盐质量分数的确定

分别配制磷酸盐质量分数为10.8%、12.8%、14.8%、16.8%、18.8%，PEG1500质量分数为12.4%，pH为7.3的PEG/磷酸盐双水相体系，分别计算α-La、β-Lg的分配系数和回收率，α-La、β-Lg的分配系数之比越大说明分离效果越好，确定最佳磷酸盐质量分数。其中，磷酸盐质量分数对β-Lg和α-La分配系数的影响结果图如图5所示。

实施例5：

通过实施例2-4的单因素实验确定PEG/磷酸盐双水相体系萃取标准α-La、β-Lg的最佳体系为PEG1500/磷酸盐双水相体系，最佳萃取条件为：PEG1500质量分数为12.4%，磷酸盐质量分数为18.8%。在该条件下α-La、β-Lg分配系数之比达到221.9。在该条件下萃取南方水牛乳乳清蛋白，上下相蛋白溶液进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE条件：分离胶为12%，浓缩胶为4%。

具体分离步骤如下：

（1）南方水牛乳乳清蛋白提取：市售水牛乳4000r/min，4℃离心20min脱脂，弃去上层脂肪，脱脂乳用5M HCl调节pH4.6，静置30min，4000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀，清液用0.22μm滤膜过滤，4℃对蒸馏水透析过夜后冻干，获得乳清蛋白，-20℃冷冻保存待用。

（2）PEG/磷酸盐双水相体系分离α-La和β-Lg：配置PEG1500质量分数为12.4%，磷酸盐浓度为18.8%，体系pH为7.3的PEG/磷酸盐双水相体系；取步骤（1）中获得乳清蛋白按越0.1mg/mL的浓度分布在PEG/磷酸盐双水相体系中，充分摇匀溶解，4000r/min低速离心40min，25℃静置12h待完全分相；

（3）将收集的上、下相样品中分离获得α-La和β-Lg，分别测定乳清蛋白浓度和进行SDS-PAGE电泳检测；（分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%）；

步骤（3）中所述的测定乳清蛋白浓度的方法为采用考马斯亮蓝法测量蛋白质浓度；其中，考马斯亮蓝试剂：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（w/v）磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，于避光处静置过夜，双层滤纸过滤后最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸；制定蛋白浓度的标准曲线：加入0.1mg/mL标准牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加入生理盐水溶液1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4mL，接着各管加入5mL考马斯亮蓝溶液在595nm处测吸光度，得到标准曲线。

最佳PEG/磷酸盐双水相萃取条件分离南方水牛乳乳清蛋白SDS-PAGE图如图6所示。图中可以看出PEG/磷酸盐双水相萃取的上相和下相对α-La和β-Lg进行了很好的分离萃取。

对比实施例

乙醇/碳酸钠双水相体系萃取代替实施例5中的PEG/磷酸盐双水相体系萃取；其中乙醇/碳酸钠双水相体系中，乙醇质量分数18%，碳酸钠质量分数15%，体系pH12.2。其它萃取条件和步骤与实施例5中步骤相同。

乙醇/碳酸钠双水相体系萃取水牛乳乳清蛋白SDS-PAGE图谱如图7所示。图中可以看出，常规所用的乙醇/碳酸钠双水相体系萃取，α-La乳白蛋白和β-Lg乳球蛋白均萃取至上相（乙醇相），不能将α-La和β-Lg在两相中同时分离。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于具体分离鉴定步骤如下：

（3）分别测定上、下两相液体中乳清蛋白浓度和进行SDS-PAGE电泳鉴定检测；

步骤（2）中所述的PEG/磷酸盐双水相体系为PEG质量分数10.4%～14.4%，磷酸盐质量分数10.8%～18.8%，体系pH7.3的PEG/磷酸盐双水相体系。

2.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的动物乳为牛乳或羊乳中的一种。

3.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的脱脂的条件为4000r/min，4℃离心20min，弃去上层脂肪。

4.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的调节pH4.6为用5M HCl进行调节；

步骤（1）中所述的离心的条件为4000r/min，4℃离心20min。

5.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的过滤透析的条件为用0.22μm滤膜过滤，4℃用蒸馏水透析过夜。

6.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PEG/磷酸盐双水相体系为PEG1500质量分数12.4%，磷酸盐质量分数18.8%，体系pH7.3的PEG/磷酸盐双水相体系。

7.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PEG为PEG-1000、PEG-1500或PEG-4000中的一种；

步骤（2）中所述的磷酸盐为磷酸钠、磷酸钾或磷酸氢二钾中的一种。

8.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的分离的条件为4000r/min离心40min。

9.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的测定乳清蛋白浓度的方法为采用考马斯亮蓝法测量蛋白质浓度。

10.根据权利要求1所述的PEG/磷酸盐双水相体系分离乳源乳清蛋白α-La和β-Lg的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的SDS-PAGE电泳检测的分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。