CN111909234A - 一种蒜头果蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种蒜头果蛋白的制备方法,具体的步骤包括:(1)蛋白质提取;(2)提取液中加入有机溶剂和无机盐,搅匀,调节pH,收集富集相;(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液;(4)将截留液上凝胶柱,洗脱,收集活性成分。本发明提出的蒜头果蛋白的制备方法采用两相萃取的提取纯化方式对蒜头果蛋白进行提取纯化,萃取条件温和,收率高达90%以上,同时蛋白质能够保留非常高的活性,且纯度也在90%以上,最高可达99.3%。

Description

一种蒜头果蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料加工领域,具体涉及一种蒜头果蛋白的制备方法。
背景技术
蒜头果( Malania oleifera Chun et S. Lee) 又名马兰后、咪民、猴子果、山桐果等,常绿乔木,属铁青树科( Olacaceae) 蒜头果属,是我国特有单种属稀有植物。蒜头果是国家二级保护树种,广西重点保护野生植物,仅分布于广西西部和云南东南部的狭窄地带,生长于石灰岩的山坡、山脚杂木林中土壤湿润肥沃的地方。国外无蒜头果资源也未见有关蒜头果的研究报道,国内植物学家对蒜头果研究的历史也很短,直到 1980 年,广西植物研究所的李树刚教授才正式发表蒜头果的拉丁名为 Malania oleifera,并将其置于铁青树科。
杨敏采用粉碎、磷酸盐缓冲溶液浸提、硫酸铵沉淀、疏水色谱层析等分离手段,从蒜头果种仁中分离纯化蒜头果蛋白,并对其相对分子质量、氨基酸组成、等电点、中性糖含量、自由巯基含量、细胞活性等进行分析。结果表明:蒜头果蛋白是一种糖蛋白,含有18种氨基酸,等电点为4. 6,相对分子质量为61 875 Da,由A、B 2条链通过二硫键连接而成,蒜头果蛋白对Hela和Vero细胞具有强烈的细胞毒性。袁燕等对蒜头果的蛋白进行了研究,蒜头果种子经粉碎、抽提、硫酸铵沉淀、疏水层析等步骤得到一种蛋白质-蒜头果蛋白(malanin),样品中不加声疏基乙醇处理,经SDS-PAGE电泳显示单一条带,其分子量为55kD左右;加入声疏基乙醇后有两个条带,分子量分别为30kD(A链)和23 kD(B链)左右,A,B链的N一末端序列分别是NH2-D-E-T-X-T-D-E-E-F-N(X一般情况下为C)和NH2-D-Y-P-K-L-T-F-T-T-S。体外抑制肿瘤细胞活性测试表明,蒜头果蛋白对人宫颈癌细胞(Hela细胞)具有较强的毒性,IC50为1.26×10-9mol/L。
目前对蒜头果蛋白的研究相对较少,纯化的方式多采用传统的盐析、有机溶剂沉淀等方式,传统的方式非常容易导致蛋白质变性,提取出的蛋白活性不高。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于提出一种蒜头果蛋白的制备方法,通过采用两相萃取的方式,萃取条件温和,收率高,蛋白质能够保留非常高的活性,且纯度在90%以上。
为了达到上述目的,本方案采取以下技术方案:
一种蒜头果蛋白的制备方法,包括以下步骤:
(1)蛋白质提取,提取方式为蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,得提取液,打浆温度为4-8℃,离心速度为4000-12000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍;
(2)提取液中加入有机溶剂和无机盐,搅匀,调节pH,收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液;
(4)将截留液上凝胶柱,洗脱,收集活性成分。
作为优选,步骤(2)中所述的有机溶剂为PEG、乙醇、甲醇、异丙醇中的一项或几项,无机盐为磷酸氢二钾、碳酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵及柠檬酸铵中的一种或几项。
作为优选,步骤(2)中所述的有机溶剂的添加量为16-24%,无机盐的添加量为16-18%。
作为优选,步骤(2)中所述的pH值为4-8,使用的调节剂为浓度为0.5-1mol/L的盐酸。
作为优选,步骤(2)中收集的富集相为上相,收集的温度为4-30℃。
作为优选,步骤(3)中所述的膜过滤采用的膜的孔径为1nm-0.05μm,操作压力为0.1-0.5 Mpa。
作为优选,步骤(4)中所述的凝胶柱的型号为sephades G-75,洗脱液为50-60mmol/L tris-HCl,收集活性部分为第II和III部分。
作为优选,所述的活性部分采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为-50-10℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
与现有技术相比,本发明具备的有益效果是:
本发明通过采用两相萃取的提取纯化方式对蒜头果蛋白进行提取纯化,萃取条件温和,收率高达90%以上,同时蛋白质能够保留非常高的活性,且纯度也在90%以上,最高可达99.3%。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述项的,而不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
在本实施例中,通过以下方法制备蒜头果蛋白,具体包含以下步骤:
(1)蒜头果蛋白质的提取:蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,即为提取液,其中,打浆温度为4℃,离心速度为4000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍;
(2)提取液中加入16wt%的PEG2000和16wt%的磷酸氢二钾,搅匀,使用浓度为0.5mol/L的盐酸调节pH为4,在4℃下收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液,其中,膜过滤采用的膜的孔径为0.05μm,操作压力为0.1 Mpa;
(4)将截留液上型号为sephades G-75的凝胶柱,洗脱,洗脱液为50 mmol/L tris-HCl,收集活性成分为第II和III部分,采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为-50℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
经测定,蒜头果蛋白的收率达到90.3%,蛋白质保留非常高的活性,且纯度为98.3%。
实施例2
在本实施例中,通过以下方法制备蒜头果蛋白,具体包含以下步骤:
(1)蒜头果蛋白质的提取:蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,即为提取液,其中,打浆温度为5℃,离心速度为6000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍;
(2)提取液中加入18wt%的乙醇和17wt%的碳酸钠,搅匀,使用浓度为0.7mol/L的盐酸调节pH为5,在10℃下收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液,其中,膜过滤采用的膜的孔径为50nm,操作压力为0.2 Mpa;
(4)将截留液上型号为sephades G-75的凝胶柱,洗脱,洗脱液为55 mmol/L tris-HCl,收集活性成分为第II和III部分,采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为-20℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
经测定,蒜头果蛋白的收率达到90.7%,蛋白质保留非常高的活性,且纯度为98.9%。
实施例3
在本实施例中,通过以下方法制备蒜头果蛋白,具体包含以下步骤:
(1)蒜头果蛋白质的提取:蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,即为提取液,其中,打浆温度为6℃,离心速度为8000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍;
(2)提取液中加入20wt%的甲醇和17wt%的柠檬酸钠,搅匀,使用浓度为0.5-1mol/L的盐酸调节pH为6,在20℃下收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液,其中,膜过滤采用的膜的孔径为300nm,操作压力为0.3 Mpa;
(4)将截留液上型号为sephades G-75的凝胶柱,洗脱,洗脱液为55 mmol/L tris-HCl,收集活性成分为第II和III部分,采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为-10℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
经测定,蒜头果蛋白的收率达到90.7%,蛋白质保留非常高的活性,且纯度为99.1%。
实施例4
在本实施例中,通过以下方法制备蒜头果蛋白,具体包含以下步骤:
(1)蒜头果蛋白质的提取:蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,即为提取液,其中,打浆温度为8℃,离心速度为12000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍;
(2)提取液中加入24wt%的异丙醇和18wt%的硫酸铵,搅匀,使用浓度为0.5-1mol/L的盐酸调节pH为8,在30℃下收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液,其中,膜过滤采用的膜的孔径为0.05μm,操作压力为0.5 Mpa;
(4)将截留液上型号为sephades G-75的凝胶柱,洗脱,洗脱液为60 mmol/L tris-HCl,收集活性成分为第II和III部分,采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为10℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
经测定,蒜头果蛋白的收率达到91.0%,蛋白质保留非常高的活性,且纯度为99.3%。
对比例1
本实施例采用采用实施例1中的提取方法进行提取,并采用传统的盐析法进行纯化,经测定,蒜头果蛋白的收率达到90.3%,蛋白质活性较低,纯度为94.2%。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的蒜头果蛋白的制备方法,但本发明并不局限于上述具体步骤,任何包含实施例中所述步骤或者对本发明的原料进行替换,添加辅助成分,改变具体处理量,改变具体操作模式等做法,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)蛋白质提取;
(2)提取液中加入有机溶剂和无机盐,搅匀,调节pH,收集富集相;
(3)收集到的富集相,采用膜过滤,收集截留液;
(4)将截留液上凝胶柱,洗脱,收集活性成分。
2.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的蛋白质提取方式为蒜头果加入水低温打浆,离心获得上清液,沉淀中再次加水打浆,离心获得上清液,合并两次上清液,即为步骤(2)中所述的提取液。
3.根据权利要求2所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:所述的打浆温度为4-8℃,离心速度为4000-12000rpm,加入的水量为蒜头果果肉重量的10倍。
4.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的有机溶剂为PEG、乙醇、甲醇、异丙醇中的一项或几项,无机盐为磷酸氢二钾、碳酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵及柠檬酸铵中的一种或几项。
5.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的有机溶剂的添加量为16-24%,无机盐的添加量为16-18%。
6.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的pH值为4-8,使用的调节剂为浓度为0.5-1mol/L的盐酸。
7.根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中收集的富集相为上相,收集的温度为4-30℃。
8. 根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的膜过滤采用的膜的孔径为1nm-0.05μm,操作压力为0.1-0.5 Mpa。
9. 根据权利要求1所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(4)中所述的凝胶柱的型号为sephades G-75,洗脱液为50-60 mmol/L tris-HCl,收集活性部分为第II和III部分。
10.根据权利要求9所述的一种蒜头果蛋白的制备方法,其特征在于:所述的活性部分采用蒸馏水透析,收集透析内液低温冷冻干燥,温度为-50-10℃,即得高纯度蒜头果蛋白。
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