CN109043117B - 一种酸性澳洲坚果糖蛋白及其生产方法 - Google Patents

一种酸性澳洲坚果糖蛋白及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酸性澳洲坚果糖蛋白及其生产方法。所述的生产方法主要包括向脱脂油粕中加水煮沸，在沉淀物中加入碱溶液提取糖蛋白，通过酸度梯度沉淀分离技术分离酸性蛋白，再经脱水、干燥后即得所述的澳洲坚果酸性糖蛋白。该方法充分利用了澳洲坚果的油粕资源，生产工艺简单，纯化方法易操作，产品纯度高达96％以上，进一步提高了资源利用率，又减少废物排放。本发明还提供了一种糖蛋白产品，具有抗氧化、增殖益生菌等生物活性。同时，还提供了一种澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的联产方法，可从脱脂油粕中简便、高效地获得澳洲坚果蛋白质、中性多糖和酸性糖蛋白三种产品，工艺简单，易于生产推广，具有良好的应用前景。

Description

一种酸性澳洲坚果糖蛋白及其生产方法
技术领域
本发明属于农产品深加工领域，特别涉及一种酸性澳洲坚果糖蛋白及其生产方法。
背景技术
澳洲坚果(Macadamia ternifolia F.Muell)，又称夏威夷果、澳洲核桃，昆士兰果等，为山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia)双子叶常绿乔木，原产于澳大利亚昆士兰与新南威尔士的亚热带雨林。我国已栽培300多万亩澳洲坚果，今后五年的栽培规模栽规模还会逐年增加。澳洲坚果仁营养丰富，风味独特优雅，被称为“干果皇后”。
果仁除主要用作干果食用外，因其油脂含量高(约占果仁重量的80％)，其油脂具有抗氧化、预防糖尿病、预防和减少心血管疾病发生等营养与保健作用，因而其油脂在某些化妆品、保健食品等行业中有着不可替代的作用。因此，每年仍有一定量的澳洲坚果用于油脂加工；同时产生大约25～30％的油粕。但目前，该油粕的价值未被开发利用，大多作为肥料或饲料使用。
专利文献CN 103652313 A、CN 103719531 A、ZL201410522940.7都涉及到了以低温提油后的澳洲坚果油粕和水为原料提取、生产蛋白质或(和)多糖的方法，但获得上述产品之后，还剩余30～50％(W/W，以油粕计)的残渣，这些技术中均未提及这些残渣的应用。实际上，这些残渣还含有许多有价值的活性成分，有必要研究、开发利用这些有价值成分的新技术，以充分利用油粕资源、减少浪费和环境污染。
即有必要研究上述提取多糖和蛋白后的残渣中的活性成分与其利用方法，以获取进一步提高澳洲坚果油粕利用率生产技术。
发明内容
本发明的首要目的在于克服上述技术的缺点，利用澳洲坚果油粕生产蛋白质、中性多糖后的残渣，生产可溶于碱性溶液的酸性糖蛋白产品，以提高澳洲坚果资源的利用率，即：提供一种澳洲坚果酸性糖蛋白的生产方法。
本发明的另一目的在于提供通过所述的生产方法得到的一种酸性澳洲坚果糖蛋白，发明人成功获得了一种新的糖蛋白(即本发明所述的酸性糖蛋白)并对其进行了研究，所述的酸性糖蛋白具有抗氧化作用。
本发明的又一目的在于提供一种联产澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，包括如下步骤：
(1)脱油：澳洲坚果经脱脂工艺后制成脱脂油粕；所述的脱脂油粕经粉碎、过筛后待用；
(2)去除油粕中的多糖和蛋白质：向步骤(1)得到的脱脂油粕中加入相当于脱脂油粕质量8～30倍的水，加热煮沸0.1～1h进行提取后固液分离，得到第一上清液和残渣；
(3)提取酸性糖蛋白：向前述残渣中加入相当于其质量8～20倍的pH 8～ 13的碱溶液进行提取，获得含有糖蛋白的碱性提取液，经固液分离后得到第二上清液和第二沉淀物，第二上清液即为酸性糖蛋白提取液；
(4)分离酸性糖蛋白：向第二上清液中加入食用酸溶液调节其pH至4.3～ 4.7，以期进一步除去酸性糖蛋白提取液中含有少量的中性蛋白杂质，经固液分离得到第三上清液，再次加入食用酸溶液调节第三上清液pH为<3.5，再经固液分离获得沉淀物，所述沉淀物经过脱水、干燥后即得所述的澳洲坚果酸性糖蛋白。
步骤(1)中所述的脱脂工艺包括本领域常规的生产工艺，如压榨、浸渍、低温超临界流体萃取等，提取澳洲坚果所含有的油脂。例如，将澳洲坚果干燥、去壳后经压榨脱脂，或者将澳洲坚果粉碎后于有机溶剂中萃取，获得的固态物即为油粕。油粕中的残油越低越好。
步骤(1)中所述的过筛优选为过20～80目筛。
步骤(1)中所述的澳洲坚果优选为无虫蛀、腐烂的带壳澳洲坚果。
步骤(2)、(3)、(4)中所述的固液分离的方式优选为静置分离或离心分离。
当步骤(3)的固液分离方法为离心分离时，离心的转速优选为小于4000rpm。
步骤(3)中所述的提取优选为加热提取，可进一步加快提取过程，提高生产效率。所述的加热提取的时间优选为0.5～2h；所述的加热优选为加热至沸腾并保温。
步骤(3)中所述的碱溶液优选为食用级的弱碱溶液；进一步优选为碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液的至少一种。
步骤(3)中第二沉淀物还可以相同方法重复提取1～3次，收集并混匀所有含有糖蛋白的碱性提取液进行后续步骤。
步骤(4)所述食用酸优选为柠檬酸、苹果酸、乳酸、食用盐酸、富马酸、磷酸、琥珀酸、酒石酸和酒石酸氢钾中的至少一种。
步骤(4)中，向第二上清液中加入食用酸溶液调节其pH优选调节至4.5；加入食用酸溶液调节第三上清液pH优选调节至pH＝3.0。
一种酸性澳洲坚果糖蛋白，通过所述生产方法制备得到。所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的纯度大于或等于96％。本发明实施例所制得的产品经测定其理化特征主要有：分子质量为420～520kD，其含多糖50～60％(W/W)、蛋白质33～40％ (W/W)；鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比约为1:2:4:6；具有较好的清除DPPH自由基和还原力，因而具有较好的体外抗氧化作用。
一种澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的联产方法，包括如下步骤：
(1)脱油：澳洲坚果经脱脂工艺后制成脱脂油粕；所述的脱脂油粕经粉碎、过筛后待用；
(2)获得物料：向步骤(1)得到的脱脂油粕中加入相当于脱脂油粕质量8～ 30倍的水，加热煮沸0.1～1h进行提取后固液分离，得到第一上清液和第一沉淀物；
(3)制备蛋白质：将第一上清液进行浓缩，调节pH至4.3～4.7，静置，使蛋白在等电点附近变性沉淀，直到开始出现沉淀，再经固液分离得到第二上清液和第二沉淀物，第二沉淀物经干燥、粉碎，即得所述的蛋白质；
(4)制备中性多糖：调节第二上清液的pH至中性，经浓缩、干燥后得到中性多糖；
(5)提取酸性糖蛋白：向第一沉淀物中加入相当于第一沉淀物质量8～20 倍的pH8～13的碱溶液，加热0.5～2h，获得含有糖蛋白的碱性提取液，经固液分离后得到第三上清液和第三沉淀物，第三上清液即为酸性糖蛋白提取液；
(6)分离酸性糖蛋白：向第三上清液中加入食用酸溶液调节其pH至4.3～ 4.7，经固液分离得到第四上清液，加入食用酸溶液调节第四上清液pH为<3.5，再经固液分离获得沉淀物，所述沉淀物经过脱水、干燥后即得所述的澳洲坚果酸性糖蛋白。
步骤(2)中所述的第一沉淀物还可以相同方法重复提取1～3次，收集并混匀所有提取液进行后续步骤。
步骤(2)中的加热煮沸操作之前，还可以先浸泡0.5～1.5h；进一步优选为浸泡1h。
步骤(3)中的调节pH优选为调节pH＝4.5。
步骤(4)中所述的浓缩优选为在60℃下，真空蒸发浓缩、去除水分。
步骤(4)中所述的干燥优选为喷雾干燥或冷冻干燥。
步骤(6)中，向第三上清液中加入食用酸溶液调节其pH优选调节至4.5；加入食用酸溶液调节第四上清液pH优选调节至pH＝3.0。
步骤(6)中所述的干燥优选为喷雾干燥或冷冻干燥。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，充分利用了澳洲坚果的油粕资源，使用生产中性多糖和蛋白质两种产品后的残渣，进一步生产得到一种新的酸性糖蛋白产品，本发明的生产工艺简单，纯化方法易操作，既不浪费资源、又减少废物排放，进一步提高了资源利用率。
(2)本发明所得到的酸性澳洲坚果糖蛋白为一种新型的物质资源，具有抗氧化、增殖益生菌等生物活性。
(3)本发明的制备方法采用的酸度梯度沉淀分离蛋白质技术，酸性澳洲坚果糖蛋白的得率为2.0～2.5％(w/w，以干澳洲坚果油粕计)，具有操作简单、所获产品纯度高(纯度高达96％以上)等优点。
(4)本发明还提供了一种澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的联产方法，可从脱脂油粕中简便、高效地获得澳洲坚果蛋白质、澳洲坚果中性多糖和澳洲坚果酸性糖蛋白三种产品，工艺简单，易于生产推广，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明生产澳洲坚果糖蛋白的工艺路线图。
图2是实施例2所获的酸性澳洲坚果糖蛋白的单糖组成色谱图。
图3是实施例2所获酸性澳洲坚果糖蛋白紫外-可见吸收光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取将无虫蛀、腐烂的带壳澳洲坚果250Kg，经干燥、去壳后的果仁约为100 Kg，经压榨机榨油脱脂后获得油粕约25Kg；将油粕风干并粉碎过40目筛后，再用约200Kg水浸泡约1h，快速加热至沸腾，维持1h后取出提取液；残渣按照该方法重复提取2次，收集上述三次提取液后，调节pH至4.3，静置得沉淀的蛋白质，再经离心、收集沉淀、干燥后，即获得的蛋白质产品。沉淀蛋白质后的上清液，经调节pH至中性后，将其在60℃真空蒸发浓缩至含水量70％以下，经喷雾干燥或冷冻干燥后获得中性多糖。
将上述提取剩余的残渣，加入约8倍(w/v)的pH 13的苏打水溶液，加热至沸并保温2h，获得含有酸性糖蛋白的碱性提取液；然后按照上述方法再重复提取2次；收集三次酸性糖蛋白提取液，经小于4000rpm的离心去除残渣后，加入柠檬酸(或乳酸等食用酸)调节pH4.5，静置澄清，离心取上清液，再继续向所述上清液加入柠檬酸调节pH<3.5，再静置分离或离心分离，收集沉淀，经脱水、干燥后，即获得酸性糖蛋白产品，得率约为2.3％(以干燥油粕计)。
实施例2
取澳洲坚果油粕约25Kg；将油粕风干并粉碎过80目筛后，静置浸泡1小时，再用约750Kg水加热至沸，维持10分钟，冷却后取出分离出提取液；残渣按照该方法重复提取2次，收集所有提取液后，调节pH至4.5至有浑浊出现，再经离心(<4000rpm)、收集沉淀、干燥后，即获得的蛋白质产品。沉淀蛋白质后的上清液，用苏打调节pH至中性后，将其在60℃真空蒸发浓缩至含水量70％以下、经喷雾脱水干燥或冷冻干燥后获得中性多糖。
然后向经上述提取后的残渣再加入约20倍(w/v)的pH 10的小苏打水溶液，加热至沸并保温2h，获得含有糖蛋白的碱性提取液；然后按照上述方法再将残渣重复提取2次；收集三次糖蛋白提取液，经离心去除残渣后，按照实施例1所述的方法获得酸性糖蛋白，其得率为2.5％(w/w)。
实施例3
取云南某澳洲坚果企业采用低温超临界二氧化碳为溶剂提取油脂后的油粕25Kg，经干燥后，粉碎过20目筛后，再用约300Kg水加热至沸，维持0.5h，冷却后取出分离出提取液；残渣按照该方法重复提取2次，收集所有提取液后，按照实施例1的方法获得中性多糖和蛋白质。然后残渣再加入约20倍(w/v)的pH 8的小苏打水溶液，加热至沸并保温1.5h，获得含有糖蛋白的碱性提取液；然后按照上述方法再将残渣重复提取2次；收集三次糖蛋白提取液，经离心去除残渣后，按照实施例1所述的方法获得酸性糖蛋白，得率为2.4％(w/w)。
效果实施例
1.HPLC鉴定纯度和测定分子量
将色谱纯葡萄糖、T-5、T-40、T-200、T-2000葡聚糖均用双蒸水配5g/L多糖分子量标样，经0.45μm滤膜过滤后进样。同时采用葡萄糖和T-2000葡聚糖标定 Vt和V0由保留时间Ve计算得到相应的分配系数Kav，Kav和Ve存在如下关系：
Figure RE-GDA0001809516370000061
以分子量的对数(lgMw)为横坐标，Kav为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程为：y＝-0.2075x+1.2825，R2＝0.985(n＝5)。同时将澳洲坚果糖蛋白进样，根据保留时间计算相对分子质量。
色谱条件：色谱柱为PolySep-GFC-P4000柱(7.8×300mm)，流动相为纯水，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测器为ELSD蒸发光散射检测器。
图2为实施例2所获的酸性澳洲坚果糖蛋白的单糖组成色谱图。
结果分析显示，本发明得到的酸性澳洲坚果糖蛋白的分子质量为420～520 kD，具体地，实施例1、2、3得到的酸性澳洲坚果糖蛋白的分子质量分别为420 kD、473kD、510kD；三个实施例所获酸性多糖，其组成均为鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比约为1:2:4:6，因其不含葡萄糖，不被消化道的糖化酶水解，因此有可能被肠道微生物水解而具有增殖肠道益生菌的功能。
通过凝胶色谱对蛋白纯度进行检测，结果显示，实施例1、2、3得到的酸性澳洲坚果糖蛋白的纯度分别为96％，96％，96.5％。
2.糖蛋白中多糖和蛋白含量的测定
(1)蛋白含量测定采用2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法(BCA法)：见邵泓,吕晶, 陈钢.蛋白质含量测定方法的规范化研究[J].中国药品标准,2011,12(02):135-138。
(2)总糖含量测定采用苯酚硫酸法：见张惟杰.糖复合物生化研究技术[M]，浙江大学出版社，1994，第16页。
经测定，实施例1～3得到的酸性澳洲坚果蛋白中糖与蛋白质的组成情况如表1所示，由表1可知，本发明得到的澳洲坚果糖蛋白含多糖50～60％(w/w)、蛋白质33～40％(w/w)。
表1
Figure RE-GDA0001809516370000071
3.体外抗氧化活性的测定
通过测定总还原能力、清除DPPH自由基能力对实施例提取纯化的酸性澳洲坚果糖蛋白的抗氧化能力进行评定，DPPH自由基清除率的测定采用DPPH法[石思迷，晏日安，黄雪松等.大蒜多糖对几种自由基的影响[J].食品科技,2008(9): 169-170,173]，总还原力的测定采用铁氰化钾法[董燕婧,程访,许小珍等.白及内生真菌的分离鉴定及其胞外多糖的抗氧化活性分析[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(14):24-28]，以上测定均采用维生素C作为对照，并按照以下公式进行计算：
Figure RE-GDA0001809516370000072
公式中：Aj为对照品吸光度；Ai为样品吸光度。
结果表明，本发明实施例1、2、3所获得的酸性澳洲坚果糖蛋白，在同等条件下，与维生素C相比，其清除DPPH自由基能力分别为维生素C的78％、80％、 82％，还原力为维生素的三分之一，显示其具有较好的抗氧化作用。
4.酸性糖蛋白紫外-可见光吸收光谱的测定
将实施例中酸性澳洲坚果糖蛋白分别配成浓度为0.5g/L的溶液，在紫外可见分光光度计上于200～800nm处进行扫描图。实施例2制得的酸性澳洲坚果糖蛋白的结果如图3所示，实施例1与实施例3的结果与之类似。由该图可以看出，该产品在260nm附近有较小的吸收峰，而多糖部分在该图中未显示多糖特征吸收峰。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脱油：澳洲坚果经脱脂工艺后制成脱脂油粕；所述的脱脂油粕经粉碎、过筛后待用；
(2)去除油粕中的多糖和蛋白质：向步骤(1)得到的脱脂油粕中加入相当于脱脂油粕质量8～30倍的水，加热煮沸0.1～1h进行提取后固液分离，得到第一上清液和残渣；
(3)提取酸性糖蛋白：向前述残渣中加入相当于其质量8～20倍的pH 8～13的碱溶液进行提取，获得含有糖蛋白的碱性提取液，经固液分离后得到第二上清液和第二沉淀物；
(4)分离酸性糖蛋白：向第二上清液中加入食用酸溶液调节其pH至4.3～4.7，经固液分离得到第三上清液，再次加入食用酸溶液调节第三上清液pH为<3.5，再经固液分离获得沉淀物，所述沉淀物经过脱水、干燥后即得所述的澳洲坚果酸性糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的碱溶液为食用级的弱碱溶液；
步骤(2)、(3)、(4)中所述的固液分离的方式为静置分离或离心分离；
步骤(3)中所述的加入碱溶液进行提取为加热提取。
3.根据权利要求2所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的碱溶液为碳酸钠溶液和碳酸氢钠溶液的至少一种；
当步骤(3)的固液分离方法为离心分离时，离心的转速为小于4000rpm；
所述的加热提取的时间为0.5～2h；
所述的加热为加热至沸腾并保温。
4.根据权利要求1所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的过筛为过20～80目筛；
步骤(1)中所述的澳洲坚果为无虫蛀、腐烂的带壳澳洲坚果。
5.根据权利要求1所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于：
步骤(3)中第二沉淀物以相同方法重复提取1～3次，收集并混匀所有含有糖蛋白的碱性提取液进行后续步骤；
步骤(4)中，向第二上清液中加入食用酸溶液调节其pH调节至4.5；加入食用酸溶液调节第三上清液pH调节至pH＝3.0。
6.根据权利要求1所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法，其特征在于：
步骤(4)所述食用酸为柠檬酸、苹果酸、乳酸、食用盐酸、富马酸、磷酸、琥珀酸、酒石酸和酒石酸氢钾中的至少一种。
7.一种酸性澳洲坚果糖蛋白，其特征在于：
通过权利要求1～6任一项所述的酸性澳洲坚果糖蛋白的生产方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的酸性澳洲坚果糖蛋白，其特征在于：
所述的酸性澳洲坚果糖蛋白分子质量为420～520kD；
含多糖50～60％(w/w)，蛋白质33～40％(w/w)；
其中鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为1:2:4:6。
9.一种澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的联产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脱油：澳洲坚果经脱脂工艺后制成脱脂油粕；所述的脱脂油粕经粉碎、过筛后待用；
(2)获得物料：向步骤(1)得到的脱脂油粕中加入相当于脱脂油粕质量8～30倍的水，加热煮沸0.1～1h进行提取后固液分离，得到第一上清液和第一沉淀物；
(3)制备蛋白质：将第一上清液进行浓缩，调节pH至4.3～4.7，静置，使蛋白在等电点附近变性沉淀，再经固液分离得到第二上清液和第二沉淀物，第二沉淀物经干燥、粉碎，即得所述的蛋白质；
(4)制备中性多糖：调节第二上清液的pH至中性，经浓缩、干燥后得到中性多糖；
(5)提取酸性糖蛋白：向第一沉淀物中加入相当于第一沉淀物质量8～20倍的pH 8～13的碱溶液，加热0.5～2h，获得含有糖蛋白的碱性提取液，经固液分离后得到第三上清液和第三沉淀物；
(6)分离酸性糖蛋白：向第三上清液中加入食用酸溶液调节其pH至4.3～4.7，经固液分离得到第四上清液，再次加入食用酸溶液调节第四上清液pH为<3.5，再经固液分离获得沉淀物，所述沉淀物经过脱水、干燥后即得所述的澳洲坚果酸性糖蛋白。
10.根据权利要求9所述的澳洲坚果蛋白质、中性多糖、酸性糖蛋白的联产方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的第一沉淀物以相同方法重复提取1～3次，收集并混匀所有提取液进行后续步骤；
步骤(2)中的加热煮沸操作之前，先浸泡0.5～1.5h；
步骤(4)中所述的浓缩为在60℃下，真空蒸发浓缩、去除水分；
步骤(4)或(6)中所述的干燥为喷雾干燥或冷冻干燥；
步骤(6)中，向第三上清液中加入食用酸溶液调节其pH调节至4.5；加入食用酸溶液调节第四上清液pH调节至pH＝3.0。
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