CN1814621A

CN1814621A - 用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质

Info

Publication number: CN1814621A
Application number: CN 200510010633
Authority: CN
Inventors: 戴晓畅; 毛宇; 黄晓麒; 吴凯
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2006-08-09

Abstract

一种用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质，以铁青树科蒜头果树(Malania oleifera Chunet S. K. Lee)的果实蒜头果中提取的蒜头果蛋白质或其可药用盐为活性成分，或使用含有此活性成分的药物或药物组合物治疗人类癌症；蒜头果蛋白质的制备方法包括以下步骤：将蒜头果在不高于4℃的低温条件下捣碎，过滤，上清液用30％～100％硫酸铵分级沉淀，透析，再通过蛋白质分离专用的色谱仪器纯化，获得SDS－PAGE电泳纯度的样品。本发明为临床治疗癌症病人提供了一种全新的药物或药物组合物。

Description

用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质

技术领域本发明涉及一种用于人类癌症治疗的蛋白质药物，尤其是一种用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质。

背景技术蒜头果是国家二级保护植物铁青树科蒜头果树(Malania oleifera Chun etS.K.Lee)的果实，因为其形状象大蒜头而得名，主要分布于广西西部和云南东南部的狭窄地带，生长于石灰岩的山坡、山脚杂木林中土壤湿润肥沃的地方，在桂西南垂直分布于海拔300～1200米，在滇东南可达海拔1640米。蒜头果种仁含油率高达51.85％～67.0％，成分主要为油酸、棕榈酸和硬脂酸等，是良好的木本油料植物，其油脂可作润滑油和制作肥皂的原料，也可用作食用，同时，又是合成麝香酮的理想原料，具有较高的经济价值。它的木材纹理直，结构细，材质中等，不易翘裂，易加工，可作为家具、船舶、雕刻及建筑用材等。

蒜头果树是我国的特有属，仅分布于广西西部和云南东南部的狭窄地带。国外没有蒜头果植物资源，未见有关蒜头果的研究报道。在国内，对蒜头果研究的历史也很短，研究的报道也较少。1973年，在《中国油脂植物手册》和《云南经济植物》中，蒜头果树虽然已被置于樟科和茶茱萸科，但还没有合格的拉丁学名。直到1980年，广西植物研究所的李树刚教授才正式发表蒜头果的拉丁名：Malania oleifera，并将它置于铁青树科。本世纪80年代，植物化学研究者发现，蒜头果种仁中含油率高达51.85％～67.0％，其油脂中的脂肪酸具有较高的医用价值，因此，在广西被列为综合开发重要经济树种。

发明内容本发明提供一种用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质，它以铁青树科蒜头果树(Malania oleifera Chun et S.K.Lee)的果实蒜头果中提取的蒜头果蛋白质或其可药用盐为活性成分，或使用含有此活性成分的药物或药物组合物治疗人类癌症。本发明为临床治疗癌症病人提供了一种全新的药物或药物组合物。所述蛋白质由A、B两条多肽链组成，分子量大约在55kD，其中，A链分子量约32kD，N-端氨基酸序列是：NH₂-D-E-T-X-T-D-E-E-F-N-(X一般情况下为C)，B链分子量约23kD，N-端序列是：NH₂-D-Y-P-K-L-T-F-T-T-S-，两条多肽链之间由二硫键共价连接。在体外实验条件下，此蛋白质样品对人类多种癌细胞系具有强烈的抑制活性，其IC₅₀达到10^-9mol/L水平。

所述蒜头果蛋白质的制备方法，该方法包括以下步骤：将蒜头果在不高于4℃的低温条件下捣碎，过滤，上清液用30％～100％硫酸铵分级沉淀，透析，再通过蛋白质分离专用的色谱仪器纯化，获得SDS-PAGE电泳纯度的样品。

可以依据医学临床实践，以蒜头果蛋白质为活性成份用于治疗人类癌症的药物组合物，其中含有治疗有效剂量的蛋白质或其可药用盐，需要时可与其他有药物活性的物质或在治疗上可以配伍的敷料配伍使用。

所述的蛋白质或其可药用盐，按药学上可以接受的公知方法制成制剂形式。

以下对本发明提出的蒜头果蛋白质作详细阐述：

1.蒜头果蛋白质的分离、纯化：将蒜头果去外壳和表皮，用预先冷却的20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液(内加1mM EDTA和1mM巯基乙醇)在高速组织捣碎机里捣碎后，再用超声波细胞粉碎机处理30分钟，用4层纱布过滤，高速冷冻离心机离心(HITACHI CR21G 8000rpm，30分钟，4℃)，去除固体物，上清液用30％～100％硫酸铵分级沉淀，冷冻离心，得到高盐蛋白质沉淀，把分级沉淀得到的初提物样品采用透析袋法脱盐，用电导仪控制平衡溶液的电导率，当电导率低于2ms/cm即可，样品溶液经真空冷冻干燥机干燥，得到白色真空冷冻干燥蛋白质样品，此蛋白质样品再经过蛋白质纯化系统(Amersham KTA Explorer 100，采用Hiprep^TMphenyl FF层析柱)进一步纯化，蛋白质电泳系统(Amersham Hoefer SE260)检测，获得SDS_PAGE单一条带纯度蛋白质样品。

2.蒜头果蛋白质部分结构鉴定——A、B链N-末端测序：先做SDS-PAGE电泳，加入2-巯基乙醇按Laemmli方法进行，采用Bio-Rad电泳系统中的微型电泳槽(10cm×8cm×1.5mm)，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为3.0％，然后用湿法电转至PVDF膜上。

电印迹程序为：电泳结束后卸下凝胶置于CAPS缓冲液浸泡2min，同时将测序级PVDF膜在无水甲醇中浸15s，再移至CAPS缓冲液中，迅速将Bio-Rad印迹用的两块海绵和裁好的4张与凝胶大小一致的滤纸在CAPS缓冲液中浸泡。然后按常规电印迹方法^[22]，以转膜夹的阳极板上依次放入海绵1块、滤纸2张、适当大小的PVDF膜、电泳后的凝胶、滤纸2张、海绵1块，特别要注意排除滤纸、PVDF膜、凝胶之间的气泡，然后合上转膜夹，按转膜设备使用书上的要求安装好转膜装置，注意转膜夹的正负极一定要安放正确，否则蛋白质就不能转移至PVDF膜上。接通电源(恒流150mA)，5h后转膜结束，取出PVDF膜，将有蛋白质的一面朝上，用去离子水冲洗3次，将PVDF膜切出两孔，置于专用染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250、1％冰醋酸、40％甲醇)中，在室温条件下染色2～5min，目标带刚刚显现即终止染色。再将染色过的PVDF膜置于50％甲醇中漂洗脱色5～10min，并不断更换脱色液，脱色过程中应时时注意脱色程度，目标带一旦清晰可见且背景满意即可终止脱色。将PVDF膜置于新的干净滤纸上晾干后，与未染色的PVDF膜对照，用新的单面刀片切下未染色的PVDF膜上的两个亚基条带，上面分子量大(约30kD)的条带标记为A链，下面分子量小的标记为B链(约23kD)。将A链和B链分别在1.5ml的eppendorf管中密封保存，用于A、B链的N-末端测序。

3.蒜头果蛋白质活性测定：

1)蒜头果蛋白质细胞活性测定：将Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)和人癌细胞系在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下的培养箱中培养24小时。同时，将蒜头果蛋白质冻干粉配成工作浓度为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml，在无菌室的超净工作台上用一次性过滤器(0.22um)过滤除菌后，点样(50ul/孔)，继续在培养箱中培养1天后，观察结果。

2)蒜头果蛋白质体外抑制癌细胞活性的测定

用MTT比色法测定人类癌细胞系的ID₅₀。具体操作如下：

(1)细胞培养

细胞在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养24小时。

(2)MTT溶液的配制

四甲基偶氮唑盐[MTT，3-dimethyl-2-thiazolyl-2，5-diphenyl tetrazolium bromide]溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为50mg/ml，过滤除菌后，于4℃避光保存，使用前用含10％小牛血清的DMEM培养液稀释至5mg/ml。

(3)样品的处理

样品是经疏水层析纯化后，收集活性峰的部分，经BCA蛋白质检测方法测定其浓度为：4.79ug/ml。人血清白蛋白(68000Da)作为标准品，则此样品的实际浓度的换算方法为：(ug/ml)×10^-6/68,000×10^-3(mol/L)，故其浓度为：8.05735×10^-7mol/L。将此浓度的样品按4倍逐步稀释成8个浓度，取后6个浓度作为实验样品。即：稀释浓度＝原液浓度/4°(mol/L)(n＝3～8)。

例：浓度③为：8.05735×10^-7/4³＝1.259×10^-8mol/L；

浓度④为：8.05735×10^-7/4⁴＝3.147×10^-9mol/L等，依次类推。

(4)细胞死亡率的测定

癌细胞培养于96孔细胞培养板中(10⁴个)，在5％CO₂，37℃条件下培养24h后，每孔加入20ul不同浓度的稀释样品，6个平行复孔，培养72h后，吸除药液，每孔加入新配制的MTT溶液，37℃培育4h，吸去上清，每孔加入150ul二甲亚砜(DMSO)，振荡30min，在酶标仪(TECANSunrise)上测定OD₅₇₀。以有细胞而不加蛋白质的孔为对照孔；以不加细胞和培养基，只加MTT和DMSO的孔为空白孔，计算细胞死亡率。细胞死亡率按下式计算：

细胞死亡率IC(％)＝(1-OD_实验组/OD_对照组)×100％

(5)IC₅₀的测定

将纯化后的蒜头果蛋白质样品连续倍比稀释后，测定每个浓度的死亡率，以引起50％细胞死亡的最小蛋白质含量为IC₅₀。其计算公式为：

IC₅₀＝(1-实验组OD₅₀/对照组OD₅₀)×100％。

体外试验用细胞株：：①非洲绿猴肾细胞系(Vero)，②人宫颈癌细胞系(Hela)，③早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)，④人乳腺癌细胞系(MCF-7)，⑤人肝癌细胞系(Bel-4702)，⑥人肺癌细胞系(SPC-A1)。

附图说明图1是本发明的蒜头果蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱。

图中：1是加入巯基乙醇处理的蒜头果粗蛋白；2是加入巯基乙醇处理的蒜头果蛋白质；3中纯化的蒜头果蛋白质；4是未加入巯基乙醇处理的蒜头果粗蛋白；5是标准蛋白质分子量。A为分子量大的条带标记链，B为分子量小的条带标记链。

具体实施方式下面结合实施例作进一步说明：

以下的实施例只是为了本领域的技术人员更全面地理解本发明，没有限制本发明之意。

实施例1：具有体外强烈抑制癌细胞活性的蒜头果蛋白质的制备

称取1kg蒜头果去外壳和表皮，用预先冷却的20mM pH 7.0磷酸盐缓冲液(内加1mM EDTA和1mM巯基乙醇)在高速组织捣碎机里捣碎后，再用超声波细胞粉碎机处理30分钟，用4层纱布过滤，高速冷冻离心机离心(HITACHI CR21G 8000rpm，30分钟，4℃)，去除固体物部分，上清液用30％～100％硫酸铵分级沉淀，冷冻离心，得到高盐蛋白质沉淀，把分级沉淀得到的初提物样品采用透析袋法脱盐，用电导仪控制平衡溶液的电导率，当电导率低于2ms/cm即可，样品溶液经真空冷冻干燥机干燥，得到白色冷冻干燥蛋白质样品，此蛋白质样品经过蛋白质纯化系统(Amersham KTA Explorer 100，采用Hiprep^TM phenyl FF层析柱)进一步纯化，蛋白质电泳系统(Amersham Hoefer SE260)检测，获得SDS-PAGE单一条带纯度蛋白质样品，详细结果见附图1。

实施例2：蒜头果蛋白质对人宫颈癌细胞系(Hela)体外抑制癌细胞活性测定

将人宫颈癌细胞(Hela)分别在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养，在正对数生长期将其酶解、消化，铺24孔板，每孔1ml，蒜头果蛋白质样品(浓度分别为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml)经0.22um膜过滤除菌后，各点50ul/孔，24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白质表现出对人宫颈癌细胞(Hela)非常强烈的细胞毒性，即使在0.1ug/ml的浓度下，人宫颈癌细胞(Hela)两天后全部死亡，依照前面描述的方法，经过数据处理，计算得到蒜头果蛋白质对人宫颈癌细胞系(Hela)的IC₅₀＝1.26×10^-9(mol/L)。

实施例3：蒜头果蛋白质对早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)体外抑制活性测定

将早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)分别在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养，在正对数生长期将其酶解、消化，铺24孔板，每孔1ml，蒜头果蛋白质样品(浓度分别为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml)经0.22um膜过滤除菌后，各点50ul/孔，24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白质表现出对早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)非常强烈的细胞毒性，即使在0.1ug/ml的浓度下，早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)两天后全部死亡，依照前面描述的方法，经过数据处理，计算得到蒜头果蛋白质对早幼粒急性白血病细胞系(HL-60)的IC₅₀＝6.17×10^-9(mol/L)。

实施例4：蒜头果蛋白质对人乳腺癌细胞系(MCF-7)体外抑制活性测定

将人乳腺癌细胞系(MCF-7)分别在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养，在正对数生长期将其酶解、消化，铺24孔板，每孔1ml，蒜头果蛋白质样品(浓度分别为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml)经0.22um膜过滤除菌后，各点50ul/孔，24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白质表现出对人乳腺癌细胞系(MCF-7)非常强烈的细胞毒性，即使在0.1ug/ml的浓度下，人乳腺癌细胞系(MCF-7)两天后全部死亡，依照前面描述的方法，经过数据处理，计算得到蒜头果蛋白质对人乳腺癌细胞系(MCF-7)的IC₅₀＝4.63×10^-9(mol/L)。

实施例5：蒜头果蛋白质对人肝癌细胞系(Bel-4702)体外抑制活性测定

将人肝癌细胞系(Bel-4702)分别在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养，在正对数生长期将其酶解、消化，铺24孔板，每孔1ml，蒜头果蛋白质样品(浓度分别为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml)经0.22um膜过滤除菌后，各点50ul/孔，24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白质表现出对人肝癌细胞系(Bel-4702)非常强烈的细胞毒性，即使在0.1ug/ml的浓度下，人肝癌细胞系(Bel-4702)两天后全部死亡，依照前面描述的方法，经过数据处理，计算得到蒜头果蛋白质对人肝癌细胞系(Bel-4702)的IC₅₀＝1.97×10^-9(mol/L)。

实施例6：蒜头果蛋白质对人肺癌细胞系(SPC-A1)体外抑制活性测定

将人肺癌细胞系(SPC-A1)分别在含有10％灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃，5％CO₂条件下培养，在正对数生长期将其酶解、消化，铺24孔板，每孔1ml，蒜头果蛋白质样品(浓度分别为50ug/ml，10ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml)经0.22um膜过滤除菌后，各点50ul/孔，24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白质表现出对人肺癌细胞系(SPC-A1)非常强烈的细胞毒性，即使在0.1ug/ml的浓度下，人肺癌细胞系(SPC-A1)两天后全部死亡，依照前面描述的方法，经过数据处理，计算得到蒜头果蛋白质对人肺癌细胞系(SPC-A1)的IC₅₀＝4.89×10^-9(mol/L)。

Claims

1、一种用于人类癌症治疗的蒜头果蛋白质，该蛋白质来源于铁青树科蒜头果树(Malaniaoleifera Chun et S.K.Lee)的果实，它由A、B两条多肽链组成，分子量大约在55kD，其中，A链分子量32kD，N-端氨基酸序列是NH₂-D-E-T-X-T-D-E-E-F-N-(X一般情况下为C)，B链分子量23kD，N-端序列是NH₂-D-Y-P-K-L-T-F-T-T-S-，A、B两条多肽链之间由二硫键共价连接。

2、如权利要求1所述蒜头果蛋白质的制备方法，该方法包括以下步骤：将蒜头果在不高于4℃的低温条件下捣碎，过滤，上清液用30％～100％硫酸铵分级沉淀，透析，再通过蛋白质分离专用的色谱仪器纯化，获得SDS-PAGE电泳纯度的样品。

3、以蒜头果蛋白质为活性成份用于治疗人类癌症的药物组合物，其中含有治疗有效剂量的权利要求1所述的蛋白质或其可药用盐，需要时可与其他有药物活性的物质或在治疗上可以配伍的敷料配伍使用。

4、如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，使用如权利要求1所述的蛋白质或其可药用盐，按药学上可以接受的公知方法制成制剂形式。