CN102675468A - 一种蚯蚓提取物及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蚯蚓提取物及其提取方法和应用，其中，提取物由以下方法提取获得：(1)粗多肽的制备：将冰冻蚯蚓1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水冲洗，至完全无血色为止；绞成肉泥，加入预冷的匀浆液，用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心，取上清；所得上清真空旋转蒸发回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；(2)粗多肽进行脱盐纯化，得到的冻干品即为蚯蚓多肽。本发明建立系统的蚯蚓多肽提取方法，通过该方法可以获得纯度及收率较高的活性蚯蚓多肽；证明蚯蚓多肽对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)所致大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)损伤具有保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种以蚯蚓成虫为原料提取具有很强生物活性的蚯蚓多肽，同时还涉及该蚯蚓多肽的提取方法和该蚯蚓多肽的应用，属于生物化学技术领域。
背景技术
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种中老年常见的神经系统退行性疾病，以黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元缺失和Lewy小体形成为其主要病理特征。随着我国人口老龄化进程的加快，PD发病率日益增高。目前绝大多数PD患者以药物治疗为主，虽能改善临床症状，但长期应用会出现“开-关”现象、运动及精神障碍等副作用，且仍无法延缓DA能神经元进行性变性。近年来药物治疗的研究由直接补充DA转向多环节作用，研究重点集中于对DA能神经元的保护作用及减少多巴制剂毒副作用上，但其临床效果尚不令人满意。因此，针对PD发病机制，研发疗效明确且毒副作用少的药物，已成为当今老年医学领域研究的热点之一。
蚯蚓在我国入药已有几千年的历史，中药俗称为地龙，性寒，味咸，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著《神农本草经》中收载的67种动物药中就有蚯蚓。《本草纲目》中用蚯蚓入药的处方有40多种。《中药大辞典》中记载用蚯蚓配方治疗各种疾病者达30多处。现代药理学研究表明，蚯蚓具有多方面的药理学活性：具有抗凝血、溶血栓的双重作用、降压作用、免疫增强作用、杀灭精子、强化精子的双向作用、抗癌作用、解热、抗脑缺血、平喘、抗菌、抗氧化、促进创伤修复和细胞再生等作用。其中以纤溶酶的研究最多，取得较大进展，其他有效部位及成分尚不十分明确。作为一种常用动物药材，其化学成分种类繁多，结构复杂，大多为高分子有机化合物，虽然由于其药理活性显著，资源丰富，已经被广泛应用，但在化学成分、药理等方面的基础研究相对薄弱，大大限制了其在临床上的深入应用，而蚯蚓多肽作为一种天然来源的活性肽具有分子量小、制备相对容易、纯度高、抗原性弱、功能较明确、特异性强、毒副作用小、易于多途径吸收等大分子蛋白不可比拟的优点。目前，有关蚯蚓多肽的提取方法及具体药理作用研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蚯蚓提取物。
同时，本发明的目的还在于提供了一种蚯蚓提取物的提取方法。
进一步地，本发明的目的还在于提供了一种该蚯蚓提取物在构建对帕金森病离体细胞模型保护方面的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种蚯蚓提取物，由以下方法提取获得：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液(pH为4的甘氨酸水溶液5000ml)用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；
(2)粗多肽的脱盐纯化：取上述冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱(柱规格：φ35mm×30cm)，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；采用电导率仪测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽。
步骤(2)得到的冻干品在-20℃保存。
本发明的技术方案还在于采用了一种蚯蚓提取物的提取方法，包括以下步骤：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液(pH为4的甘氨酸水溶液5000ml)用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；
(2)粗多肽的脱盐纯化：取上述冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱(柱规格：φ35mm×30cm)，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；采用电导率仪测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽。
本发明的技术方案还采用了一种该蚯蚓提取物-蚯蚓多肽在构建对帕金森病离体细胞模型保护方面的应用。
本发明建立系统的蚯蚓多肽提取方法，通过该方法可以获得纯度及收率较高的活性蚯蚓多肽；证明蚯蚓多肽对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)所致大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)损伤的保护作用。
对提取物蚯蚓多肽理化性质分析检测：用Lowry法测定蚯蚓多肽的蛋白含量；SDS-PAGE、激光解析电离飞行时间质谱、HPLC法对蚯蚓多肽进行分析检测。
实验证明：本发明提取的蚯蚓多肽对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)所致大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)损伤具有明显的保护作用，并初步探讨了其作用机制是通过调节细胞周期和线粒体膜电位来保护PC12细胞的，蚯蚓多肽对MPP+损伤的PC12细胞有明显的保护作用，可以显著提高受损细胞的活力。
附图说明
图1为Lowry法测定多肽含量标准曲线；
图2为蚯蚓多肽的SDS-PAGE图谱；
图3为蚯蚓多肽激光解析电离飞行时间质谱图；
图4为蚯蚓多肽HPLC检测图谱；
图5为MPP+作用48h后的PC12细胞活力测定比较图；
图6为AO/EB荧光染色PC12细胞的形态改变图；
图7为蚯蚓多肽对MPP+损伤的PC12细胞周期的影响；
图8为蚯蚓多肽对MPP+损伤的PC12细胞线粒体膜电位的影响。
具体实施方式
本实施例的蚯蚓提取物，由以下方法提取获得：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液(pH为4的甘氨酸水溶液5000ml)用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；
(2)粗多肽的脱盐纯化：取上述冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱(柱规格：φ35mm×30cm)，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；采用电导率仪测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽，冻干品在-20℃保存。
提取物——蚯蚓多肽相关试验如下：
蚯蚓多肽对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用
(1)细胞培养
PC12细胞置于含5％新生牛血清，10％马血清的DMEM高糖培养液中，并在含5％CO2的37℃培养箱中培养，细胞每2d更换一次培养液，当细胞长到85％即可传代培养。
(2)MPP+损伤的离体帕金森细胞模型的建立
将生长状态良好的细胞以1×105·ml-1接种于96孔培养板，每孔100μl。24h细胞贴壁后去掉培养液，加入含不同浓度MPP+的培养液100μl，设阴性对照组(加入不含MPP+的培养液100μl)和空白对照组(在无细胞孔中加入不含MPP+的培养液100μl)。培养48h后，每孔加入5mg·ml-1MTT 20μl，在培养箱中培养4h后去掉培养液，每孔加入150μl的二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min后，用酶标仪在570nm处检测每孔的吸光度(OD)值。
细胞存活率＝(阴性组OD值-空白OD值)/(加药组OD值-空白组OD值)×100％
(3)不同浓度蚯蚓多肽对PC12细胞损伤的保护
细胞接种同上。待细胞贴壁后去掉培养液，加入含250μmol·L-1MPP+和含有不同浓度蚯蚓多肽的培养液100μl，设模型对照组(加入含250μmol·L-1MPP+和10％血清的培养液100μl)和阴性对照组(加入10％血清的培养液100μl)。细胞培养和检测同上。
(4)荧光染色法观察细胞形态
将细胞消化并调节密度为2×105·ml-1，接种于12孔板，每孔500μl，24h细胞贴壁后去掉培养液，加入含250μmol·L-1的MPP+和蚯蚓多肽的培养液500μl，设模型对照组(加入含250μmol·L-1的MPP+和10％血清的培养液500μl)和阴性对照组(加入只含10％血清的培养液500μl)。培养48h后去培养液，加入浓度为1μmol·L-1的吖啶橙(AO)溶液和溴化乙锭(EB)溶液各50μl，室温下染色20min，于荧光显微镜下观察细胞所发出的荧光与细胞形态并用数码相机拍照。
(5)流式细胞仪检测细胞周期及线粒体膜电位
调整细胞密度为1×106·ml-1接种于6孔板中，培养24h后去掉培养液，加入含250μmol·L-1的MPP+和蚯蚓多肽的培养液2.5ml，设模型对照组(加入含250μmol·L-1的MPP+和10％血清的培养液2.5ml)和阴性对照组(加入含10％血清的培养液2.5ml)。培养48h后收集6孔板中所有细胞，用PBS液洗两次，离心去上清后加入PI染液(含PI50mg·ml-1，RNase1g·L-1，0.1％Tritonx-100)0.5ml，4℃避光染色30min，上流式检测细胞周期，采用软件ModFit LTTM3.0(美国BD公司)处理，得出细胞各周期百分比。
用同样的方法收集细胞，并用PBS液洗细胞两次，离心去上清，然后加入含40nmol·L-1的DioC6(3)荧光探针和0.5％新生牛血清的PBS液0.5ml，避光37℃反应15min，上流式细胞仪分析线粒体膜电位变化情况。
(6)统计学处理
结果均以X±S表示，数据用SPSS 19.0统计软件进行t检验，多组间比较用单因素方差分析。
3.结果
(1)本发明首次建立了蚯蚓多肽系统的提取方法并对所得蚯蚓多肽进行了初步理化性质的研究，结果如下：
①新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)经上述工艺处理后，得到的冻干品外观呈白色絮状，有粘性，极易溶于水，最终收率可达18.64％，蛋白含量测定为94.7％(附图1)。
②从SDS-PAGE(附图2)和激光解析电离飞行时间质谱图(附图3)上可以看到，上述工艺所得到的蚯蚓多肽主要是分子量小于10kDa的多肽类物质。经HPLC(附图4)检测发现此蚯蚓多肽主要由4～6个组分组成。
(2)本发明首先证明了上述工艺所得蚯蚓多肽对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)所致大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)损伤具有明显的保护作用，并初步探讨了其作用机制可能是通过调节细胞周期和线粒体膜电位来保护PC12细胞的。
结果如下：
①MPP+对PC12细胞活力的影响
分别在25，50，100，200，400，800μmol·L-1 MPP+作用下，PC12细胞的活力逐渐降低，其IC50为247μmol·L-1(见附图5)。取其整数值，本实验选择250μmol·L-1的MPP+构建PC12细胞损伤模型。
②蚯蚓多肽对MPP+损伤的PC12细胞活力的影响
结果表明，蚯蚓多肽对MPP+损伤的PC12细胞有明显的保护作用，可以显著提高受损细胞的活力，且呈一定的剂量依赖性。
表1不同剂量蚯蚓多肽对MPP+损伤PC12细胞活力的影响。n＝5，
Note：VS model *P＜0.05，**P＜0.01；VS control##P＜0.01
③蚯蚓多肽对MPP+损伤下的PC12细胞形态的保护作用
PC12细胞在正常状态下被AO染成均匀的绿色，见附图6A，在250μmol·L-1的MPP+损伤下，有的细胞出现了凋亡状态，胞核呈亮绿色和黄色，有的呈现橘红色，说明细胞已坏死(附图6B)。而蚯蚓多肽能明显改善PC12细胞的损伤状态(附图6C)。
④蚯蚓多肽对MPP+诱导PC12细胞周期及线粒体膜电位的影响
MPP+损伤诱导下，PC12细胞的G2期和S期细胞由正常组的34.01％和15.98％分别减少到20.46％和10.59％，G1期细胞从50.04％增加到67.48％(附图7A，B)；而蚯蚓多肽能将G2，S，G1期的细胞比例回调至29.11％，13.73％和57.07％(附图7C)。同时，MPP+可使PC12细胞线粒体膜电位比正常组有所下降，细胞的荧光强度降低；蚯蚓多肽能减少线粒体膜电位的下降，使荧光强度有所回升(图8A，B，C)。
Claims (10)
1.一种蚯蚓提取物，其特征在于：由以下方法提取获得：
(1)粗多肽的制备：、将冰冻蚯蚓1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水冲洗，至完全无血色为止；绞成肉泥，加入预冷的匀浆液，用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心，取上清；所得上清真空旋转蒸发回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；
(2)粗多肽的脱盐纯化：取步骤(1)所得的冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱、，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽。
2.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)所述的蚯蚓为赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida。
3.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中预先冷却的蒸馏水的温度为3-5℃。
4.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中匀浆液为pH＝4的甘氨酸水溶液5000ml。
5.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中离心的条件为：温度4℃，转速5500rpm，时间15min。
6.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中蒸发的温度为55℃。
7.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行。
8.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于：步骤(1)中步骤(2)得到的冻干品在-20℃保存。
9.一种蚯蚓提取物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液，pH为4的甘氨酸水溶液5000ml，用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；
(2)粗多肽的脱盐纯化：取上述冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱(柱规格：ф35mm×30cm)，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；采用电导率仪测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽。
10.一种蚯蚓提取物蚯蚓多肽在构建对帕金森病离体细胞模型保护方面的应用。
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