CN109985226A - 地龙蛋白用于制造保护脑神经细胞医药组成物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明关于一种地龙蛋白的用途，尤其是关于地龙蛋白用于制造保护脑神经细胞医药组成物的用途，藉由该医药组成物可提高神经细胞中抗氧化基因的表现，或是抑制β类淀粉质蛋白(β‑amyloid protein，Aβ)与1‑甲基‑4‑苯基吡啶离子(1‑methyl‑4‑phenyl‑phenylpyridinium，MPP+)对神经细胞的作用，而降低脑神经细胞的损害。
Description
技术领域
本发明是关于一种地龙蛋白的用途，尤其是关于地龙蛋白用于制造保护脑神经细胞医药组成物的用途。
背景技术
根据2017年国际失智症协会(ADI)的预估，失智症于2017年将新增1千万名案例，平均每3秒就有一人罹患失智症，而2017年全球失智症人口将高达近5千万人，到2050年更会达到1亿3150万人。阿兹海默症(Alzheimer disease)是最常见的失智症，其早期最明显的病征为记忆力衰退，对时间、地点和人物的辨认出现问题，产生两种以上认知功能的障碍，属于进行性退化而且是不可逆。此外，病患脑部神经细胞会受到破坏，初期以侵犯海马回为主，往后则有异常老年斑及神经纤维纠结发生，不但深切影响病人的自主、自觉能力，也对家庭照护带来重大冲击，因此，若能发现具有预防或甚至治疗效果的医药组成物，对于阿兹海默症患者将是一大福音。
同样的，帕金森氏症亦是失智相关的严重疾病，2015年时全球患者约有620万人，并导致11.7万人死亡。据统计，60岁以上的老人约有1％会罹患此病，此病是一种慢性中枢神经系统的退化疾病，主要影响运动神经系统，其症状随时间缓慢出现，早期最明显的病症为颤抖、肢体僵硬、运动功能减退和步态异常，在病情严重的患者中最常有失智症的发生。帕金森氏症的运动症状主要导因于中脑黑质细胞死亡，使患者脑区的多巴胺不足。由于帕金森氏症目前无法治愈，因此仅能以药物控制或以手术来减少运动症状，因此，若也能发现具有预防或甚至治疗效果的医药组成物，对于帕金森氏症患者的减少或症状的减轻，甚至是死亡率的降低，都有其迫切需求。
所谓地龙，又称蚯蚓(Pheretima，环毛蚓属)，传统上可做为中药材，一般认为具有活血化瘀、防治心血管疾病等作用；而地龙蛋白，则是蚯蚓的萃取物，其除了含有铁、锰、铜、锌、硒等微量元素外，也富含许多胜肽与酵素。目前已知地龙蛋白所含有的胶原酶、纤溶酶和蚓激酶，主要对于血栓的溶解具有一定的功效，因此可应用于心血管疾病的预防或是中风后遗症的改善，至于地龙蛋白其他成分具有何种具体功效，则多仍在研究中。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种地龙蛋白作为保护脑神经细胞医药组成物的成分的应用，藉由本发明所提供的实施例，地龙蛋白可利用于制造降低脑神经细胞受损的医药组成物。
为了达成前述的目的，本发明提供一种地龙蛋白用于制造保护脑神经细胞医药组成物的用途，该地龙蛋白中不含红蚯蚓激酶，但利用该地龙蛋白所制造的保护脑神经细胞医药组成物，可藉由提高神经细胞中抗氧化基因的表现，或是抑制β类淀粉质蛋白(β-amyloid protein，Aβ)与1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-phenylpyridinium，MPP+)对神经细胞的作用，而降低脑神经细胞的损害。
在本发明的一实施例中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以提高神经细胞抗氧化的能力。
在本发明的一实施例中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以提高神经细胞中抗氧化基因的表现。
在本发明一实施例的一态样中，该抗氧化基因可为超氧化物歧化酶1(superoxidedismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)或谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)。
在本发明的一实施例中，该用以提高神经细胞中抗氧化基因的表现的医药组成物，其中所含地龙蛋白浓度可约为0.05～0.7mg/ml。
在本发明的另一实施例中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以抑制β类淀粉质蛋白对脑神经细胞的损害。在一态样中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以预防阿兹海默症，而该医药组成物中所含地龙蛋白浓度可约为0.005～0.05mg/ml。
在本发明的另一实施例中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子对脑神经细胞的损害。在一态样中，该保护脑神经细胞医药组成物可用以预防帕金森氏症，而该医药组成物中所含地龙蛋白浓度可约为0.04～0.08mg/ml。
在本发明的一实施例中，其中该保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白是将蚯蚓以水萃取所获得。在一态样中，所含地龙蛋白是将蚯蚓以约40～50℃温水萃取所获得。
在本发明的另一实施例中，该蚯蚓可为参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、红色爱胜蚓(Eisenia roseasavigny)、赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida)、节盲环毛蚓(Pheretima pectinifera)或威廉环毛蚓(Phererima guillelmi)。
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明实施例的地龙蛋白萃取物的抗氧化试验的结果图；
图2是本发明实施例的地龙蛋白萃取物对SOD1基因表现影响的结果图；
图3是本发明实施例的地龙蛋白萃取物对SOD2基因表现影响的结果图；
图4是本发明实施例的地龙蛋白萃取物对GPX基因表现影响的结果图；
图5是本发明实施例的地龙蛋白萃取物对Aβ所产生神经细胞的损害的抑制结果图；
图6是本发明实施例的地龙蛋白萃取物对MPP+所产生神经细胞的损害的抑制结果图。
具体实施方式
关于地龙蛋白，其是将蚯蚓处理后所萃取的萃取物，可以藉由以下方法获得。由于地龙蛋白的萃取方法已为所属技术领域具有通常知识者所熟知，因此下述萃取方法仅为示例，并不仅限于此。其中最适浓度如下所示：]
实施例1地龙蛋白的制备
将蚯蚓放入水中，搅拌加以清洗，去除其身上的泥沙、杂质或粘膜等，直到清洗后的水为清澈为止。清洗之前，亦可对蚯蚓进行催吐，使排出其体内未消化的食物或杂质。之后，将清洗干净的蚯蚓放入臭氧溶液中进行杀菌消毒，取出后再次清洗，然后将其浸泡40～50℃温水中，蚯蚓与水的比例约为1∶20～1∶5，较佳为1∶12～1∶8。持续在40-50℃下作用约12～16小时后，以磨碎机将其磨碎，将磨碎后的浆液先以50～100目筛网过滤，收集滤液后，于6000～14000rpm下离心8～28分钟(依溶液体积调整)，取其上清液再一次过滤后，再进行一次前述条件的离心，取得上清液后即为蚯蚓萃取物，亦即所谓的地龙蛋白。经检测该地龙蛋白中并不含红蚯蚓激酶。前述蚯蚓萃取物的溶液可进一步利用超滤膜进行浓缩，或再经冷冻干燥形成粉末状以为后续的试验或利用。
前述的蚯蚓可为参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、红色爱胜蚓(Eisenia rosea savigny)、赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida)、节盲环毛蚓(Pheretima pectinifera)或威廉环毛蚓(Phererimaguillelmi)等环节动物门寡毛纲的动物，但并不仅限于此。
实施例2地龙蛋白对脑神经细胞的抗氧化作用
首先将实施例1所制备的地龙蛋白以纯水配制为0.05-0.7mg/ml浓度的溶液，较佳为0.5mg/ml浓度。
准备小鼠脑神经瘤细胞株(Neuro-2a，ATCC，CCL-131)，培养于细胞培养液[Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM)、1％青霉素-链霉素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10％胎牛血清(Gibco)]中。准备6孔盘，于每孔中植入2ml细胞培养液，使每孔具有1.5x105个细胞，之后于37℃下，培养24小时。
之后在不影响黏附细胞的情况下移除每孔中的培养液，分成三组(每组2孔)准备试验，A组为空白对照组，B组为加入500μM H2O2(Sigma)，C组则加入500μM H2O2与由前述实施例1所制备的地龙蛋白萃取液0.5mg/ml，前述各组与培养液一同加入后，于37℃下培养1小时。之后，再于每孔中加入5μg/ml DCFH-DA(Sigma/SI-D6883-50MG)，于37℃下反应15分钟。接着，使H2O2于37℃下反应1小时。之后，每孔以1ml 1x PBS(Gibco)清洗细胞两次。清洗后，分别加入200μl胰蛋白酶(trypsin)，于黑暗中反应5分钟。之后将细胞溶液取出移至1.5ml离心管中，以400xg离心10分钟。移去上清液，以1x PBS清洗一次，再次以400xg离心10分钟。再移除上清液，将细胞沉淀悬浮于1ml 1x PBS中。之后以流式细胞仪，分别于激发波长(450～490nm)与发射波长(510～550nm)下侦测DCFH-DA的荧光讯号。侦测出的数值以微软EXCEL软件，利用Student t检定分析二数值间的统计显著性，其结果如图1所示。其中，相较于H2O2，*的P值＜0.05。
由图1的结果可知，在含有本发明的地龙蛋白萃取物的情况下，活性氧化物质大幅降低了近25％，确认本发明的地龙蛋白萃取物可降低活性氧化物质等自由基的产生，而减轻其对脑神经细胞的伤害。
实施例3地龙蛋白对脑神经细胞中抗氧化基因表现的影响
同样的，将实施例1所制备的地龙蛋白以生理食盐水配制为0.05-0.7mg/ml浓度的溶液，较佳为0.5mg/ml浓度。同时，准备人类皮肤纤维母细胞(CCD-966sk，BCRC No.60153)，再于6孔盘每孔中植入2ml细胞培养液，使每孔具有1.5x105个细胞，之后于37℃下，培养24小时。之后在不影响黏附细胞的情况下移除每孔中的培养液，分成以下组别进行试验，其分别包括：空白对照组、仅加入H2O2组(仅H2O2)，以及加入H2O2与0.5mg/ml实施例1所制备的地龙蛋白萃取液组(地龙蛋白)，于37℃下培养24小时，再进行特定基因表现的分析。
将上述各组细胞回收，以RNA萃取套组(Geneaid)萃取其RNA，并以反转录酶(Invitrogen)将该些RNA反转录为cDNA。之后利用实时聚合酶链锁反应系统(ABI Step OnePlus Real-Time PCR system)，分别利用表1所列引子进行qPCR(KAPA CYBR FAST qPCRKits，KAPA Biosystems)，以定量以下基因的表现：SOD1、SOD2与GPX。基因表现相对定量分析是采用2-ΔΔCt法。关于基因表现的结果如图2至4所示。其中，*的P值＜0.05，***的P值＜0.001。
表1
由图2～4的结果可知，在含有本发明的地龙蛋白萃取物的情况下，于作用24小时后，可将SOD1基因表现的相对值由0.66提升到1.99，SOD2基因表现的相对值由0.28提升到1.61，而GPX基因表现的相对值则由0.17提升到1.35。因此，本发明实施例的地龙蛋白萃取物确实能够诱发使诸如SOD1、SOD2与GPX等抗氧化基因的表现增加。
实施例4地龙蛋白对Aβ所产生神经细胞损害的抑制效果
将实施例1所制备的地龙蛋白以生理食盐水配制为0.005-0.05mg/ml浓度的溶液，较佳为0.008mg/ml浓度。同时，准备人类神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y，ATCC CRL-2266)，再于6孔盘每孔中植入2ml细胞培养液，使每孔具有2x104个细胞，并分成以下组别进行试验，其分别包括：空白对照组、β-amyloid胜肽(Lifetein)组(仅Aβ)、甲基牛扁定(Methyllycaconitine，MLA)控制组与Aβ(PC+Aβ)，以及0.008mg/ml实施例1所制备的地龙蛋白萃取液与Aβ组(地龙蛋白+Aβ)，于37℃下培养24小时，再进行脑神经细胞存活率的分析。
首先于每孔中加入15μl的MTT(thiazoyl blue tetrazolium bromide，AMRESCO/0793-5G)溶液，于37℃下培养4小时。之后将溶液移除，加入50μl的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)溶液以将反应所形成的甲臜(formazan)溶解。将6孔盘置于摇动器上摇晃10分钟后，以ELISA分析仪(BioTek)测量570nm波长下的吸光值，并以以下公式计算细胞存活率(％)：(试验组的吸光值/控制组的吸光值)x100％。最后将数值以微软EXCEL软件，利用Student t检定分析数值间的统计显著性，其结果如图5所示。其中，相较于仅Aβ组，*的P值＜0.05，**的P值＜0.01；相较于空白对照组，###的P值＜0.001。
由图5的结果可知，在含有本发明实施例的地龙蛋白萃取物的情况下，细胞存活率由51.2％提升至58.2％，提升幅度约7％，证实本发明实施例的地龙蛋白萃取物可抑制Aβ对脑神经细胞的作用，减少其损伤，因而也可应用于阿兹海默症的预防。
实施例5地龙蛋白对MPP+所产生神经细胞损害的抑制效果
将实施例1所制备的地龙蛋白以生理食盐水配制为0.04-0.08mg/ml浓度的溶液，较佳为0.06mg/ml浓度。同时，准备人类神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y，ATCC CRL-2266)，再于6孔盘每孔中植入2ml细胞培养液，使每孔具有2x104个细胞，并分成以下组别进行试验，其分别包括空白对照组、MPP+组(仅MPP+)以及0.06mg/ml实施例1所制备的地龙蛋白萃取液与MPP+组(地龙蛋白+MPP+)，于37℃下培养24小时，再进行脑神经细胞存活率的分析。
首先于每孔中加入15μl的MTT(AMRESCO/0793-5G)溶液，于37℃下培养4小时。之后将溶液移除，加入50μl的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)溶液以将反应所形成的甲臜(formazan)溶解。将6孔盘置于摇动器上摇晃10分钟后，以ELISA分析仪(BioTek)测量570nm波长下的吸光值，并以以下公式计算细胞存活率(％)：(试验组的吸光值/控制组的吸光值)x100％。最后将数值以微软EXCEL软件，利用Student t检定分析数值间的统计显著性，其结果如图6所示。其中，相较于仅MPP+组，***的P值＜0.001；相较于空白对照组，##的P值＜0.01。
由图6的结果可知，在含有本发明实施例的地龙蛋白萃取物的情况下，细胞存活率由74.1％提升至97.21％，显著提升约23.11％，证实本发明实施例的地龙蛋白萃取物可抑制MPP+对脑神经细胞的作用，减少其损伤，因而也可应用于帕金森氏症的预防。
本发明实施例的保护脑神经细胞医药组成物亦可进一步加入所属技术领域所熟知的载剂或其他辅剂。而其剂型，可为但不限于溶液、胶囊、或锭剂。
藉由上述结果，可证明本发明实施例所制备的医药组成物中的地龙蛋白对脑神经细胞具有极佳的抗氧化效果，且能提高其抗氧化基因表现，并能抑制β类淀粉质蛋白或1-甲基-4-苯基吡啶离子对脑神经细胞的作用以降低脑神经细胞的损害，因此可进一步为预防阿兹海默症或帕金森氏症的医药组成物。
Claims (13)
1.一种地龙蛋白用于制造保护脑神经细胞医药组成物的用途，其中该地龙蛋白中不含红蚯蚓激酶，并可降低脑神经细胞的损害。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物是用以提高神经细胞中一抗氧化基因的表现。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗氧化基因是SOD1、SOD2或GPX。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白浓度是0.05～0.7mg/ml。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物是用以抑制β类淀粉质蛋白(Aβ)对神经细胞的损害。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物是用以预防阿兹海默症。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白浓度是0.005～0.05mg/ml。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物是抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对神经细胞的损害。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物是用以预防帕金森氏症。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白浓度是0.04～0.08mg/ml。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白是将一蚯蚓以水萃取所获得。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述保护脑神经细胞医药组成物中所含地龙蛋白是将该蚯蚓以40～50℃温水萃取所获得。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其特征在于，所述蚯蚓是参环毛蚓(Pheretimaaspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(Pheretima vulgaris Clen)、红色爱胜蚓(Eisenia rosea savigny)、赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida)、节盲环毛蚓(Pheretimapectinifera)或威廉环毛蚓(Phererima guillelmi)。
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Application publication date: 20190709 |
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