CN104826086B - 具改善老年痴呆症作用的多肽组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
具改善老年痴呆症作用的多肽组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具改善老年痴呆症的多肽组合物及其制备方法和应用。该多肽组合物的有效成分主要由以下重量份的原料通过酶解制备而成：猴头菇2‑4份、北冬虫夏草子实体1‑3份、紫苏籽1‑3份、香菇0.5‑1.5份、木耳0.5‑1.5份。本发明的多肽组合物对神经细胞具有非常好的保护及营养作用，还能够显著改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力，因此，可将该活性多肽组合物用于预防和/或治疗老年痴呆症中，也将会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性成分提取利用技术领域，特别是涉及一种具有生物活性的多肽组合物及其制备方法和应用。
背景技术
老年痴呆症是一种渐进发展的致死性神经退行性疾病，其症状主要表现为记忆力和认知能力不断减弱，日常生活能力障碍，并有各种神经精神症状和行为障碍，多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆。随着我国进入老龄社会，老年性痴呆症的发病率也在逐年增高。老年痴呆症的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为在大脑皮层和海马区出现β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成老年斑，Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结以及脑皮层和海马区神经细胞减少。
目前治疗老年痴呆症的药物主要包括胆碱能药物，防止神经纤维缠结药物，抗Aβ蛋白沉积药物，生长因子促进剂以及脑功能改善药物等。但是，现有药物具有治疗效果不理想，毒副作用大，特异性不强等缺点，而中草药具有天然，多效，毒性小等特点。从中药和天然药物中寻找能够预防和/或治疗老年痴呆症的有效成分是迫切需要解决的课题。
发明内容
基于此，本发明提供一种具改善老年痴呆症作用的多肽组合物，该多肽组合物对神经细胞具有保护及营养作用，能够改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力。
一种具改善老年痴呆症的多肽组合物，所述多肽组合物的有效成分主要由以下重量份的原料，通过酶解制备而成：
猴头菇2-4份、北冬虫夏草子实体1-3份、紫苏籽1-3份、香菇0.5-1.5份、木耳0.5-1.5份。
上述原料中，猴头菇又叫猴头菌，是齿菌科的菌类，菌伞表面长有毛茸状肉刺，长约1～3厘米，它的子实体圆而厚，新鲜时白色，干后由浅黄至浅褐色，基部狭窄或略有短柄，上部膨大，直径3.5～10厘米，远远望去似金丝猴头，故称“猴头菇”。猴头菇性平味甘，有利五脏、助消化、滋补身体等功效。现代医学陆续证明猴头菌有良好的药用价值，临床应用表明，猴头菇可治疗神经衰弱、消化不良、胃溃疡、胃胀等疾病，还具有提高记忆力、抗衰老、提高免疫力、抗癌等作用。
北冬虫夏草，也叫蛹虫草或蛹草或北虫草，是虫与菌结合的药用真菌，现代珍稀中草药。北冬虫夏草属于真菌门麦角菌科虫草属，主要生长在我国的北方地区。北冬虫夏草不仅含有丰富的蛋白质和氨基酸，而且含有30多种人体所需的微量元素，是上等的滋补佳品。研究证实，北冬虫夏草具有明显的抗衰老作用，其能有效清除人体自由基，抑制过氧化脂质的产生，保护细胞免受过氧化物的损害，延缓器官和整个集体的衰老，同样能够调节血液粘稠度，扩张心脑血管，保护心肌细胞，增强免疫力等。北冬虫夏草多肽为北冬虫夏草的主要活性成分之一，是经过酶解工艺直接制得的水解物，具有极强的药理作用和生理功能多样性，但有关其预防或治疗老年痴呆症的报道较少。
紫苏籽，为唇形科植物紫苏的干燥成熟果实。味辛，性温。归肺经。功效降气消痰、止咳平喘、润肠。紫苏种子中含大量油脂，出油率高达45％左右，油中含亚麻酸62.73％、亚油酸15.43％、油酸12.01％。种子中蛋白质含量占25％，内含18种氨基酸，其中赖安酸、蛋氨酸的含量均高于高蛋白植物籽粒苋。此外还有谷维素、维生素E、维生素B1、缁醇、磷脂等。现代医学研究证明紫苏籽对视觉功能和学习行为活动起促进作用，还具有调节血压、调节血脂、抑制肿瘤、抑制血小板聚集、防止血栓形成的功效。
香菇,为侧耳科植物香蕈的子实体。是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。香菇富含维生素B群、铁、钾、维生素D原，味甘，性平。主治食欲减退，少气乏力。香菇中还含有30多种酶和18种氨基酸。人体所必需的8中氨基酸中，香菇就含有7种，因此香菇又成为纠正人体酶缺乏症和补充氨基酸的首选食物。现代研究表明，香菇对提高机体适应力有很大作用，此外，香菇还对记忆力减退、神经炎、消化不良、糖尿病等有一定治疗作用。
木耳，是木耳科真菌，含蛋白质、脂肪、多糖和钙、磷、铁等元素以及胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、烟酸等，还含磷脂、固醇等营养素。具有补气养血、润肺止咳、止血、降压、抗癌等功效。现代医学研究表明，木耳具有延缓衰老、增强免疫力、治疗心脑血管疾病、抗癌、抗突变、降血糖等作用。
本发明的多肽组合物，选用猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇、木耳作为原料，经过多次酶解得到的多肽组合物，对神经细胞具有保护及营养作用，能够改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力。
本发明还公开了上述多肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)胃蛋白酶酶解：按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，按照10-20ml水/1g原料的量加入水，调节溶液pH值为1.0-3.0，按照原料重量百分比2.0％-3.0％的量加入胃蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，得到酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，调节溶液pH值为7.0-9.0，按照原料质量百分比1.0％-2.0％的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为8000D-12000D的超滤柱过滤，得到酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，调节溶液pH值为6.5-7.5，按照原料质量百分比0.25％-0.75％的量加入中性蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，将溶液经截留分子量为3000D-7000D的超滤柱过滤，得到酶解液3，即得多肽组合物。
上述多肽组合物的制备方法，按照特定的顺序加入选定的酶，对猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇、木耳等原料进行酶解，并在每一步酶解之后以超滤柱进行了超滤，得到预定分子量大小的多肽后再进行下一步的酶解，最终得到的多肽组合物的分子量主要集中在1000D-3000D的范围内。以该多肽组合物作用于Aβ损伤PC12细胞，具有非常好的抗凋亡作用；以该多肽组合物作用于老年痴呆模型小鼠，对其学习记忆作用具有非常好的促进作用。说明以上述制备方法得到的多肽组合物具有预防和治疗老年痴呆症的效果。
在其中一个实施例中，在(1)胃蛋白酶酶解步骤之前，还包括预处理步骤，该预处理步骤为：按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，加入石油醚浸泡，过滤得滤渣，滤渣烘干，即得脱脂的原料。先对原料进行脱脂，可获得更干燥的原料粉末，并可增加其亲水性，酶解效果更好。
在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，粉碎，以原料：石油醚为1:2-4的质量体积比加入馏程为60-90℃的石油醚，在50-60℃下振荡浸泡2-4h，过滤得滤渣，滤渣于40-50℃下烘干，即得粉末状脱脂的原料。以上述条件进行脱脂，具有非常好的脱脂效果。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃；所述步骤(2)胰蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃；所述步骤(3)中性蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃。将酶解温度控制在上述范围内，能够使酶发挥最佳功效，获得较好的酶解效果。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为30000D；所述步骤(2)胰蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为10000D；所述步骤(3)中性蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为5000D。上述截留分子量的超滤柱具有方便、易得的优点。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，使溶液中酶灭活后，先以4000-5000r·min-1离心5-15min，再取上清液过超滤柱过滤。先离心除去固体物后再过滤，既有利于超滤的进行，也可避免超滤柱堵塞的问题。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)中性蛋白酶酶解后，得到的活性多肽组合物中，分子量在1000D-3000D范围内的多肽占多肽总量的80％-90％，分子量在3000D-5000D范围内的多肽占多肽总量的5％-8％。当多肽组合物中多肽分子量按照上述范围分布，具有最佳的保护及营养神经细胞作用，并有最佳的改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力效果。
本发明还公开了上述的活性多肽组合物在制备预防和治疗老年痴呆症的药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述药物或保健食品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、丸剂或滴丸。
上述剂型可以采用本领域技术人员熟知的方法来进行药剂的制备。根据需要，可以加入各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本发明的药剂在制备时，可选择的填充剂包括但不限于：淀粉、糖粉、磷酸钙、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；可选择的粘合剂包括但不限于：羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶化淀粉等；可选择的崩解剂包括但不限于：干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；可选择的润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种活性多肽组合物的制备方法，按照特定的顺序加入选定的酶对猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳等原料进行酶解，并在每一步酶解之后以超滤柱进行了超滤，得到预定分子量大小的多肽后再进行下一步的酶解，最终得到分子量主要集中在1000D-3000D范围内的多肽组合物。
通过本发明的方法制备得到的多肽组合物，对神经细胞具有非常好的保护及营养作用，还能够显著改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力，因此，可将该多肽组合物用于预防和/或治疗老年痴呆症中，也将会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。
并且，该多肽组合物为天然药用植物中提取的活性成分，具有毒性低、有效剂量低、用量小、安全性高、可长期服用的优点，适用于老年性痴呆症患者的临床用药特点和要求。该多肽组合物还具有分子小、易于吸收和生物利用度高的特点。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。
实施例1
一种多肽组合物，通过以下方法制备得到。
一、材料。
猴头菇，购自吉林桦甸市久木生菌业有限责任公司。
北冬虫夏草子实体，购自江苏强盛虫草生物有限公司。
紫苏籽，购自吉林沃达食品有限公司。
香菇，购自吉林桦甸市久木生菌业有限责任公司。
木耳，购自吉林黑尊食品有限公司。
胃蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为3500u/g。
胰蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为40000u/g。
中性蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司，活力为50000u/g。
二、方法。
脱脂预处理：按重量份比为3:2:2:1:1称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，做为原料，粉碎，以原料：石油醚为1:3(w：v)的比例加入馏程为60-90℃的石油醚，在55℃下振荡浸泡3h，过滤得滤渣，滤渣于45℃下烘干，即得粉末状脱脂的原料。
(1)胃蛋白酶酶解：取上述脱脂的原料，按照15.7ml蒸馏水/1g原料的量加入水，于常温下放置0.5h使其充分溶胀，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为2.0，按照原料重量百分比2.5％的量加入胃蛋白酶，在42℃下恒温振荡酶解4h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，4500r·min-1离心10min，取上清液，经截留分子量为30000D的超滤柱过滤，得到分子量在30000D以下的酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值为8.0，按照原料重量百分比1.5％的量加入胰蛋白酶，在42℃下恒温振荡酶解4h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为10000D的超滤柱过滤，得到分子量在10000D以下的酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7.3，按照原料重量百分比0.5％的量加入中性蛋白酶，在42℃下恒温振荡酶解4h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为5000D的超滤柱过滤，得到分子量在5000D以下的酶解液3，即得多肽组合物。
将上述酶解液3采用高效液相色谱法测定其分子量分布。结果显示，其分子量主要集中在1000-3000D范围内，1000-3000D的小肽峰面积占总峰面积的85.2％，3000-5000D的小肽峰面积占8.1％，0-1000D的小肽峰面积占6.7％。
将上述酶解液3，经浓缩，喷雾干燥后，得多肽组合物粉末A。
实施例2
一种多肽组合物，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
脱脂预处理：按重量份比为2:3:1:1.5:0.5称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇、木耳，做为原料，粉碎，以原料：石油醚为1:2(w：v)的比例加入馏程为60-90℃的石油醚，在60℃下振荡浸泡2h，过滤得滤渣，滤渣于50℃下烘干，即得粉末状脱脂的原料。
(1)胃蛋白酶酶解：取上述脱脂的原料，按照10ml蒸馏水/1g原料的量加入水，于常温下放置0.5h使其充分溶胀，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为1.0，按照原料重量百分比3.0％的量加入胃蛋白酶，在37℃下恒温振荡酶解5h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，4000r·min-1离心15min，取上清液，经截留分子量为25000D的超滤柱过滤，得到分子量在25000D以下的酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值为7.0，按照原料重量百分比2.0％的量加入胰蛋白酶，在37℃下恒温振荡酶解5h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为8000D的超滤柱过滤，得到分子量在8000D以下的酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为6.5，按照原料重量百分比0.75％的量加入中性蛋白酶，在37℃下恒温振荡酶解5h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为3000D的超滤柱过滤，得到分子量在3000D以下的酶解液3，即得多肽组合物。
将上述酶解液3，经浓缩，喷雾干燥得多肽组合物粉末B。
实施例3
一种多肽组合物，制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
脱脂预处理：按重量份比为4:1:3:0.5:1.5称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇、木耳，做为原料，粉碎，以原料：石油醚为1:4(w：v)的比例加入馏程为60-90℃的石油醚，在50℃下振荡浸泡4h，过滤得滤渣，滤渣于50℃下烘干，即得粉末状脱脂的原料。
(1)胃蛋白酶酶解：取上述脱脂的原料，按照20ml蒸馏水/1g原料的量加入水，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为3.0，按照原料重量百分比2.0％的量加入胃蛋白酶，在45℃下恒温振荡酶解3h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，5000r·min-1离心5min，取上清液，经截留分子量为35000D的超滤柱过滤，得到分子量在35000D以下的酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH值为9.0，按照原料重量百分比1.0％的量加入胰蛋白酶，在45℃下恒温振荡酶解3h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为12000D的超滤柱过滤，得到分子量在12000D以下的酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为7.5，按照原料重量百分比0.25％的量加入中性蛋白酶，在45℃下恒温振荡酶解3h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，将溶液经截留分子量为7000D的超滤柱过滤，得到分子量在7000D以下的酶解液3，即得多肽组合物。
将上述酶解液3，经浓缩，喷雾干燥得活性多肽组合物粉末C。
对比例1
本对比例的多肽组合物制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
在脱脂预处理后，不分步进行酶解，而是按照下述方法进行酶解：
取脱脂的猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇、木耳，作为原料，按照15.7ml蒸馏水/1g原料的量加入水，于常温下放置0.5h使其充分溶胀，用1mol/L盐酸调节溶液pH值为2.0，同时按照原料质量百分比2.5％的量加入胃蛋白酶、1.5％的量加入胰蛋白酶、0.5％的量加入中性蛋白酶，在42℃下恒温振荡酶解4h；随后将溶液煮沸10min，使其中的酶灭活。冷却后，4500r·min-1离心10min，取上清液，经截留分子量为5000D的超滤柱过滤，得到分子量在5000以下的酶解液。
将上述酶解液，经浓缩，喷雾干燥得活性多肽组合物粉末D。
对比例2
本对比例的多肽组合物制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
所用的原料为重量份比为3:2:1:1的猴头菇、紫苏籽、香菇和木耳。
参照实施例1中的方法进行酶解，得到多肽组合物粉末E。
对比例3
本对比例的多肽组合物制备方法与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
所用的原料为重量份比为3:2:2:1:1的猴头菇、北冬虫夏草子实体、黑芝麻、香菇和木耳。
参照实施例1中的方法进行酶解，得到多肽组合物粉末F。
实验例1对Aβ损伤PC12细胞的抗凋亡作用
将上述实施例和对照例制备得到的多肽组合物粉末进行对Aβ损伤PC12细胞的抗凋亡作用的实验。
一、材料
1.多肽组合物，通过上述实施例和对比例制备得到的多肽组合物A-F。
2.Aβ1-42，购自Sigma公司，用0.01mol/L PBS(pH7.2)配成溶液，密封后置于37℃，孵育7天使之聚集。
3.Annexin V-FITC，FITC标记的膜联蛋白V,购自晶美生物工程有限公司。
4.PI溶液，碘化丙啶溶液。
5.大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)，购自中科院上海细胞库。
二、方法
采用流式细胞术检测多肽组合物对抗Aβ1-42致大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)凋亡作用。取对数生长期的PC12细胞，接种于96孔板中，分别设对照组；Aβ1-42处理组；多肽组合物A-F组。
1.PC12细胞的培养
PC12细胞培养于含20％FBS的RPMI1640培养液中，置于37℃、5％CO2的培养箱中传代培养，细胞为上皮样贴壁生长，每隔2天换培养液1次。按1×106/L密度接种于96孔培养板中培养至对数生长期待用。
2.Aβ1-42原液制备
将100μg Aβ1-42溶解于2ml的RPMI1640培养基中，过滤除菌，即为Aβ1-42原液，置于37℃孵箱中孵育24h，4℃贮存备用。
3.实验分组及药物处理
实验分为
对照组：用20％FBS的RPMI1640培养基培养48h后检测；
Aβ1-42组：加入终浓度为10μg/mL的Aβ1-42作用24h诱导细胞损伤，继续培养24h后检测；
多肽组合物A-F组：分别加入终浓度为100μg/mL的多肽组合物A-F预处理2h，换培养液，再加入终浓度为10μg/mL的Aβ1-42作用24h，继续培养24h后检测。
4.流式细胞术检测
取100μL的细胞悬液于流式管中，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI溶液混匀，室温避光孵育15分钟，加400μL PBS，流式细胞仪分析。
三、结果
实验结果如下表所示。
表1多肽组合物抗Aβ1-42致PC12细胞的凋亡作用
| 组别 | 剂量 | 凋亡率(％) |
| 对照组 | — | 2.30±1.90 |
| 10μg/ml | 30.79±2.66** | |
| 多肽组合物A组 | 100μg/mL | 13.94±1.79* |
| 多肽组合物B组 | 100μg/mL | 20.28±1.63* |
| 多肽组合物C组 | 100μg/mL | 22.49±1.02* |
| 多肽组合物D组 | 100μg/mL | 27.08±1.57 |
| 多肽组合物E组 | 100μg/mL | 26.18±1.85 |
| 多肽组合物F组 | 100μg/mL | 25.59±1.63 |
注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.01
从上述结果中可以看出，与正常组相比，Aβ1-42处理模型组PC12细胞凋亡率明显增加，且有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。
活性多肽组合物A-C组凋亡率与模型组相比显著降低(P<0.01)，并且可以看出其中A组具有最佳的效果。而多肽组合物D-F组凋亡率与模型组相比虽有平均值上的降低，但是并不具有统计学上的意义，说明其效果不如多肽组合物A-C组。
上述试验证明，实施例1-3制备得到的多肽组合物A-C具有非常好的抗致细胞凋亡作用。
实验例2对老年痴呆模型小鼠学习记忆的促进作用
将上述实施例和对照例制备得到的多肽组合物粉末进行老年痴呆模型小鼠学习记忆促进作用的实验。
一、材料
1.多肽组合物，通过上述实施例和对比例制备得到的多肽组合物A-F。
2.樟柳碱，北京紫竹药业有限公司生产。
3.成年昆明小鼠，体重18-22g，雌性,购自军事医学科学院实验动物中心。
二、方法
1.动物造模及分组：将小鼠按体重随机分成5组，包括正常对照组、模型组、多肽组合物A-F组,每组10只。多肽组合物组口服10mg/mL的多肽溶液，每天按要求分别灌胃0.2ml，正常对照组和模型组每天给予相同量的生理盐水，连续给药三周后，除正常对照组外，其余各组小鼠按10mg/kg腹腔注射樟柳碱进行造模并试验。
2.采用小鼠跳台试验和Morris水迷宫试验观测多肽组合物对樟柳碱所致老年痴呆模型小鼠学习记忆的促进作用。
小鼠跳台试验：将小鼠放在平台上，适应环境3min，然后通以36V电压，小鼠受到电流刺激，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，每次训练5min。24h后测验，记录小鼠第一次跳下平台的潜伏期、5min内的错误次数和总电击时间，以此作为记忆成绩。
Morris水迷宫试验：测试程序为定位航行试验，共进行5d。前2天为训练适应期，后3天记录成绩。试验前20min小鼠腹腔注射樟柳碱10mg/kg，每天给药一次。将小鼠分别从3个不同入水点面向池壁放入水中，若小鼠在60s内不能找到平台，则将其引上平台并停留15s，前4天每天测试2次，最后一天测试1次。记录小鼠从入水至爬上平台所用的时间(即逃避潜伏期)、路径轨迹等作为检测指标。
学习记忆测试完成后，处死小鼠，迅速取出脑组织，用生理盐水制成10％匀浆，放入低温离心机中，3000r/min离心10min，取上清液装入试管中冷冻备用，按照试剂盒说明书进行乙酰胆碱酯酶(AchE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)的测定。
三、结果
实验结果如下表所示。
表2各组小鼠跳台试验结果比较
| 组别 | 剂量 | 错误次数(n) | 潜伏期(s) |
| 对照组 | — | 1.6±0.3** | 222.8±73.9** |
| 模型组 | 10mg/kg | 5.6±1.5 | 39.0±8.1 |
| 多肽组合物A组 | 2mg | 2.2±0.5* | 167.1±19.2** |
| 多肽组合物B组 | 2mg | 3.6±0.8 | 52.8±8.2 |
| 多肽组合物C组 | 2mg | 3.4±1.1 | 78.4±8.0 |
| 多肽组合物D组 | 2mg | 4.8±1.2 | 46.3±7.6 |
| 多肽组合物E组 | 2mg | 4.5±1.0 | 52.6±10.2 |
| 多肽组合物F组 | 2mg | 4.3±1.1 | 50.2±9.1 |
注：与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05(下同)
从上述结果中可以看出，与正常组相比，模型组小鼠5min内错误次数明显增多，潜伏期显著缩短，差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。
与模型组相比，活性多肽组合物A-C组小鼠错误次数明显减少，潜伏期延长，并且可以看出其中A组具有最佳的效果，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而B、C组虽有错误次数明显减少，潜伏期延长的趋势，但无统计学意义。
而多肽组合物D-F组错误次数和潜伏期与模型组相比虽有平均值上的改善，但是并不如B、C组的改善明显，且无具有统计学上的意义，说明其效果不如多肽组合物A-C组。
表3各组小鼠Morris水迷宫试验潜伏期结果(s)
从上述结果中可以看出，随着测试次数增加，各组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短。与对照组相比，模型组小鼠找到平台的潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。
与模型组相比，多肽组合物A-C组小鼠潜伏期明显缩短，并且随测试次数增加差异逐渐增大，说明多肽组合物有改善痴呆小鼠学习记忆能力的作用，并且可以看出其中A组的效果较佳，差异有统计学意义(P<0.05)，而B、C组虽潜伏期缩短，但无统计学意义。
而多肽组合物D-F组的潜伏期与模型组相比，虽也有缩短，但是并不如A-C组的改善明显。
表4各组小鼠脑组织匀浆AchE、ChAT活性比较
| 组别 | 剂量 | AchE(U/mg) | ChAT(U/mg) |
| 对照组 | — | 6.43±1.42** | 122.84±21.17** |
| 模型组 | 10mg/kg | 13.88±1.84 | 53.19±18.68 |
| 多肽组合物A组 | 2mg | 9.00±0.65** | 90.53±11.61* |
| 多肽组合物B组 | 2mg | 10.37±1.35 | 79.94±6.83 |
| 多肽组合物C组 | 2mg | 11.59±0.88 | 71.39±10.61 |
| 多肽组合物D组 | 2mg | 12.12±1.06 | 62.52±8.31 |
| 多肽组合物E组 | 2mg | 11.88±0.97 | 65.37±7.69 |
| 多肽组合物F组 | 2mg | 11.36±1.12 | 64.15±7.89 |
注：与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05(下同)
从上述结果中可以看出，与对照组相比，模型组小鼠脑组织匀浆中的AchE活性显著增强，ChAT活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。
与模型组相比，多肽组合物A-C组小鼠脑组织匀浆中的AchE活性均有明显降低，说明多肽组合物A-C能提高痴呆小鼠中的ChAT活性，特别是其中的多肽组合物A组，其小鼠脑组织匀浆中的AchE活性显著降低(P<0.01)，说明其具有特别好的作用。而多肽组合物A-C组小鼠脑组织匀浆中的ChAT活性也均有明显增强，说明多肽组合物A-C能抑制AchE的活性，从而减少乙酰胆碱的分解，提高乙酰胆碱的含量。特别是其中的多肽组合物A组，其小鼠脑组织匀浆中的ChAT活性显著增强(P<0.05)，说明其具有特别好的效果。
而多肽组合物D-F组AchE活性和ChAT活性与模型组相比虽有平均值上的改善，但是并不如B、C组的改善明显，且无具有统计学上的意义，说明其效果不如活性多肽组合物A-C组。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种具改善老年痴呆症作用的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的有效成分主要由以下重量份的原料，通过酶解制备而成：
猴头菇2-4份、北冬虫夏草子实体1-3份、紫苏籽1-3份、香菇0.5-1.5份、木耳0.5-1.5份；
所述多肽组合物通过以下方法制备得到：
(1)胃蛋白酶酶解：按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，按照10-20ml水/1g原料的量加入水，调节溶液pH值为1.0-3.0，按照原料重量百分比2.0％-3.0％的量加入胃蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，得到酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，调节溶液pH值为7.0-9.0，按照原料质量百分比1.0％-2.0％的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为8000D-12000D的超滤柱过滤，得到酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，调节溶液pH值为6.5-7.5，按照原料质量百分比0.25％-0.75％的量加入中性蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，将溶液经截留分子量为3000D-7000D的超滤柱过滤，得到酶解液3，即得多肽组合物。
2.权利要求1所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)胃蛋白酶酶解：按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，按照10-20ml水/1g原料的量加入水，调节溶液pH值为1.0-3.0，按照原料重量百分比2.0％-3.0％的量加入胃蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为25000D-35000D的超滤柱过滤，得到酶解液1；
(2)胰蛋白酶酶解：取上述酶解液1，调节溶液pH值为7.0-9.0，按照原料质量百分比1.0％-2.0％的量加入胰蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，再将溶液经截留分子量为8000D-12000D的超滤柱过滤，得到酶解液2；
(3)中性蛋白酶酶解：取上述酶解液2，调节溶液pH值为6.5-7.5，按照原料质量百分比0.25％-0.75％的量加入中性蛋白酶，酶解3-5h；随后将溶液煮沸，使其中的酶灭活，将溶液经截留分子量为3000D-7000D的超滤柱过滤，得到酶解液3，即得多肽组合物。
3.根据权利要求2所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，在(1)胃蛋白酶酶解步骤之前，还包括预处理步骤，该预处理步骤为：按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，加入石油醚浸泡，过滤得滤渣，滤渣烘干，即得脱脂的原料。
4.根据权利要求3所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述预处理步骤中，按重量份称取猴头菇、北冬虫夏草子实体、紫苏籽、香菇和木耳，粉碎，以原料：石油醚为1:2-4的质量体积比加入馏程为60-90℃的石油醚，在50-60℃下振荡浸泡2-4h，过滤得滤渣，滤渣于40-50℃下烘干，即得粉末状脱脂的原料。
5.根据权利要求2所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃；所述步骤(2)胰蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃；所述步骤(3)中性蛋白酶酶解中，酶解温度为37-45℃。
6.根据权利要求2所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为30000D；所述步骤(2)胰蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为10000D；所述步骤(3)中性蛋白酶酶解中，超滤柱的截留分子量为5000D。
7.根据权利要求2所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)胃蛋白酶酶解中，使溶液中酶灭活后，先以4000-5000r·min-1离心5-15min，再取上清液过超滤柱过滤。
8.根据权利要求2-7任一项所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中性蛋白酶酶解后，得到的多肽组合物中，分子量在1000D-3000D范围内的多肽占多肽总量的80％-90％，分子量在3000D-5000D范围内的多肽占多肽总量的5％-8％。
9.权利要求1所述的多肽组合物在制备预防和治疗老年痴呆症的药物或保健食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的多肽组合物在制备预防和治疗老年痴呆症的药物或保健食品中的应用，其特征在于，所述药物或保健食品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、丸剂或滴丸。
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