CN107349416A - 一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物 - Google Patents

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徐峻
李婵娟
顾琼
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Abstract

本发明涉及抗骨关节炎药物技术领域，尤其涉及一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物。本发明的抗骨关节炎药物中含有以上公开的三肽化合物，这些三肽化合物能显著减少骨关节炎细胞模型中NO和PGE2释放量、降低软骨细胞中COX‑2、iNOS、MMP‑1、MMP‑13表达量，能在抗炎的同时避免软骨基质蛋白和Ⅱ型胶原的降解，因此，含有所公开的三肽衍生物的抗骨关节炎药物对骨关节炎具有治疗效果。

Description

一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物
技术领域
本发明涉及抗骨关节炎药物技术领域，尤其涉及一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物。
背景技术
骨关节炎是关节软骨缓慢进展的退行性病变，由关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生综合形成，其造成的疼痛和运动障碍是50岁以上人群丧失劳动能力的主要原因，因而被世界卫生组织称为“致残率最高的头号疾病”。
骨关节炎发病率随着年龄增加显著升高。在荷兰40岁人群中骨关节炎发病率为10-20％，60-70岁人群中发病率则高达55％，女性发病率(75％)高于男性。据美国国家健康访谈普查(NHIS)估计，美国关节炎患者到2030年将增至6.7亿1。我国人口老龄化严重，骨关节炎发病率随之攀升。据中国国家统计局统计，2015年我国60周岁以上老龄人口为2.1亿，占总人口的15.5％。中国疾病预防控制中心报道，截至2011年，我国60岁以上人群骨关节炎发病率达55％，全国约有1.2亿人存在不同程度的骨关节问题，骨关节炎对我国国民健康危害极大。
然而，骨关节炎的根治仍是世界性难题，临床上仍缺乏能有效治愈骨关节炎的药物。目前，对于骨关节炎的治疗主要是解除疼痛症状(如使用消炎镇痛药)、维持或改善关节功能(如使用氨基葡萄糖类药物)，对晚期患者，在全身情况能耐受的条件下则进行人工关节置换术。硫酸氨基葡萄糖是软骨基质聚多糖和关节液聚氨基葡萄糖的必须构成成分，可以刺激软骨细胞合成聚氨基葡萄糖和蛋白聚糖、刺激滑膜细胞合成透明质酸，起到保护和改善关节损伤作用，因而被用于预防和治疗各种类型的骨关节炎。但硫酸氨基葡萄糖有胃肠道症状和过敏反应等副作用，使用受限。
发明内容
本发明针对现有的骨关节炎药物生物活性低且具有毒副作用而限制临床应用的问题，提供一种有效成分为三肽衍生物的抗骨关节炎药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物，包括三肽化合物或包括三肽化合物与药学上可接受的载体，所述三肽化合物的结构式为：
优选的，所述三肽化合物的结构式中，R基团为：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的抗骨关节炎药物中含有以上公开的三肽化合物，这些三肽化合物能显著减少骨关节炎细胞模型中NO和PGE2释放量、降低软骨细胞中COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13表达量，能在抗炎的同时避免软骨基质蛋白和Ⅱ型胶原的降解，因此，含有所公开的三肽衍生物的抗骨关节炎药物对骨关节炎具有治疗效果。
附图说明
图1为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞NO释放的活性数据；
图2为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞PGE2释放的活性数据；
图3为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞COX-2表达量的活性数据；
图4为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞iNOS表达量的活性数据；
图5为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞MMP-1表达量的活性数据；
图6为三肽化合物KDPT抑制骨关节炎模型中软骨细胞MMP-13表达量的活性数据。
图7为三肽化合物K2和K5抑制骨关节炎模型中软骨细胞MMP-1表达量的活性数据；
图8为三肽化合物K2和K5抑制骨关节炎模型中软骨细胞MMP-13表达量的活性数据。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
根据现有文献的记载方法，本发明所述的三肽化合物采用以下所示合成路线的方法合成：
上述三肽化合物的合成路线中，所述的Pybop reagent、LiHMDS、TEA、TFA的结构式分别如下所示。
本发明所述三肽化合物作为抗骨关节炎药物应用的药效相关实验如下试验1-5。
试验1-5中所述的三肽化合物(KDPT)的结构如下：
试验1：细胞培养
骨科手术室取膝关节置换手术的绝经后女性患者(年龄：65岁以上)的软骨，迅速转移至细胞培养室，在超净工作台用眼科剪切取软骨组织，越细越好，至6mm3大小的碎块，放入培养皿，加DPBS溶液清洗两次，每次5min，除去上清液后加入0.25％胰酶(m/V，g/mL)消化30min，然后吸弃上清液，并加入0.02％II型胶原酶(m/V，g/mL)于37℃和5％CO2(V/V)，置于培养箱内消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％FBS(V/V)的高糖DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清液，细胞沉淀用含10％FBS(V/V)的高糖DMEM培养基培养，每天在倒置荧光显微镜下观察生长情况，每2天换液1次，待软骨细胞铺满瓶底后，用0.25％胰酶(m/V，g/mL)进行消化和传代，传代后继续用含10％FBS(V/V)的高糖DMEM培养基培养。
实验2：IL-1β刺激软骨细胞体外膝骨关节炎模型及药物干预
将培养的第二代的人软骨细胞按每孔3×105个细胞种植于6孔板，培养至细胞融合度达到80％(V/V)左右时，吸弃培养基，用DPBS洗两次后，分为以以下四组进行试验：空白对照组只添加细胞培养液(高糖DMEM培养基+10％大鼠空白血清V/V)；模型对照组添加细胞培养液(高糖DMEM培养基+10％大鼠空白血清V/V)，并且加入10ng·mL-1IL-1β；含药血清高剂量组：以10μM的三肽化合物预处理细胞2h，添加细胞培养液(DMEM培养基+10％大鼠空白血清V/V)，并且加入10ng·mL-1IL-1β。含药血清低剂量组：以2μM的三肽化合物预处理细胞2h，添加细胞培养液(DMEM培养基+10％大鼠空白血清V/V)，并且加入10ng·mL-1IL-1β。以上各组细胞分别设3个复孔，继续培养24h后收集各组细胞以及上清液。
试验3：三肽化合物抑制骨关节炎模型中软骨细胞NO的测试
软骨细胞内NO含量是反应其免疫炎症反应的指标之一，使用碧云天的NO检测试剂盒按照说明书以Griess方法测试由上述实验二中四组试验收集到的细胞上清液中NO含量，具体为：
将Griess试剂I和II取出恢复室温。以培养液(DMEM培养基+10％大鼠空白血清V/V)稀释标准品，将标准品和细胞培养上清液按50μL/孔加入至96孔板中，按50μL/孔加入Griess试剂I，再加入50μL/孔Griess试剂II，于540nm测定吸光度。根据NO试剂盒和多功能酶标仪检测540nm处吸光度，减去空白对照组的本底吸光度值，根据标准曲线计算各组NO的绝对含量，所有数据均表示为平均值±标准方差。
测试结果如图1所示，为三肽化合物抑制骨关节炎模型中软骨细胞NO释放的活性数据，经IL-1β刺激，软骨细胞内的NO含量增加，而化合物KDPT能剂量依赖性的降低软骨细胞中NO释放量，说明化合物KDPT能抑制软骨细胞中炎症进程。
试验4三肽化合物抑制骨关节炎模型中软骨细胞前列腺素E2(PGE2)的测试
采用ELISA试剂盒，根据试剂盒说明书检测上清液中PGE2含量。
测试结果如图2所示，为三肽化合物抑制骨关节炎模型中软骨细胞PGE2释放的活性数据，PGE2是细胞内炎症反应的另一指标，IL-1β刺激下细胞内PGE2含量显著上升，而化合物KDPT能剂量依赖性降低软骨细胞中PGE2释放量，说明化合物KDPT能抑制软骨细胞中炎症进程。
试验5三肽化合物下调COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13基因表达量的活性测定
使用RNAiso Plus提取软骨细胞的总RNA，通过Oligo dT18将1μg总RNA逆转录为cDNA，通过定量PCR技术，使用Toyobo公司ThunderBird SYBR qPCR Mix试剂按照说明书对引物进行PCR扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用β-actin为内参，检测目的基因相对于内参基因的表达变化来定量。采用2-ΔΔCt方法分析数据(即实验组目的基因相对于对照组的表达量的变化倍数)。
所用引物为：
GAPDH(sense:5’-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3’；antisense:5’-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3’)、
COX-2(sense:5’-GAGAGATGTATCCTCCCACAGTCA-3’；antisense:5’-GACCAGGCACCAGACCAAAG-3’)、
iNOS(sense:5’-TTTCCAAGACACACTTCACCA-3’；antisense:5’-ATCTCCTTTGTTACCGCTTCC-3’)、
MMP-1(sense:5’-ATTTCTCCGCTTTTCAACTT-3’；antisense:5’-ATGCACAGCTTTCCTCCACT-3’)、
MMP-13(sense:5’-TGCTGCATTCTCCTTCAGGA-3’；antisense:5’-ATGCATCCAGGGGTCCTGGC-3’)。
检测目的基因相对于内参基因的表达变化来定量。采用2-ΔΔCt方法分析数据(即实验组目的基因相对于对照组的表达量的变化倍数)。
测试结果如图3-4所示，10μM浓度下的三肽化合物能显著降低软骨细胞内COX-2和iNOS的mRNA表达量(三肽化合物处理过的细胞COX-2和iNOS的mRNA表达量分别为模型对照组的0.32倍和0.42倍)。
如图3所示，相对于模型组，化合物KDPT浓度依赖性降低COX-2的mRNA表达量，COX-2是细胞内前列腺素合成所必须的酶，降低COX-2的mRNA表达量能减少细胞内PGE2产量，减轻炎症反应。
如图4所示，iNOS是细胞内NO合成的催化酶，相对于模型组，化合物KDPT浓度依赖性降低COX-2的mRNA表达量，进一步可减少细胞内NO产量，减轻炎症反应。
基质金属蛋白酶(MMPs)能降解各类胶原蛋白，MMP-1参与了细胞外间隙胶原纤维的代谢及许多非基质底物和细胞表面分子的分裂，在骨关节炎的发病过程中发挥了重要作用。如图5所示，相对于模型组，化合物KDPT浓度依赖性降低MMP-1的mRNA表达量，从而减少MMP-1对软骨基质蛋白的破坏。
MMP-13是已知的惟一存在于结缔组织中可以裂解Ⅱ型胶原三螺旋结构的蛋白酶，其优先降解Ⅱ型胶原，促进胶原三螺旋结构的裂解膨胀，对Ⅱ型胶原的降解和破坏是不可逆性的，Ⅱ型胶原的降解和破坏导致软骨支架结构的崩塌，软骨细胞赖以发挥功能的结构基础遭到破坏，激发进一步的炎症反应和软骨组织破坏，造成炎症与破坏的恶性循环。如图6所示，相对于IL-1β刺激的模型组，化合物KDPT计量依赖性的降低细胞内MMP-13的mRNA含量，阻止MMP-13对II型胶原的破坏。
此外，还以上述试验1-5所示的方法分别测试了三肽化合物K2和K5作为抗骨关节炎药物的药效。
三肽化合物K2和K5的结构通式与本发明所述的三肽化合物的结构通式相同，为：其中，K2的结构式中，R为：K5的结构式中，R为：
测试结果如图7和图8所示，K2和K5不能降低MMP-1的mRNA含量，K2甚至增加了MMP-13的mRNA含量，K5也不能降低MMP-13的mRNA含量。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (2)

1.一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物，其特征在于，包括三肽化合物或包括三肽化合物与药学上可接受的载体，所述三肽化合物的结构式如下：
2.根据权利要求1所述一种含三肽化合物的抗骨关节炎药物，其特征在于，所述三肽化合物的结构式中基团R为：
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