CN110882286A - 去壁灵芝孢子粉的用途 - Google Patents

Abstract

提供了去壁灵芝孢子粉在预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途，特别是在制备预防或治疗血栓、心衰及动脉粥样硬化、冠心病的药物方面的用途。此外，还提供了去壁灵芝孢子粉在调控炎症反应、抑制心血管疾病相关的炎症因子产生的药物中的用途。

Description

去壁灵芝孢子粉的用途

技术领域

本发明涉及去壁灵芝孢子粉，使用该灵芝孢子粉治疗疾病，特别是心血管相关疾病的用途，以及调控炎性应答的用途。

背景技术

心血管疾病又称循环系统疾病，是心脏、心脏瓣膜和血管疾病的总称，包括脑血管疾病、冠心病、风湿性和先天性心脏病、静脉血栓栓塞、动脉粥样硬化、心脏瓣膜病、主动脉和外周血管疾病等。心血管疾病患者可能会出现许多并发症，如心肌梗塞、中风、心绞痛、短暂性缺血发作、充血性心力衰竭、主动脉瘤、严重的瓣膜狭窄或反流以及死亡。心血管疾病是全球第一大死亡原因，每年导致1700多万人死亡，约占总死亡人数的31％。除了高致死率，心血管病的高发病率和高致残率给社会、家庭和患者个人带来沉重的经济负担和心理负担。因此，心血管疾病的预防和治疗是重大的公共卫生领域问题。

随着医疗技术不断进步，目前已有多种治疗心血管疾病的化学药上市，其作用靶点明确、起效迅速，但存在以下不足：(1)靶点单一，可能引起药物依赖性；(2)需要长期服用；(3)具有一定的副作用，比如临床研究发现过量使用降脂药物会引起肝肾功能异常等。长期的临床实践和科学研究表明，中药具有多成分、多靶点、多通路、多途径作用特点，在治疗心血管疾病等复杂性疾病中具有独特优势，被越来越多的患者和医务人员接受。

灵芝是我国传统珍贵药材，具有很高的药用价值。灵芝孢子是灵芝发育后期弹射出来的生殖细胞，含有丰富的灵芝多糖、三萜、甾醇、氨基酸、核苷等成分。然而，灵芝孢子含有主要由几丁质构成的双层孢壁，占比60％以上，且耐酸碱，在人体内也难以降解，阻碍了有效成分在体内的吸收利用。因此为了提高灵芝孢子粉的效果，近年来发展了各种破壁技术，包括物理法、化学法、生物酶解法等。研究表明，破壁孢子粉的药效通常优于未破壁孢子粉，表现出较好的抗肿瘤、增强免疫等活性。但是，破壁后壁壳仍然与有效成分混杂在一起，有效成分的绝对含量依然很低，而且壁壳由于不能被人体消化吸收，因此长期蓄积，有可能导致消化不良、便秘等副作用。

本申请的发明人通过水洗离心、超音速气流破壁、去壁纯化、浓缩干燥等技术，使得壁壳与有效成分分离，获得了一种特定的去壁灵芝孢子粉，显著提高了灵芝孢子粉有效成分的含量，增强了药效。

本申请公开了使用去壁灵芝孢子粉来预防、减轻或治疗心血管相关疾病及其并发症，包括血栓、心衰、冠心病及动脉粥样硬化，以及调控炎症应答和炎症因子的产生。

发明内容

本发明目的是提供灵芝孢子粉，特别是去壁灵芝孢子粉在预防和/或治疗心血管相关疾病的药物中的应用，以及在调控炎症应答和炎症因子的产生方面的应用。

在一个方面，本申请提供了一种去壁灵芝孢子粉在制备用于预防、减轻或治疗受试者中的心血管相关疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述去壁灵芝孢子粉通过包括以下步骤的制备方法获得：

(a)将灵芝孢子原料筛选、水洗离心和干燥；

(b)对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，得到破壁灵芝孢子粉；

(c)分别用乙醇和水浸泡破壁的灵芝孢子粉，合并浸泡液，过滤除去壁壳；和

(d)将所得滤液浓缩并干燥成固体粉末。

在一些实施方案中，所述去壁灵芝孢子粉的粗多糖和/或三萜含量显著高于破壁灵芝孢子粉。所述破壁灵芝孢子粉是未经上述(c)-(d)步骤处理的灵芝孢子粉。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：在步骤(b)中，采用流化床式气流粉碎机进行破壁，并且破壁率达到80-100％。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：在步骤(c)中，在50-100℃分别用乙醇溶液和水各浸泡1-2次，每次1-3小时。在一些具体的实施方案中，所述方法包括：在步骤(c)中，依次用体积分数为20％-95％的乙醇溶液和水在50℃-100℃各浸泡1-2次，每次1-3小时。在一些具体的实施方案中，所述方法包括：在80℃用60％的乙醇溶液浸泡2次，每次2小时，然后在60℃用水超声浸泡2次，每次1小时。

所述心血管相关疾病可选自，例如血栓形成、动脉粥样硬化、脑血管疾病、冠心病、风湿性和先天性心脏病、静脉血栓栓塞、心脏瓣膜病、主动脉、外周血管疾病和心衰。

在一些实施方案中，所述心血管相关疾病为血栓形成。所述去壁灵芝孢子粉能够改善受试者中的红细胞强度，并抑制血栓形成。

在一些实施方案中，所述心血管相关疾病为心衰。所述去壁灵芝孢子粉能够改善患有心衰的受试者中的心脏面积、静脉淤血、心输出量或血流速度。

在一些实施方案中，所述心血管相关疾病为冠心病，例如表现为心绞痛症状的冠心病。所述去壁灵芝孢子粉能够改善患者胸闷、心绞痛、胸痛、心悸、和/或气短等症状。

在一些实施方案中，所述药物用于降低心血管疾病相关的炎症因子产生。所述炎症因子可包括但不限于，IL-12、TNF-α、和IL-6。所述炎症因子由免疫细胞，例如巨噬细胞产生，或者由血管内皮细胞(例如受损伤的)产生。

在一个方面，本申请提供一种去壁灵芝孢子粉在制备用于预防、减轻或治疗受试者中的心血管疾病相关的炎症或调控心血管相关的炎症应答的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述炎症是TLR4介导的炎症。

在一些实施方案中，所述去壁灵芝孢子粉降低心血管疾病相关的炎症因子产生。所述炎症因子可包括但不限于，IL-12、TNF-α、和IL-6。

在一个方面，本申请提供一种去壁灵芝孢子粉在制备用于调控炎症应答的药物中的用途。所述去壁灵芝孢子粉用于降低，例如巨噬细胞或血管内皮细胞中的炎症因子释放。在一些实施方案中，所述炎症应答与心血管疾病相关，例如是在心血管疾病中产生或增加的炎症应答。在一些实施方案中，所述炎症应答是血管内皮细胞损伤引起的炎症应答。

在一个方面，本申请还提供去壁灵芝孢子粉在制备用于降低炎症因子释放的药物中的用途。

在一些实施方案中，可以将所述药物与别的治疗心血管疾病的药物，例如氯吡格雷或阿司匹林组合施用。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。

附图简述

图1显示施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉对苯肼诱导的斑马鱼血栓形成的预防及治疗作用，图1A为斑马鱼心脏红细胞染色强度定量结果的柱状图，图1B为相应的预防血栓作用％的比较图。

图2显示施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉对花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓形成的预防及治疗作用，图2A为斑马鱼心脏红细胞染色强度定量结果的柱状图，图2B为相应的预防血栓作用％的比较图。

图3显示施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉对普纳替尼诱导的斑马鱼血栓形成的预防及治疗作用，图3A为斑马鱼心脏红细胞染色强度定量结果的柱状图，图3B为相应的预防血栓作用％的比较图。

图4显示施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉改善维拉帕米诱导斑马鱼心衰功能，A为心脏面积定量结果的柱状图和相应的心脏扩大改善率％的比较图；B为静脉淤血面积定量结果的柱状图和相应的静脉淤血改善率％的比较图；C为心输出量定量结果的柱状图和相应的心输出量增加率％的比较图；D为血流速度定量结果的柱状图和相应的血流速度增加率％的比较图。

图5显示去壁灵芝孢子粉对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞(RAW264.7)炎症保护作用。预给药10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的去壁灵芝孢子粉于炎症损伤模型巨噬细胞(RAW264.7)中，可显著抑制IL-12、TNF-α和IL-6的释放。

图6显示去壁灵芝孢子粉对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症保护作用。预给药10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的去壁灵芝孢子粉于内皮损伤模型人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，可显著抑制IL-12、TNF-α和IL-6的释放。

具体实施方式

本发明提供了去壁灵芝孢子粉在防治心血管疾病中的应用，尤其是在制备用于预防或治疗血栓、心衰、冠心病及动脉粥样硬化药物方面的应用，以及在调控炎症应答中的用途。

与破壁灵芝孢子粉相比，本发明所用的去壁灵芝孢子粉(又可称为“精制的灵芝孢子粉”)所含主要活性物质成分和含量有较大差异，其中粗多糖及总三萜含量显著增加。本发明所用的去壁灵芝孢子粉的制备方法如实施例1所示(亦参见专利CN104013652B，该专利全部内容通过提述并入本文中)，而破壁灵芝孢子粉，是指破壁后未经过去壁精制步骤而得到的灵芝孢子粉(见实施例1)。与破壁灵芝孢子粉相比，本发明所用的去壁灵芝孢子粉安全性更佳，例如在小鼠中对破壁灵芝孢子粉最大耐受量(MTD)为27.2g/kg，而对去壁灵芝孢子粉最大耐受量为36.0g/kg。

(一)心血管相关疾病

如本文使用的，术语“心血管疾病”是一组心脏和血管疾患的名称，包括高血压(如血压升高)、冠心病(如心脏病发作)、脑血管疾病(如中风)、周围血管疾病、心力衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病、心肌病、动脉粥样硬化等。血栓形成广义上属于心血管疾病，同时也是大部分心血管疾病的病因。心力衰竭(简称心衰)是心血管疾病发展到晚期出现的一种临床综合征，属于心血管疾病范畴。冠心病(全称为冠状动脉粥样硬化性心脏病)，其成因是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，从而造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。心绞痛是冠心病的一个常见症状。

血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，其起因可能来源于心、血管内膜损伤、血流改变和血液性质改变等。血栓形成对不同的组织、脏器都会带来危害，比如当供养心脏血液的冠状动脉被血栓阻塞，心脏细胞就会缺血缺氧，不及时处理就可能梗死，即心肌梗死。

血栓形成主要有三个要素：心血管内膜的损伤、血流状态的改变和血管凝固性的增加，以上任一个都可以促进血栓形成。血管内膜位于血管壁的最内层，由内皮和内皮下基质组成，其结构完整和功能正常对血管发挥生理功能至关重要，也是预防动脉粥样硬化及相关心脑血管疾病的关键环节。血管内膜直接与血液接触的主要是连续单细胞层的内皮细胞，因此在血管内膜损伤过程中，内皮细胞最早出现功能异常或结构破坏。例如，正常血管内皮可屏蔽低密度脂蛋白或其他有害物质的侵袭、沉积到内膜下，阻断动脉粥样硬化病变的起始和进展，这在血管分叉及血流剪切力变化较大的动脉粥样硬化中尤为重要。

在血栓性疾病的研究过程中，已经建立了许多动物血栓模型。斑马鱼幼鱼通体透明，血细胞在心脏和血液循环系统的堆积非常容易观察，因而利用斑马鱼来建立血栓模型极为方便。具体而言，由于斑马鱼胚胎透明，整个心脏发育过程可被高分辨率成像，心脏形态和功能可在活体胚胎上观测和发现。斑马鱼胚胎和日龄较小的幼鱼可通过皮肤弥散供氧，即使在外界供氧终断的情况下胚胎仍能存活较长一段时间，这种优势在研究致死率高的心血管疾病方面是小鼠所不具备的。而且，斑马鱼中枢神经系统、视觉系统以及血液在基因分子水平上与人类的相似度达85％，尤其是心血管系统，早期的发育过程与人类极度相似，并且斑马鱼有类似人类的止血机制(斑马鱼血小板具有细胞和体液止血机制)以及斑马鱼的动脉血管形成机制与人类相同。

本发明中采用了几种诱导剂来诱导斑马鱼中的血栓模型，这些诱导剂包括苯肼、花生四烯酸和普纳替尼。如实施例中所验证的，本发明采用的不同剂量水平的去壁灵芝孢子粉在上述三种诱导剂诱导的血栓形成模型中一般都产生了显著优于破壁灵芝孢子粉、阳性对照(氯吡格雷或阿司匹林)或与阳性对照相当的技术效果，尤其在中剂量水平，其表现优于低剂量水平和高剂量水平。例如，施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的去壁灵芝孢子粉预防和治疗给药可明显抑制苯肼诱导的斑马鱼血栓形成，预防血栓作用分别达到59％、80％和40％；可明显抑制花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓形成，预防血栓作用分别达到21％、48％和3％；可明显抑制普纳替尼诱导的斑马鱼血栓形成，预防血栓作用分别达到为53％、77％和93％。

在另一方面，几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭或心衰。本发明通过用维拉帕米诱导斑马鱼中的心衰模型，测量斑马鱼心脏面积、静脉淤血面积、心输出量、和血流速度等评估心衰严重程度的参数，验证了本发明的去壁灵芝孢子粉有比破壁灵芝孢子粉更好的效果，相比于阳性对照(地高辛)也具有可比的或更好的效果。例如，施用100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的去壁灵芝孢子粉预防和治疗给药可明显改善维拉帕米诱导的斑马鱼心衰。其中心脏扩大改善率分别为88％、77％和43％，静脉淤血改善率分别47％、58％和18％，心输出量增加率分别67％、41％和20％，血流速度增加率分别为62％、36％和-4％。

在又一方面，对患有冠心病的人患者施用去壁灵芝孢子粉，能显著减轻冠心病的严重程度，改善冠心病相关的症状，如心绞痛、胸闷、胸痛、心悸、和/或气短症状。

(二)炎症应答

炎性反应是内皮损伤和动脉硬化发生、发展的重要机制，炎症对内皮细胞的损伤主要表现在影响内皮祖细胞的功能和数量，降低一氧化氮的合成和生物利用率以及增加活性氧簇等一系列相关的内皮功能障碍。当血管发生炎症反应时，B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核-巨噬细胞被激活，从而产生大量的IL-6、TNF-α和C反应蛋白(CRP)，给血管内皮带来损伤。动脉粥样硬化形成的原因之一是众多危险因子损伤血管内皮而引发的一系列炎症反应，并且巨噬细胞在动脉粥样硬化形成的各个阶段都发挥着重要的作用，包括免疫细胞的募集和分化，以及通过分泌促炎性细胞因子来传播炎症环境。可以通过建立炎症模型来反应动脉粥样硬化的发生发展，如实施例中所示的体外巨噬细胞及血管内皮细胞损伤引起的炎症模型。

此外，如上文所述，炎症与心血管疾病之间存在着复杂的网络联系，例如动脉粥样硬化、高血压、心衰和心肌病等的发病过程都有炎症因子参与。炎症因子是指在炎症过程中由细胞产生和分泌参与炎症反应的物质，包括趋化因子、黏附因子、细胞因子、转化生长因子，例如C反应蛋白、淀粉样蛋白A、白介素-1、白介素-6、白介素-12、白介素-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。由于心血管疾病过程中有众多炎症因子参与，炎症标志物是心血管病过程中的关键分子，可作为疾病的发生和预测的检测指标。而且作为治疗靶点，降低和阻断特定的炎症分子能够改善疾病进程。本发明人发现，在人巨噬细胞和血管内皮细胞损伤模型中施用去壁灵芝孢子粉，可显著抑制IL-12、TNF-α和IL-6等炎症因子的释放，因此，能够改善内皮损伤及炎症损伤。

有益效果：本申请的发明人发现，施用去壁灵芝孢子粉能有效地抑制斑马鱼模型中的血栓形成，其抑制效果甚至能显著优于已知的抗血栓药物如氯吡格雷或阿司匹林。在体外巨噬细胞或血管内皮细胞损伤引起的炎症中，施用该去壁灵芝孢子粉还能显著抑制炎症因子如IL-12、TNF-α、IL-6的释放。

因此，特定的精制后的去壁灵芝孢子粉对多种血栓模型及心衰模型均有良好的治疗作用，且可抑制IL-12、TNF-α和IL-6等炎症因子，表明其具有多靶点的作用特点，有望开发成为一种新的心血管疾病预防或治疗药物。而且，本发明的去壁灵芝孢子粉是一种纯天然药物，毒副作用小，既可以用作治疗药物或预防药物，也可作为保健食品。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：去壁灵芝孢子粉的制备和表征

通过以下步骤制备去壁灵芝孢子粉：

(1)原料初筛：称取灵芝孢子原料，过筛除去杂质，得到过筛的灵芝孢子；

(2)水洗离心：将过筛的灵芝孢子加入蒸馏水搅拌10-30分钟，然后静置10-30分钟；除去上层瘪壳、下层泥沙与杂质，取中层孢子悬浮液，离心甩除水分，得到湿灵芝孢子；

(3)干燥：湿灵芝孢子干燥至水分含量在7％以下，得到干燥的灵芝孢子；

(4)破壁：采用流化床式气流粉碎机对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，使破壁率达到80％～100％，得到破壁灵芝孢子粉；

(5)去壁精制：将破壁的灵芝孢子粉置于提取罐中，每次加入10-12质量倍的体积分数60％乙醇溶液，在80℃浸泡两次，每次2小时，之后加入7-10质量倍的水在60℃浸泡两次，每次1小时，合并所有浸泡液并分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳；

(6)浓缩：在60℃以下将去壁灵芝孢子粉滤液浓缩至缩至无醇味，得到浓缩液；

(7)干燥：浓缩液干燥成固体粉末即得去壁灵芝孢子粉。

取生产的去壁灵芝孢子粉，另取以常规工艺生产的破壁灵芝孢子粉，分别采用苯酚-硫酸法，香草醛-冰醋酸-高氯酸法测多糖含量和总三萜含量，以葡萄糖和齐墩果酸为对照，在490nm和550nm下以分光光度法测定样品的吸光度并根据标准曲线计算相应的浓度。结果表明，去壁灵芝孢子粉的粗多糖及总三萜含量相比于破壁灵芝孢子粉提高了近20倍。破壁灵芝孢子粉是按照实施例1步骤(1)-(4)操作得到的破壁灵芝孢子粉，不经去壁精制。

实施例2：去壁灵芝孢子粉的安全性评价

2.1实验动物

ICR小鼠(浙江省实验动物中心提供)，实验动物许可证号：SCXK(浙)20080033。饲养于清洁级动物房内，温度18-26℃，相对湿度50-60％，光照明暗交替各12小时，通风22次/小时。

2.2实验药物

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

破壁灵芝孢子粉(实施例1中(1)-(4)所述制备)

2.3方法和结果

ICR小鼠30只，雌雄各半，按体重随机分成3组，分别为破壁灵芝孢子粉、去壁灵芝孢子粉组和1个对照组，每组10只。各组小鼠禁食不禁水16小时后按体重灌胃给药，给药体积为0.4ml/10g体重。视给药后各组小鼠状态，如无明显中毒症状，6小时后再给药1次。给药后即刻观察动物的小鼠死亡、中毒症状，连续观察14天。每周称体重一次。

破壁灵芝孢子粉、去壁灵芝孢子粉24小时内以可配制的样品最大浓度给予小鼠2次(间隔6小时)，连续观察14天内，各组小鼠均无死亡；与对照比较，小鼠的体重均无明显差异(P>0.05)；除小鼠粪便颜色有改变外(可能与灵芝孢子粉的颜色有关)，无任何其它中毒表现。由此计算出小鼠对破壁灵芝孢子粉最大耐受量(MTD)为27.2g/kg，对去壁灵芝孢子粉最大耐受量为36.0g/kg。

该结果说明，与破壁灵芝孢子粉相比，本发明所用的去壁灵芝孢子粉安全性更佳。

实施例3：对苯肼诱导的斑马鱼血栓形成的预防作用及心脏功能改善作用评价试验

3.1实验动物

野生型AB系斑马鱼(由杭州环特生物科技股份有限公司鱼中心繁殖提供)，以自然成对交配繁殖方式进行。共420尾，年龄为受精后2天。

3.2实验药物

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

破壁灵芝孢子粉(实施例1中(1)-(4)所述制备)

氯吡格雷，白色粉末，批号为R-4411-3G，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用100％DMSO配制成7.5mg/mL的母液，-20℃储存备用。

苯肼，无色液体，批号为P108563，购自上海晶纯实业有限公司，临用时100％乙醇配制成1.5mM母液，现用现配。

3.3方法与结果

随机选取野生型AB系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，分别水溶给予100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉，阳性对照药为氯吡格雷7.5μg/mL浓度，每孔3mL溶液，同时设置正常对照组(不做任何处理)和模型对照组(不给药)。给药6h后，用苯肼诱发斑马鱼血栓模型，然后用邻联茴香胺进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements DTM图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼心脏红细胞染色强度(S)，统计学处理结果用mean±SE表示，用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。**表示p<0.01，***表示p<0.001。

结果如图1A显示，100μg/mL(低剂量)、333μg/mL(中剂量)和1000μg/mL(高剂量)浓度的去壁灵芝孢子粉对斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为2426、2792和2113。染色强度越高，代表红细胞强度越好，意味着对血栓的预防作用就越强。如图1B所示，以模型对照组为基准，低剂量、中剂量和高剂量组的预防血栓作用分别为59％、80％和40％(计算方式如下，S代表染色强度)，显著高于破壁灵芝孢子粉组(预防血栓作用分别为7％、19％和32％)。

该结果说明，在本实验浓度条件下灵芝孢子粉对苯肼诱导斑马鱼血栓形成有预防作用，预防效果强于破壁灵芝孢子粉，而且在低剂量和中剂量时效果显著优于氯吡格雷，在高剂量时效果与氯吡格雷相当。

实施例4：对花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓形成预防作用评价试验

4.1实验动物

黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼(由杭州环特生物科技股份有限公司鱼中心繁殖提供)，以自然成对交配繁殖方式进行。共180尾，年龄为受精后3天。

4.2实验药物

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

破壁灵芝孢子粉(实施例1中(1)-(4)所述制备)

花生四烯酸，100μL/瓶(浓度为3M)，批号为F1418031，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用100％DMSO配制成8mM的母液，现用现配。

阿司匹林，白色颗粒，100g/瓶，阴凉柜保存，批号为059K0199，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用100％DMSO配制成20mg/mL的母液，用100％DMSO按需稀释。

4.5方法与结果

随机选取黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，分别水溶给予100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉，阳性对照药阿司匹林20μg/mL浓度，每孔3mL药液，同时设置正常对照组(不做任何处理)和模型对照组(不给药)。给药3h后，用花生四烯酸诱发斑马鱼血栓模型，模型建立后，用邻联茴香胺进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements DTM图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼心脏红细胞染色强度(S)，统计学处理结果用mean±SE表示，用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。**表示p<0.01，***表示p<0.001。

结果如图2A和2B显示，100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的去壁灵芝孢子粉对斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为1962、2252和1764，预防血栓作用分别为21％、48％和3％，而破壁灵芝孢子粉不具有预防血栓作用。说明本实验浓度条件下去壁灵芝孢子粉对花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓形成有预防作用，在低剂量和中剂量时与阿司匹林效果相当。

实施例5：对普纳替尼诱导的斑马鱼血栓形成预防及治疗作用评价试验

5.1实验动物

野生型AB系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共180尾，年龄为受精后2天。

5.2实验药物

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

破壁灵芝孢子粉(实施例1中(1)-(4)所述制备)

阿司匹林，白色颗粒，100g/瓶，阴凉柜保存，批号为059K0199，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用100％DMSO配制成20mg/mL的母液，用100％DMSO按需稀释。

普纳替尼，淡黄色粉末，批号为13771，购自MedChemExpress(MCE)；使用时用100％DMSO配制成4mg/mL母液，-20℃储存备用。

5.3方法与结果

随机选取野生型AB系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，分别水溶给予100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉，阳性对照阿司匹林45μg/mL浓度，每孔3mL溶液，同时设置正常对照组(不做任何处理)和模型对照组(不给药)。灵芝孢子粉和普纳替尼共同处理斑马鱼18h后，用邻联茴香胺进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements DTM图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼心脏红细胞染色强度(S)，统计学处理结果用mean±SE表示，用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

结果如图3A和3B显示，100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的去壁灵芝孢子粉对斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为3418、3931和4273预防血栓作用分别为53％、77％和93％，显著高于破壁灵芝孢子粉组(预防血栓作用分别为15％、24％和34％)，说明在本实验浓度条件下灵芝孢子粉对普纳替尼诱导的斑马鱼血栓形成有预防作用，预防效果强于破壁灵芝孢子粉，并且三个剂量达到的效果与阿司匹林相当，其中高剂量效果最好。

实施例6：对维拉帕米诱导的心衰的心脏功能改善作用评价试验

6.1实验动物

野生型AB系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共180尾，年龄为受精后2天。

6.2实验药物

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

破壁灵芝孢子粉(实施例1中(1)-(4)所述制备)

盐酸维拉帕米，白色粉末，批号为L1303078，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用超纯水配制浓度为20mM母液。

地高辛，白色粉末，批号为K1417048，购自上海晶纯实业有限公司，临用时用DMSO配制浓度为0.1mg/mL母液。

6.3方法与结果

随机选取野生型AB系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，用维拉帕米诱导建立斑马鱼心衰模型，分别水溶给予100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的破壁灵芝孢子粉及去壁灵芝孢子粉，同时设置正常对照组(不做任何处理)和模型对照组(不给药)。药物处理结束后，一方面每组随机挑选10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照(放大倍数为56倍)，分析斑马鱼心脏扩大面积和静脉淤血面积；另一方面每组随机挑选10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析斑马鱼心输出量和血流速度，定量评价灵芝孢子粉对维拉帕米诱发的斑马鱼心衰的心脏功能改善作用。用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

对100μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度的两种灵芝孢子粉给药组，分别测算了斑马鱼心脏面积、静脉淤血面积、心输出量、和血流速，以及相应的相对于模型对照组的心脏扩大改善率、静脉淤血改善率、心输出量增加率、血流速度增加率。

心脏扩散改善率计算如下所示，其他改善率以类似的方式计算：

结果如图4A-4D和下表1和2所示。结果表明，低剂量和中剂量浓度的去壁灵芝孢子粉对维拉帕米诱导斑马鱼心衰的心脏功能有显著的改善治疗作用，治疗效果强于破壁灵芝孢子粉，并且效果至少与地高辛相当或显著优于地高辛。

表1去壁灵芝孢子粉对心衰斑马鱼心脏功能的改善作用

表2破壁灵芝孢子粉对心衰斑马鱼心脏功能的改善作用

实施例7：对血管内皮细胞损伤及巨噬细胞炎症调控的药效研究

7.1实验材料

去壁灵芝孢子粉(如实施例1所述制备)

RAW264.7细胞系(获得自浙江大学药学院药物信息学研究所)

HUVEC细胞系(获得自浙江大学药学院药物信息学研究所)

7.2方法与结果

7.2.1细胞铺板及分组

将巨噬细胞株RAW264.7及脐静脉内皮细胞HUVEC细胞常规培养、传代：在细胞超净工作台内，弃掉细胞上清液，并用0.25％EDTA胰酶轻微润洗细胞1次，然后吸取1mL胰酶至细胞培养皿轻柔摇晃均匀，置37℃细胞培养箱内消化。2min后于倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞变圆后，加入3倍体积的完全培养液中和胰酶后吹下细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入一定体积新鲜培养液重悬细胞，计数后，转移至新的细胞培养皿中，摇匀细胞后轻轻放置于细胞培养箱中培养。待贴壁后在培养液中添加不同浓度的去壁灵芝孢子粉(10/20/40/80ug/ml)。分别以脂多糖(LPS，1ug/mL)刺激6h，收集细胞上清并提取细胞RNA，以RT-qPCR法检测IL-12、TNF-α、IL-6表达。

细胞传代后，RAW264.7及HUVEC细胞被随机分为6组：空白对照组、模型对照组和4个药物干预组。具体分组情况如下所示：

表3RAW264.7及HUVEC细胞分组情况

7.2.2实验方法

7.2.2.1.灵芝孢子粉的炎症调控效应研究

(1)RAW264.7细胞培养同上

(2)给药待细胞贴壁，分别给予不同浓度的去壁灵芝孢子粉(10/20/40/80ug/ml)预给药2h。

(3)RAW264.7细胞增殖效应

以MTT法检测细胞的增殖情况：RAW及HUVEC细胞传代计数后，用含10％FBS完全培养基配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。CO₂培养箱中，分别加入不同剂量去壁灵芝孢子粉培养1、2、3天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。

(4)TLR4介导的炎症应答

以LPS刺激RAW264.7细胞，以RT-qPCR及ELISA法检测IL-12、TNF-α、IL-6等与心血管疾病密切相关的炎症因子的释放

7.2.2.2.灵芝孢子粉的血管内皮细胞保护效应研究

取人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，分别给予不同浓度去壁灵芝孢子粉同上，建立LPS内皮细胞损伤模型，以RT-qPCR及ELISA法检测IL-12、TNF-α、IL-6等与心血管疾病密切相关的炎症因子的释放。

7.2.3实验结果

结果如图5和图6所示，与模型对照组相比，去壁灵芝孢子粉可显著抑制巨噬细胞和人血管内皮细胞中IL-12、TNF-α、IL-6的释放。而且剂量越高，抑制效果越明显。

实施例8：在冠心病患者中的效果

第一名患者是56岁男性冠心病患者，表现出胸闷、心悸、气短，伴有头痛、恶心等症状，含服硝酸甘油片或休息后可缓解。无高血压病史，无糖尿病病史。体格检查T36.7℃，R20次/分，P81次/分，BP132/79mmHg。血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂分析正常。心电图提示前壁心肌缺血。

前期服用破壁灵芝孢子粉20天(4g/天)，未见好转，并出现轻微排便不畅。因此后期停用破壁灵芝孢子粉，服用本发明去壁灵芝孢子粉(4g/天)30天后，胸闷、心悸、气短等症状逐渐消除。心电图检查正常。后持续服用去壁灵芝孢子粉6个月，回访日常活动未发作胸闷。

第二名患者是62岁女性冠心病患者。患者因反复胸闷3周就诊，伴有胸痛，无头晕，活动后会加剧，休息后可缓解。初步诊断为冠心病。否认心脏病、高血压、糖尿病病史。体格检查T36.3℃，R19次/分，P78次/分，BP146/81mmHg。心电图窦性心律，T波改变。诊断为心绞痛症状的冠心病。

给予本发明去壁灵芝孢子粉(6g/天)15天后，心绞痛、胸痛、胸闷等胸部不适逐渐缓解。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

Claims (23)

1.一种灵芝孢子粉在制备用于预防、减轻或治疗受试者中的心血管相关疾病的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述灵芝孢子粉是去壁灵芝孢子粉，其包含相比于破壁灵芝孢子粉更高含量的粗多糖和/或三萜。

3.权利要求1或2的用途，其中所述去壁灵芝孢子粉通过包括以下步骤的制备方法获得：

(a)将灵芝孢子原料筛选、水洗离心和干燥；

(b)对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，得到破壁的灵芝孢子粉；

(c)分别用乙醇和水浸泡破壁的灵芝孢子粉，合并浸泡液，过滤除去壁壳；和

(d)将所得滤液浓缩并干燥成固体粉末。

4.权利要求3的用途，其中在步骤(b)中，采用流化床式气流粉碎机进行破壁，并且破壁率达到80-100％。

5.权利要求3或4的用途，其中在步骤(c)中，在50-80℃分别用乙醇溶液和水浸泡1-2次，每次1-2小时。

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述心血管相关疾病选自血栓形成、动脉粥样硬化、冠心病、风湿性和先天性心脏病、静脉血栓栓塞、心脏瓣膜病、主动脉和外周血管疾病、以及心衰。

7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述心血管相关疾病为血栓形成。

8.权利要求7的用途，其中所述血栓形成由血管内皮细胞损伤所致。

9.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述心血管相关疾病为心衰。

10.权利要求9的用途，其中所述药物用于改善患有心衰的受试者中的心脏面积、静脉淤血、心输出量或血流速度。

11.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述心血管相关疾病为动脉粥样硬化。

12.权利要求11的用途，其中所述药物用于减少动脉粥样硬化中的炎症因子产生。

13.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述心血管相关疾病为冠心病。

14.权利要求13的用途，其中所述药物用于改善冠心病相关的胸闷、胸痛、心绞痛、心悸、和/或气短症状。

15.一种去壁灵芝孢子粉在制备用于调控炎症应答的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述炎症是TLR4介导的炎症和/或心血管疾病相关的炎症。

17.权利要求15或16的用途，其中所述炎症是血管内皮损伤引起的炎症应答。

18.一种去壁灵芝孢子粉在制备用于降低炎症因子释放的药物中的用途。

19.权利要求18的用途，其中所述炎症因子是心血管疾病相关的炎症因子。

20.权利要求19的用途，其中所述炎症因子选自IL-12、TNF-α、IL-6和CRP。

21.权利要求16-20中任一项的用途，其中所述炎症因子由巨噬细胞或血管内皮细胞产生。

22.权利要求1-21中任一项的用途，其中所述药物还包含别的治疗心血管疾病的药物。

23.权利要求1-21中任一项的用途，其中所述药物还包含药学可接受的载体或辅料。

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