CN108721342A - 灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用 - Google Patents

灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用。所述的灵芝孢子粉优选为超低温冻融破壁法获得的灵芝孢子粉。本发明中利用压力超负荷诱导心肌肥厚小鼠模型，以左心室壁厚、内径、射血分数以及组织病理学等指标评价小鼠心脏形态结构和功能，结果表明灵芝孢子粉(150mg/(kg·BW))可修正压力超负荷诱导心肌肥厚小鼠的心脏形态结构和功能。同时，利用基因测序技术和生物信息学分析发现，灵芝孢子粉通过调控mRNA表达谱变化，多靶点、多途径整合调控作用实现其对压力超负荷导致心脏损伤的保护作用，其中内吞作用、胰岛素信号通路及黏着斑信号通路可能是其重要的调控机制。

Description

灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用 的药物中的应用
技术领域
本发明属于灵芝孢子粉技术领域，具体涉及灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用。
背景技术
心肌肥厚无论是内在(如遗传性高血压)还是外在(如动脉高压和瓣膜病)均是心肌细胞对生物力学增加的一种应激反应，以心肌细胞体积增大、蛋白质合成增加(如结构和收缩蛋白)、细胞间质改变以及胎儿基因再表达为主要特征，其不仅是维持心输出量所需、恢复心脏室壁张力正常化的一种适应性反应，更是引发心肌梗死、心律失常以及心力衰竭甚至猝死的独立危险因子。在心血管疾病病理进程初期阶段，心肌肥厚是一种对心脏的适应性反应，有利于提高心功能和减低室壁压力，长期持续的病理性心肌肥厚会导致心腔扩大、舒张功能障碍以及一系列失代偿反应，最终导致心力衰竭或猝死。心肌肥大程度是评估心脏疾病预后的重要因素之一，是多种心血管疾病的独立危险因素，已有流行病学研究表明，若心肌肥大则心功能不全、冠心病、心肌梗死以及心力衰竭的发病率升高2～3倍。因此，早期干预心肌肥厚的发生发展已成为防治心力衰竭的关键措施。目前临床上治疗心肌肥厚的药物有血管紧张素转化酶抑制剂，血管紧张素Ⅱ受体阻断剂，钙通道拮抗剂，β受体阻断剂和利尿剂等。虽然治疗该疾病的药物种类众多，但西药靶点单一、不良反应众多等因素限制了其防治心肌肥厚的疗效。因此，需寻找新的预防和逆转心肌肥厚的治疗策略成为国内外心血管疾病领域专家亟待解决的关键问题之一。
传统中药因具有多靶点、多途径以及生物活性成分丰富的优势已成为目前预防与治疗心血管疾病的重点，而灵芝就是其中之一。灵芝(又名灵芝草或瑞草)是一种中国传统的药用蘑菇，具有丰富的生物活性成分和多靶点的药理作用，在亚洲有2千多年药用历史中被认为是安全无毒的中药，用于促进健康、延长寿命以及防治系统性疾病，在美国草药协会植物安全手册(the American Herbal Products Association Botanical SafetyHandbook)中它被列为最安全的一类(1类药物)，在澳大利亚它被列为治疗用品协会(Therapeutic Goods Association，TGA)，无需处方或医疗监督即可购买和消费。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的卵形生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，且含有比灵芝更丰富的三萜类、多糖肽、脂肪酸类、酶类、蛋白质、硒元素以及多种矿物质元素等成分，药效远超于其母体灵芝，孢子集中起来呈粉末状即为灵芝孢子粉。国内外一些研究报道表明灵芝及其相关产品具有保护心脏作用，如心肌梗死、心脏毒性、心肌缺氧复氧损伤、离体心脏缺血再灌注损伤、心力衰竭以及降低血浆低密度胆固醇水平。但迄今为止，关于灵芝孢子粉对小鼠压力超负荷诱导代偿性心肌肥厚的作用及心脏组织基因表达谱调控作用的研究尚未见报道。
因此，需要研究灵芝孢子粉对压力超负荷诱导的代偿性心肌肥厚小鼠心脏的作用及基因表达谱的影响，探讨灵芝孢子粉干预心肌肥厚的作用靶点和信号通路，阐明其保护作用的调控机制，为临床预防与治疗心肌肥厚的策略提供新思路和方向。
发明内容
本发明的目的在于提供灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用。
优选的，所述防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用是通过调控mRNA表达谱改变从而抑制心肌肥厚和修正心脏功能来实现的。
优选的，所述灵芝孢子粉的有效剂量为150mg/(kg·BW)。
优选的，本发明中所述的灵芝孢子粉为超低温冻融法制备的破壁灵芝孢子粉。
作为本发明中的一种优选的实施方案，本发明所述破壁灵芝孢子粉通过以下方法获得：
(1)筛选：选取鲜活灵芝孢子粉通过特制目筛选后，获得灵芝孢子粉A；
(2)水洗：灵芝孢子粉A在恒温活水中浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉B；灵芝孢子粉B在食盐溶液中恒温下浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉C；灵芝孢子粉C在香醋溶液中恒温浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉D；灵芝孢子粉D在活水恒温浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉E；
(3)活水催化：将灵芝孢子粉E在活水中浸泡后，置于恒温恒湿设备中进行能量转化，激活灵芝孢子粉中的活性物质，获得灵芝孢子粉F；
(4)复合抗氧化：在灵芝孢子粉F中加入抗氧化剂葡萄籽提取物，混匀，获得含抗氧化剂的灵芝孢子粉G；
(5)干燥：将灵芝孢子粉G置于恒温恒湿设备中进行干燥，获得含有抗氧化剂且水分含量为5％的灵芝孢子粉H；
(6)低温破壁：将灵芝孢子粉H置于液氮中冷冻后，取出常温放置，如此冷暖交替重复多次，再经灭菌处理，获得破壁灵芝孢子粉。
在该破壁灵芝孢子粉的制备方法中：
优选的，步骤(1)中筛选时过300目筛。
优选的，步骤(2)中灵芝孢子粉A与活水的质量份配比为1：2，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为2h；灵芝孢子粉B与食盐溶液的质量份配比为1：2，食盐溶液的质量百分含量为2％，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为1h；灵芝孢子粉C与镇江香醋溶液的质量份配比为1:2，镇江香醋溶液的质量百分含量为1％，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为24h；灵芝孢子粉D与活水的质量份配比为1：2，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为1h；去除水分采用离心机甩干。
优选的，步骤(3)中活水的温度为28℃～30℃，浸泡时间为2h，恒温恒湿设备的温度为45℃，湿度为80％～85％，能量转化时间为24h。
优选的，步骤(4)中所述葡萄籽提取物的添加量为灵芝孢子粉F总质量的5％，所述葡萄籽提取物为市售产品。
优选的，步骤(5)中恒温恒湿设备的温度为40℃，湿度为5％。
优选的，步骤(6)中将获得的灵芝孢子粉H置于液氮中冷冻60min后，取出常温放置6h，如此冷暖交替重复5～7次，再经灭菌处理，获得破壁灵芝孢子粉。
本发明具有如下优点：本发明中首次研究灵芝孢子粉对压力超负荷诱导代偿性心肌肥厚的保护作用，并基于基因测序技术和生物信息学分析方法首次研究灵芝孢子粉对压力超负荷诱导代偿性心肌肥厚小鼠心脏组织mRNA表达谱的调控，发现其通过多靶点、多途径发挥其抑制心肌肥厚和修正心脏功能的作用，其中内吞作用、胰岛素信号通路及黏着斑信号通路的调控可能是其重要的调控机制。
附图说明
图1是具体实施方式中灵芝孢子粉修正心脏形态结构和心功能，A,各组小鼠心脏超声心动图(B-mode和M-mode)；B,心脏超声心动图参数；
图2是具体实施方式中各组小鼠心脏组织苏木素-伊红(HE)染色；
图3是具体实施方式中各组小鼠心脏组织信使核糖核酸(mRNA)表达谱，A,火山图分析；B,韦恩图分析；C,聚类热图分析；
图4是具体实施方式中各组小鼠共表达差异基因的基因本体(GO)分析(A)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析(B)，
图5是具体实施方式中内吞作用的信号通路图，★代表异常表达的信使核糖核酸(mRNA)。
具体实施方式
1材料和方法
1.1实验药物
本发明中使用的灵芝孢子粉是采用以下超低温冻融破壁方法制备获得：
(1)筛选：将鲜活灵芝孢子粉用特制300目进行筛选，除孢子中的杂志及空壳，在镜下检验，筛选大小一致、颗粒饱满的孢子，获得灵芝孢子粉A。
(2)水洗：①将灵芝孢子粉A与活水以1:2配比在23℃恒温下浸泡2h后，使用离心机甩干水分获得灵芝孢子粉B；②将灵芝孢子粉B与2％食盐溶液以1:2配比在23℃恒温下浸泡1h后，使用离心机甩干水分获得灵芝孢子粉C；③将灵芝孢子粉C与1％镇江香醋溶液以1:2配比在23℃恒温下浸泡24h后，使用离心机甩干水分获得灵芝孢子粉D；④将灵芝孢子粉D与活水以1:2配比在23℃恒温下浸泡1h后，使用离心机甩干水分获得灵芝孢子粉E。
(3)活水催化：将水洗获得的灵芝孢子粉E在28℃～30℃的活水培养液中浸泡2h后，将活水浸透的灵芝孢子粉置于生物恒温箱(温度45℃，湿度80％-85％)中进行24h能量转化，激发孢子中灵芝三萜、灵芝甾醇、生物碱和活性酶等多种活性物质，获得灵芝孢子粉F。
(4)复合抗氧化：将获得的灵芝孢子粉F中添加抗氧化剂--5％葡萄籽提取物，以60rmp/min转速，均匀搅拌30min，获得含抗氧化剂的灵芝孢子粉G，确保灵芝孢子破壁后活性物质不流失，提高灵芝孢子生物活性物质的抗氧化能力。
(5)常温干燥：将获得的灵芝孢子粉G置于恒温恒湿烘箱(温度40℃，湿度5％)中进行干燥，防止水分过多导致发霉或太干易碎，同时避免了高温烘烤破坏灵芝孢子的生物活性，获得含有抗氧化剂且水分为5％的灵芝孢子粉H。
(6)低温破壁：将获得的灵芝孢子粉H置于液氮中冷冻60min，取出后常温放置6h，冷暖交替重复5～7次，获得破壁灵芝孢子粉，将获得的破壁灵芝粉经低臭氧紫外照射灭菌处理后，定量分装即可。
(7)质量检测：检测灵芝孢子破壁率和粗多糖含量，其破壁率可达99.8％以上，粗多糖含量为0.508％，细度在600～1800目间时，到达合格标准。
1.2实验动物
27只C57BL/6J小鼠(wide type，WT)，6～8周龄，雄性，SPF级，由广东省医学实验动物中心提供[SCXK(粤)2013-0002]。所有小鼠饲养、无菌手术、组织取材以及无创心脏超声在广东省实验动物监测所屏障动物实验设施内进行【SYXK(粤)2012-0122】。饲养环境温度为22±2℃，湿度为60±2％，照明时间为12±2h。整个试验过程对动物的饲养及处置符合广东省实验动物饲养设施标准和实验动物3R原则。
1.3实验方法
1.3.1小鼠主动脉弓缩窄模型(TAC)制备
采用3.0％异氟烷吸入诱导麻醉，夹持小鼠四肢无明显反应后，仰卧位固定于操作台恒温垫上(37℃)，采用20号套管穿刺针针鞘从口腔进入行气管插管，插管成功后，连接小动物呼吸麻醉机(Matrx，USA)维持麻醉(1.5-2.0％异氟烷)并控制呼吸(潮气量1.2Ml，呼吸时比5:4，呼吸频率109)。待插管与麻醉成功后，将小鼠颈部及胸部被毛剃出，备皮碘伏和酒精消毒后，在胸前正中切开皮肤，切开第二肋间隙，用牵引器拉开纵膈，在双目体视眼科手术显微镜(SM-2000L，上海铁德医疗设备有限公司)下用无齿显微镜镊拨开胸腺，游离主动脉弓，在左颈总动脉与头臂干之间的主动脉弓部用27G垫针(0.6mm)垫扎，用7-0丝线对主动脉及垫针进行扎紧，结扎确实后迅速抽出垫针，剪断多余丝线，胸腺复位，关胸，待小鼠自主呼吸恢复后，移除气管插管，解除固定，将小鼠放置37℃恒温加热垫上继续观察至苏醒。假手术组除不做缩窄外，其余操作均与主动脉弓缩窄手术一致。
1.3.2动物分组和给药方式
C57BL/6小鼠随机分为3组：假手术组(Sham)，模型组(TAC)、灵芝孢子粉(1.1中制备的灵芝孢子粉，下同)干预组(TAC+GSP)，每组9只小鼠。各组动物适应性喂养7天后，第8天开始手术和灌胃给药处理，灌胃容积为0.1m L/20g体重；给药组剂量为人体推荐日剂量10倍(150mg/(kg·BW))，给药周期为4周，各组给药剂量如下：
假手术组(Sham)：术后给予相应容量的0.1％CMC-Na灌胃；
模型组(TAC)：术后给予相应容量的0.1％CMC-Na灌胃；
灵芝孢子粉干预组(TAC+GSP)：使用0.1％CMC-Na将灵芝孢子粉配置为30mg/mL灵芝孢子粉溶液灌胃，现配现用，避光。
1.3.3心脏超声心动图评价
给药处理4周后，对各组小鼠进行心脏超声心动图检查。小鼠在2.0％异氟烷吸入麻醉下仰卧位固定于37℃恒温加热板上，胸部及上腹部使用TM-100型医用超声耦合剂(天津市西苑寺制作所)脱毛，充分暴露皮肤后，应用Vevo2100超高分辨率小动物超声影像系统(VisualSonics Vevo2100，VisualSonics Inc.，Canada)，采用MS-400D探头进行心脏超声检测。取胸骨长轴切面，在左心室长轴切面基础上，探头顺时针旋转90°，即左室短轴切面，应用B-型和M-型超声心动图记录左心室运动情况，应用配套的分析软件分析超声心动图基本参数，如左室舒张末期前壁厚度(LVAW；d)、左室收缩末期前壁厚度(LVAW；s)，左室舒张末期后壁厚度(LVPW；d)、左室收缩末期后壁厚度(LVPW；s)，左室舒张末期内径(LVED；d)、左室收缩末期内径(LVED；s)，左心室舒张末期容积(LVEV；d)、左心室收缩末期容积(LVEV；s)以及左心室质量(LV Mass)，并计算评价心脏收缩功能参数：射血分数EF％＝[(LVEV；d-LVEV；s)/LVEV；d]×100和短轴缩短率FS％＝[(LVED；d-LVED；s)/LVED；d]×100。以上所有超声测量数值均取至少3个连续心动周期的平均值。
1.3.4心脏组织HE染色
动物试验终点后，处死动物，将新鲜的心脏取下后，用冰冻生理盐水清洗，滤纸擦干后放入4％多聚甲醛过夜固定、脱水、石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色后利用光镜显微镜观察(Leica，德国)心脏组织病理学变化。
1.3.5心脏组织mRNA芯片筛查与生物信息学分析
每组实验动物随机挑取3只小鼠，采集心脏样品后各组混合成一个样品进行mRNA芯片筛选，使用Reagent试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)提取心脏组织的总RNA，对RNA的浓度、纯度及完整性进行检测，RNA质检合格后，进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱等。芯片结果采用Agilent Microarray Scanner(G2505C)扫描得到原始图像，利用RosettaSystem(Rosetta Biosoftware)软件进行数据处理和分析，利用error model模型的P-value(Differentially expressed)和log2(ratio)进行差异mRNA筛选，筛选标准为上调或者下调倍数变化值log2(ratio)>＝1且P-value(Differentiallyexpressed)<0.05。应用DAVID Bioinformatics resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)对3组共同差异表达的基因进行基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析。
1.4统计分析
采用GraphPad Prism7统计软件进行数据分析，所有实验结果用平均值±标准误差(mean±SEM)表示，各组间差异比较采用two-tailed unpaired t-tests，p-value<0.05表示组间具有显著差异，p-value<0.01表示组间具有极显著差异。
2结果
2.1灵芝孢子粉对压力超负荷诱导心肌肥厚小鼠心脏形态结构和心脏功能具有保护作用
结果见图1。与假手术组(Sham)比较，术后4周模型组(TAC)的左室前壁(LVAW)、左室后壁(LVPW)以及左室校正质量[LV mass(corrected)]均极显著增加(p<0.01)，左室内径(LVED)和左室容积(LVEV)显著或极显著减小(p<0.05or p<0.01)，射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)均显著增加(p<0.01)；而灵芝孢子粉干预组(TAC+GSP)与模型组(TAC)比较，左室前壁(LVAW)和左室收缩末期后壁(LVPW；s)均显著或极显著变薄(p<0.05or p<0.01)，左室舒张末期内径(LVED；d)和左室收缩末期容积(LVEV；s)具极显著增大(p<0.01)，同时左室舒张末期后壁(LVPW；d)和左室校正质量[LV mass(corrected)]下降(p>0.05)，射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)均显著下降(p<0.01)，接近假手术组(Sham)
以上结果表明，术后4周模型组小鼠心脏处于代偿性心肌肥厚阶段，而经灵芝孢子粉干预后可以抑制心脏向心肌体肥厚和修正心功能，使心脏维持基本正常的形态结构和心功能。
2.2灵芝孢子粉对压力超负荷诱导代偿性心肌肥厚小鼠心脏组织结构的影响
结果见图2。假手术组心肌细胞大小正常、排列整齐，模型组(TAC)心肌细胞肥大、排列絮乱，而灵芝孢子粉干预组(TAC+GSP)可明显抑制心肌肥大并趋于正常，并且心肌细胞排列较整齐。
以上病理组织学观察表明，灵芝孢子粉可以抑制心肌肥大，对超负荷诱导的心肌肥厚疾病具有保护作用。
2.3差异表达基因筛选及聚类分析
与假手术组比较，模型组上调的mRNA基因有1998个，下调的mRNA基因有1394个；与模型组相比，药物干预组上调的mRNA基因有955个，下调的mRNA基因有1031个，见图3中A图。韦恩图(Venndiagram)分析显示3组共同差异表达的mRNA基因有1506个，见图3中B图。将3组共同差异表达的1506个mRNA基因应用OmicShare平台进行Cluster分层聚类分析，将表达程度相似的样品聚类在一起，展示各组间差异表达的mRNA基因，见3图中C图。与模型组比较，假手术与药物处理组mRNA上调、下调基因一致，上调的mRNA基因有809个，下调的mRNA基因有697个。
2.4差异基因GO分析和KEGG分析
3组共同差异表达的1506个mRNA基因经GO分析表明，其涉及的生物学过程(biological process，BP)主要包括细胞增殖生长迁移的负调控、序列特异性DNA结合转录因子活性的负调控、肌动蛋白丝解聚、半胱氨酸型内肽酶活性的活化参与细胞凋亡过程、缺氧反应以及G-蛋白偶联受体信号转导通路耦合到cGMP的核苷酸的第二信使等；其涉及的细胞组分(cellular component，CC)主要包括细胞质、细胞膜、局灶性黏连、分泌颗粒、内质网、外切体、线粒体膜、细胞外基质以及心肌Z盘等；其涉及的分子功能(molecularfunction，MF)主要包括蛋白结合、β-连环蛋白结合、碳水化合物结合、核酸结合、激动蛋白结合、水通道结合、神经肽激素结合、酶抑制剂活性、Rac GTP酶结合以及钙粘蛋白结合介导细胞-细胞粘附等，见图4中A图。同时，利用DAVID Bioinformatics resources 6.8在线分析工具对3组共同表达的差异基因进行KEGG信号通路分析发现mRNA主要富集在7条分子信号通路上(p<0.05)，分别为细胞内吞机制、mRNA监督通路、γ-氨基丁酸能的突触、胰岛素传导通路、黏着斑、轴突导向以及人类t淋巴细胞细胞性病毒感染，见图4中B图。利用KEGG数据库分析发现许多基因在参与细胞内吞机制中失调，见图5。
综合以上结果，⑴灵芝孢子粉对压力超负荷诱导代偿性心肌肥厚小鼠的心脏具有保护作用，如抑制心肌肥厚和修正心脏功能；⑵灵芝孢子粉通过调控mRNA表达谱改变，从多靶点、多途径的整合调控作用实现其对压力超负荷导致小鼠心脏损伤的保护作用，其中内吞作用、胰岛素信号通路及黏着斑信号通路可能是其重要的调控机制。
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.灵芝孢子粉在制备具有防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述防治代偿性心肌肥厚型心脏疾病作用是通过调控mRNA表达谱改变从而抑制心肌肥厚和修正心脏功能来实现的。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是：所述灵芝孢子粉的有效剂量为150mg/(kg·BW)。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征是：所述的灵芝孢子粉为超低温冻融法制备的破壁灵芝孢子粉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是所述的破壁灵芝孢子粉通过以下方法制得：
(1)筛选：选取鲜活灵芝孢子粉通过特制目筛选后，获得灵芝孢子粉A；
(2)水洗：灵芝孢子粉A在恒温活水中浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉B；灵芝孢子粉B在食盐溶液中恒温下浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉C；灵芝孢子粉C在香醋溶液中恒温浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉D；灵芝孢子粉D在活水恒温浸泡后，除去水分获得灵芝孢子粉E；
(3)活水催化：将灵芝孢子粉E在活水中浸泡后，置于恒温恒湿设备中进行能量转化，激活灵芝孢子粉中的活性物质，获得灵芝孢子粉F；
(4)复合抗氧化：在灵芝孢子粉F中加入抗氧化剂葡萄籽提取物，混匀，获得含抗氧化剂的灵芝孢子粉G；
(5)干燥：将灵芝孢子粉G置于恒温恒湿设备中进行干燥，获得含有抗氧化剂且水分含量为5％的灵芝孢子粉H；
(6)低温破壁：将灵芝孢子粉H置于液氮中冷冻后，取出常温放置，如此冷暖交替重复多次，再经灭菌处理，获得破壁灵芝孢子粉。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(1)中筛选时过300目筛。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(2)中灵芝孢子粉A与活水的质量份配比为1：2，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为2h；灵芝孢子粉B与食盐溶液的质量份配比为1：2，食盐溶液的质量百分含量为2％，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为1h；灵芝孢子粉C与香醋溶液的质量份配比为1:2，香醋溶液的质量百分含量为1％，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为24h；灵芝孢子粉D与活水的质量份配比为1：2，恒温浸泡时温度为23℃，浸泡时间为1h；去除水分采用离心机甩干。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(3)中活水的温度为28℃～30℃，浸泡时间为2h，恒温恒湿设备的温度为45℃，湿度为80％～85％，能量转化时间为24h。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(4)中所述葡萄籽提取物的添加量为灵芝孢子粉F总质量的5％；步骤(5)中恒温恒湿设备的温度为40℃，湿度为5％。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征是：步骤(6)中将获得的灵芝孢子粉H置于液氮中冷冻60min后，取出常温放置6h，如此冷暖交替重复5～7次，再经灭菌处理，获得破壁灵芝孢子粉。
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