CN104524599A - 一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物及其用途，该药物组合物包括miRNA-532反义核苷酸和药学上的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-532反义核苷酸的序列为5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’；载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的治疗和防治，本发明选用的原料科学合理，制备工艺简单，药物作用明显，使用范围广，安全可靠，应用环境友好。

Description

一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物及其用途

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药及用途，尤其是一种含miRNA-532反义核苷酸的药物组合物及其在预防或治疗心脏疾病中的用途。

背景技术：

心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界每年有一千七百多万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。随着人类生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据近期公布的最新统计结果表明，18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥大、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术方法用于心脏病的诊断和防治。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值；单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大和心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这可能是心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断和治疗具有及其重要的意义和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求一种新型药物组合物，确定调控心 肌细胞凋亡的心脏特异性表达的miRNA及其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病中的用途，用于心脏疾病的诊断与防治。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的药物组合物包括miRNA-532反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-532反义核苷酸的序列为5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选的为腺病毒载体；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。

本发明中所述的药物组合物中过表达miRNA-532反义核苷酸的腺病毒载体感染滴度为10¹⁶PFU。

本发明的miRNA-532反义核苷酸药物组合物用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的治疗和防治，以口服或注射方式给药；所述注射为静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。

本发明还提供一种用于预防或治疗心脏疾病的试剂盒，含有的miRNA-532反义核苷酸与载体构成药物导入体内，用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的预防与治疗。

本发明通过实验发现miRNA-532在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中表达显著上调；通过转染和注射miRNA-532反义核苷酸抑制miRNA-532的表达能够抑制心肌细胞凋亡、心肌缺血损伤和心肌梗死面积减少；通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，给予miRNA-532升高miRNA-532的表达能够诱导心肌细胞凋亡和心肌缺血损伤加重。

本发明与现有技术相比，其选用的原料科学合理，制备工艺简单，药物作用明显，使用范围广，使用安全可靠，应用环境友好。

附图说明：

图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中miRNA-532表达水平的变化图；

图2为抑制内源性的miRNA-532对心肌细胞凋亡的抵抗作用图；

图3为miRNA-532反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。

以下各实施例中涉及的材料、实验方法和操作工艺，包括原代心肌细胞培养，腺病毒的构建及感染心肌细胞的剂量，细胞转染，心脏缺血再灌手术步骤，Evans blue/TTC双染和TUNEL检测均参见以下文献：Wang JX,etal,miR-499 regulates mitochondrial  dynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1.2011 January 17:71-78；其中所用的试验动物为小鼠，其小鼠品种为C57/BL6，购自北京医科大学；所用的酶如限制性内切酶、扩增酶和逆转录酶等，均购自北京奥博生物有限公司；所用的试剂均为分析纯级试剂，且从正规渠道商购获得。

实施例1、

miRNA-532反义核苷酸过表达腺病毒载体及阴性对照腺病毒构建，本实施例采用人工合成miRNA-532反义核苷酸序列,亚克隆连入Ambion公司的pSi lencer Adeno 1.0-CMV系统，构建miRNA-532反义核苷酸过表达腺病毒。其miRNA-532反义核苷酸核苷酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’

按照公司说明书步骤，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(AdenovirTs LacZ Backbone)共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。

将上述所得的过表达miRNA-532反义核苷酸的重组体腺病毒磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度1x10¹⁶PFU/ml，按1ml量无菌分装到安瓿瓶内，即得。

实施例2、

心肌缺血及心肌细胞缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-532表达情况检测，本实施例对心肌细胞凋亡实验模型，采用常规的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，低氧培养箱(氧浓度低于1％)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-532的表达水平，图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中miRNA-532表达水平的变化图，其中图1A表明原代心肌细胞缺氧处理miRNA-532表达水平；图1B表明小鼠心肌缺血损伤miRNA-532表达水平；在低氧处理4h-8h内显著上调(图1A)；采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR技术检测miRNA-532的表达水平，结果显示缺血30min-120min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组的miRNA-532表达水平显著上升(图1B)，其中以假手术组(sham)作为对照组。

实施例3、

miRNA-532反义核苷酸抑制心肌细胞凋亡的实验，本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型，转染miRNA-532反义核苷酸(该序列由上海吉玛公司合成)(miRNA-532反义核苷酸序列是与miRNA-532序列完全反向互补的序列，5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’，与miRNA-532结合来抑制miRNA-532的表达)，转染实验方法参看上述文献，转染24小时后，在低氧培养箱中培养处理细胞3小时，诱导细胞凋亡，台盼兰染色方法检测心肌细胞 凋亡情况，结果见图2，其中图2A表示原代心肌细胞转染miRNA-532反义核苷酸(anta-532)抑制内源性的miRNA-532的表达；图2B表示对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响，转染NC作为阴性对照。图2显示，抑制内源性miRNA-532能够显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。

实施例4、

miRNA-532反义核苷酸抑制心肌缺血损伤及凋亡实验，本实施例以C57/BL6小鼠为实验对象，每组8只小鼠，将测得的结果用one-way ANOVO统计软件进行统计学分析，按照如下方法注射30mg/kg miRNA-532反义核苷酸(anta-532)和它的阴性对照(NC)(该miRNA是在2’端进行了甲氧修饰，即在核酸的2’端的羟基被甲氧基取代以增强核酸的稳定性。该修饰是由上海吉玛公司进行修饰的)(以购自上海吉玛公司的一段无关序列为阴性对照序列，其不抑制现有已知的任何基因的表达，其序列为：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)；小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏；稀释2×10¹¹pfu腺病毒于磷酸盐缓冲液(PBS)中，终体积为200μL，26号导管从心尖进入动脉根部，注射病毒时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒，监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔，等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中；心电图监测整个手术过程；注射病毒3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管；在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)；以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志，缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注，以ST段下降为标志；清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔；再灌注24小时用Evans blue/TTC双染测定心肌梗死面积；

miRNA-532反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用如图3所示；其中图3A为小鼠心肌注射miRNA-532反义核苷酸后实施心肌缺血再灌注手术的试验结果，ARR/LV表示危险区总面积/左心室面积，INF/AAR表示梗死区面积/危险区总面积，INF/LV表示梗死区面积/左心室面积，其中每组从左到右依次为没有加处理的对照组，经缺血再灌注的对照组(Con)，经缺血再灌注的阴性对照处理组(NC)和经缺血再灌注的miRNA-532反义核苷酸处理组(anta-532)；图3B为小鼠心肌注射miRNA-532反义核苷酸后心肌凋亡的结果。

结果显示：注射miRNA-532反义核苷酸的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p<0.01)，见图3A。

本实施例涉及的心梗面积按如下方法计算：左心室面积(left ventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk，AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积，危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％，心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％；同时又检测了注射miRNA-532反义核苷酸对I/R的凋亡的影响，用TUNEL检测(图3B)，结果显示miRNA-532反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡的发生，其中以假手术组作为对照组；以上的结果说明小鼠经冠状动脉注射miRNA-532反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。

序列表

 

SEQ ID NO:1

5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’

Claims (3)

1.一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物，其特征在于药物组合物包括miRNA-532反义核苷酸和药学上的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-532反义核苷酸的序列为5’-ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物，其特征在于所述的药物组合物中过表达miRNA-532反义核苷酸的腺病毒载体感染滴度为10¹⁶PFU。

3.一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物的用途，其特征在于用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的治疗和防治，以口服或注射方式给药。