CN102921021B - miRNA-361及其反义核苷酸的用途 - Google Patents
miRNA-361及其反义核苷酸的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102921021B CN102921021B CN201210487005.2A CN201210487005A CN102921021B CN 102921021 B CN102921021 B CN 102921021B CN 201210487005 A CN201210487005 A CN 201210487005A CN 102921021 B CN102921021 B CN 102921021B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- myocardial
- antisense nucleotide
- nucleotide
- heart disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 66
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 206010028594 Myocardial fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 16
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 10
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 6
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 29
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 abstract description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 12
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 5
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 4
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 4
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 3
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 3
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 206010018833 Haematocoele Diseases 0.000 description 2
- 208000005873 Hematocele Diseases 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 201000004920 hematocele of tunica vaginalis testis Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 210000001147 pulmonary artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 241000237970 Conus <genus> Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150075109 FIS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000013155 cardiography Methods 0.000 description 1
- 230000003130 cardiopathic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091068963 miR-361 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091080700 miR-484 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004332 phalangeal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种miRNA-361及其反义核苷酸的用途,具体为所述miRNA-361反义核苷酸序列在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途,所述miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。本发明人通过大量的实验证明miRNA-361反义核苷酸在心肌缺血损伤及心肌细胞凋亡中的变化及其心肌保护作用。本发明所述的miRNA-361反义核苷酸具有抑制心肌缺血损伤及抑制心肌细胞凋亡的功能。miRNA-361反义核苷酸可以作为一种新型的药物作用靶点,对于由心肌缺血引起的心肌纤维化、冠心病及心衰等心脏疾病的预防及治疗在临床上具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药用途,具体涉及一种miRNA-361及其反义核苷酸的用途,尤其涉及一种miRNA-361及其反义核苷酸在制备用于诊断、防治心脏疾病的药物中的用途,属于心脏疾病的诊断、预防和治疗领域。
背景技术
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁,是人类健康的头号杀手,全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病,其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国,随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变,心血管疾病死亡率呈明显上升趋势,已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明,我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%,估计全国患病人数1.6亿多,由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚,心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果,急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。
miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子,许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用,心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此,将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点,开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达,这样药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达,影响多个信号通路,从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同,因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
细胞凋亡(apoptosis),又称程序性细胞死亡,是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程,对正常胚胎发育,维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用,在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下,如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等,心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖,心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少,这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。
目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生,这些miRNA有促凋亡的,也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA,阐明其作用机理,对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞凋亡的心脏特异性性表达的miRNA,进一步确定其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用,将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。
除非特别指明,本文中的“miR-361”均指“miRNA-361”,其序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:
5‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’。
除非特别指明,本文中的“I/R”均指“心肌缺血/再灌注”。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一方面,本发明提供了一种单链非编码miRNA-361反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途,所述miRNA-361反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列:5’-GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’。
优选地,所述miRNA-361反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。
优选地,所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
还一方面,本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物,其中,所述药物组合物包含有效剂量的上述本发明所述的miRNA-361反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
优选地,所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
优选地,所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
另一方面,本发明还提供了一种单链非编码miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物组合物中的用途,其中,以所述miRNA-361核苷酸序列作为靶点或检测对象,所述miRNA-361核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:5‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’。优选地,所述的心脏疾病包括心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
本发明还提供了一种诊断或预后心脏疾病的药物组合物,其中,所述药物组合物包含有效剂量的本发明上述所述的miRNA-361核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
优选地,所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
本发明人通过实验发现miRNA-361在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-361表达显著上调。通过转染和注射miRNA-361反义核苷酸抑制miRNA-361的表达可以抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤,心肌梗死面积减少。
以上实验说明miRNA-361反义核苷酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用,miRNA-361反义核苷酸对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。而升高miRNA-361的表达则可以诱导心肌细胞凋亡,心肌缺血损伤会更加严重。
具体的,本发明人发现miRNA-361反义核苷酸(5’-GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’)通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。在心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程中,miRNA-361表达显著上调,miRNA-361的上调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。miRNA-361在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达上调;抑制小鼠的内源性的miRNA-361,可以抵抗心肌缺血再灌注损伤,使心肌梗死面积减少,心功能显著改善。将miRNA-361反义核苷酸与适当的载体结合形成药物,导入心脏或体内,对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。可以考虑将miRNA-361反义核苷酸与壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等组合形成药物分子,通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式,用于防治心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1示出了实施例1中心肌缺血损伤及低氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-361表达水平的变化,其中A示出了原代心肌细胞缺氧处理miRNA-361表达水平,其中,纵坐标表示以未处理的原代心肌细胞为基准,在缺血处理过程中原代心肌细胞中miRNA-361的表达水平;B示出了小鼠心肌缺血miRNA-361表达水平;
图2示出了实施例2中抑制内源性的miRNA-361对心肌细胞凋亡的抵抗作用,其中,A示出了原代心肌细胞转染miRNA-361反义核苷酸抑制内源性的miRNA-361的表达情况;B示出了miRNA-361反义核苷酸对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响;
图3示出了实施例3中miRNA-361反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用,其中,A和B分别示出了小鼠心肌注射miRNA-361反义核苷酸后实施心肌缺血再灌注手术,检测miRNA-361反义核苷酸对心肌梗死面积及心肌凋亡的影响;
图4示出了实施例4中小鼠静脉注射miRNA-361 antagomir抑制内源性miRNA-361后缺血再灌注后24小时与对照组相比的心功能状况,其中的A、B和C分别示出了对左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)和短轴截短率(FS)的指标检测情况;
在以上附图中,为简便起见,361反义核苷酸表示miRNA-361反义核苷酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。
除非特别指明,以下实施例中采用的小鼠和大鼠乳鼠购自北京医科大学,其中,小鼠品系为C57小鼠,大鼠品系为Wistar大鼠。
除非特别指明,以下实施例中所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法。
除非特别指明,以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂,且可从正规渠道商购获得。
实施例1心肌细胞缺氧及心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-361表达情况检测
在该实施例中,采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞,用以进行心肌细胞凋亡实验模型的构建,制备大鼠乳鼠原代心肌细胞的具体步骤参见文献:W.-Q.Tan,Kun Wang,et al.,Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase.J Biol Chem.2008 October 31;283(44):29730-29739。
利用大鼠乳鼠原代心肌细胞建立心肌缺氧模型,具体为,在低氧培养箱中(氧浓度低于1%)对大鼠乳鼠原代心肌细胞进行培养,培养规模为10cm培养皿,每个培养皿的细胞量约为1×106个,培养时间持续0、1、2、3、4小时。随培养时间的不同来提取RNA,并利用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-361的表达水平,其具体操作参见文献:W.-Q.Tan,KunWang,et al.,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase.J Biol Chem.2008 October 31;283(44):29730-29739。
具体为,PCR 扩增miRNA-361编码序列(GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACTTATTATTTGAAAAGTCCCCCAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC,SEQ ID NO:3)及其上下游两端各将近200个bp的序列,扩增片段约562bp,具体为: TTAGGCCTATTGCCTCAGTACTTCAGGGCAAGAATGAGGCTAACAGGTGAGTCATGTTACCATCTACCAGACTGCCAGAACTGGGCCTAAATAATAGTCACCTCCCTGTGTTCAGATGTGCGTCATTTCTCTCAGTCTGGAGCCCTTTACTTTTCTCACACAACATAGAGATGCAGCAGTAGCAGAGGCTTCACTATGATTCTTTCTTGGGACTCG CCTCTCCTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTTGGAAATCAGTTTCATCTGAAGCTTCTGCATAAACAGGCACATTCATTAGCATCTTATCCTGCATAGTTGAGCTTGCATTATTTACTCTCTGCGTTATCTTCATTAATTCTTTCTAATGCTGAAACACCTGAAATCAGTGTCTGCCGGTCACCAAAGGATCTCTATTAGACTTTGGAAGCAAACAAAGCAGCAAAGACTTCATA(SEQ IDNO:4,其中加黑并带下划线标记为miRNA-361的编码序列;其余的为它的上下游序列,斜体带下划线标记的为上下游引物序列,
PCR体系50ul,PCR条件如下:95°C 3min一个循环;95°C 30sec,56°C30sec,72°C 1min共28个循环;最后72°C延伸5min,PCR引物设计如下:
上游引物:5'-CCTTGGTTTACAGAGCTTTGC-3'(SEQ ID NO:5);
下游引物:5'-ACCTAGCCTTCAAGTCAAGTT-3'(SEQ ID NO:6)。
检测到的miRNA-361表达水平如图1A所示,在低氧处理4h-8h的区间内,miRNA-361的表达显著上调。
本实施例采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型结扎大鼠冠状动脉的操作步骤参见文献:Kun Wang,Bo Long,et al.,miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fis1.Nature Communications.2012April 17;781(3):256-265。在0-120分钟的区间内分别自心脏缺血区(危险区)组织及非缺血区心肌(远端区)组织提取总RNA,并利用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-361的表达水平(检测方法及条件同上),其中,以自非缺血区心肌(远端区)组织提取的RNA为对照组。结果如图1B所示,表明缺血30min-120min的心肌缺血组织中的miRNA-361表达水平较之非缺血组织及非缺血模型组表现出显著的上升。
实施例2miRNA-361反义核苷酸抑制心肌细胞凋亡的实验
本实验中使用实施例1中原代培养的心肌细胞为模型。对心肌细胞(细胞量约为1×106)进行miRNA-361反义核苷酸转染处理(通过脂质体lipfectin2000按照试剂盒操作说明书进行转染,购自Invitrogen公司),转染24小时后,在低氧培养箱(氧浓度低于1%)中对该细胞培养处理3小时,以诱导细胞凋亡。同时,以未经miRNA-361反义核苷酸转染的原代心肌细胞为阴性对照,利用台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况。
实验结果如图2所示,表明抑制内源性miRNA-361可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
实施例3miRNA-361反义核苷酸抑制心肌缺血损伤实验
小鼠经冠状动脉注射miRNA-361反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。以C57小鼠为实验对象,按照如下方法注射miRNA-361反义核苷酸和它的阴性对照(5‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ IDNO:7),并且每一个碱基均进行了2’-甲氧基修饰,由上海吉马公司合成,)(NC):小鼠称重并麻醉,仰卧位固定,剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管,连动物呼吸机进行正压通气,在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm,逐层钝性分离皮下组织、肌肉,开胸,小心提起心包并剪开,充分暴露心脏。稀释miRNA-361反义核苷酸于PBS中,终体积为200μl,终浓度为30mg。利用26号导管从心尖进入动脉根部,注射miRNA-361反义核苷酸时同时夹闭主动脉及肺动脉,持续夹闭20秒(每只小鼠注射量为30mg/kg/天)。监测5min,待心脏恢复窦律后,清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。等小鼠清醒后,脱离呼吸机,放回笼中。心电图监测整个手术过程。
注射miRNA-361反义核苷酸3天后进行心脏缺血再灌注手术,具体操作如下:小鼠麻醉后,背位固定于实验用木板上,并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管,连动物人工呼吸机,于第四肋间开胸,小心提起心包并剪开,充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间,以左冠状静脉主干为标志,于左心耳根部下方2mm处进针,进针深度0.5mm;以6/0带针缝合线穿过心肌表层,在肺动脉圆椎旁出针;待心电图恢复稳定10min后,予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5hr以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后,松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注24小时后用Evansblue/TTC双染测定心肌梗死面积。同时,以每只小鼠的注射量为30mg/kg/天的miRNA-361反义核苷酸阴性对照(5‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO:7),并且每一个碱基均进行了2’-甲氧基修饰,由上海吉马公司合成)的I/R组作为阴性对照组(NC)。
结果如图3A所示,注射miRNA-361反义核苷酸的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低,有统计学差异(p<0.01)。
心梗面积按如下方法计算:左心室面积(left ventricle,LV)、危险区总面积(area at risk,AAR)和梗死区面积(infarct area,INF)之间的关系为(请发明人改变描述方式,避免使用颜色作表述):危险区面积(AAR/LV,%)=(危险区总面积/左心室面积)×100%,心梗面积(INF/AAR,%)=(梗死区面积/危险区总面积)×100%。同时又检测了注射miRNA-361反义核苷酸对I/R所诱导的凋亡的影响,用TUNEL试剂盒(购自Sigma公司),按照试剂盒操作说明书进行检测,结果如图3B所示,miRNA-361反义核苷酸能减小I/R所诱导的凋亡。
实验例4抑制内源性的miRNA-361能降低缺血再灌注所致心功能失调。
此实验所用的miRNA-361的抑制剂均为经过修饰的miRNA-361反义核苷酸,修饰方式为对miRNA-361反义核苷酸的每个碱基都进行了2’-甲氧基修饰用以增加miRNA-361反义核苷酸在体内的稳定性。反义核苷酸的修饰及合成都是由上海吉玛公司完成的。
将实验小鼠分成4组,每组6只小鼠。向各组别小鼠注射miRNA-361的抑制剂(注射量为30mg/kg/天),用以抑制内源性的miRNA-361,3天后进行心脏缺血再灌注手术,以每只小鼠的注射量为30mg/kg/天的miRNA-361反义核苷酸阴性对照(的I/R组作为阴性对照组(NC)(5‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO:7),并且每一个碱基均进行了2’-甲氧基修饰,由上海吉马公司合成),再灌注一周后进行超声心动的功能检测,检测指标包括左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)、和短轴截短率(FS),结果如图4所示,miRNA-361的抑制剂能够减小缺血再灌注引起的心脏功能的损伤。
Claims (10)
1.一种单链非编码miRNA-361反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途,所述miRNA-361反义核苷酸的序列为下述SEQID NO:2所示的核苷酸序列:
5’-GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’;
其中,所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述miRNA-361反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。
3.一种药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途,所述药物组合物包含有效剂量的miRNA-361反义核苷酸和药学上可接受的载体或辅料,所述miRNA-361反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列:
5’-GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’;
其中,所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的用途,其中,所述载体为病毒。
5.根据权利要求3所述的用途,其中,所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的用途,其中所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
7.一种单链非编码miRNA-361核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途,所述miRNA-361核苷酸的序列为下述SEQID NO:1所示的核苷酸序列:
5’-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’;
其中,所述的心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
8.一种药物组合物在用于制备诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途,所述药物组合物包含有效剂量的miRNA-361核苷酸和药学上可接受的载体或辅料,所述miRNA-361核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:
5’-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’;
其中,所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚和心肌纤维化中的中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的用途,其中,所述载体为病毒。
10.根据权利要求8所述的用途,其中,所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210487005.2A CN102921021B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | miRNA-361及其反义核苷酸的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210487005.2A CN102921021B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | miRNA-361及其反义核苷酸的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102921021A CN102921021A (zh) | 2013-02-13 |
CN102921021B true CN102921021B (zh) | 2014-05-21 |
Family
ID=47636041
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210487005.2A Active CN102921021B (zh) | 2012-11-26 | 2012-11-26 | miRNA-361及其反义核苷酸的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102921021B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104436217A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-03-25 | 首都医科大学 | 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用 |
CN108295249A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-07-20 | 南方医科大学南方医院 | Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用 |
CN110042127A (zh) * | 2019-04-23 | 2019-07-23 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 向心肌细胞递送目标核酸分子的制剂、其制备方法及应用 |
CN115137740B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-12-12 | 广州大学 | miRNA-497b或miRNA-5106在制备治疗缺血心肌的药物中的应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101386848A (zh) * | 2008-08-12 | 2009-03-18 | 南京大学 | 细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用 |
CN102218144B (zh) * | 2010-04-13 | 2016-03-02 | 江苏命码生物科技有限公司 | 一种调节生物体内微小核糖核酸含量的方法及其用途 |
CN102453757B (zh) * | 2010-10-22 | 2014-02-12 | 中国科学院动物研究所 | 一种微小rna及其反义核酸在诊断、预防、治疗和/或预后评估心肌缺血性损伤中的用途 |
-
2012
- 2012-11-26 CN CN201210487005.2A patent/CN102921021B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102921021A (zh) | 2013-02-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104548137B (zh) | 一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途 | |
CN104645352B (zh) | 一种piRNA反义核苷酸药物组合物及其用途 | |
CN102921021B (zh) | miRNA-361及其反义核苷酸的用途 | |
CN110494154A (zh) | 心肌病、陈旧性心肌梗塞及慢性心力衰竭的治疗剂 | |
CN106729757A (zh) | miR‑378抑制心肌肥厚和心肌纤维化并诊断心力衰竭的用途 | |
CN102886050A (zh) | miRNA-489的用途及药物组合物 | |
CN106138081B (zh) | 一种靶向circRNA的药物组合物及其用途 | |
CN110724203A (zh) | 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用 | |
CN106222173B (zh) | circRNA MNCR在调节心肌细胞坏死和心肌缺血损伤中的作用 | |
CN102266570A (zh) | miRNA-484的新用途及含有miRNA-484的药物组合物及其用途 | |
CN113234811A (zh) | CircRNA000338的应用及其药物 | |
CN104524599A (zh) | 一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物及其用途 | |
CN110734972B (zh) | miR-181c-3p作为肾纤维化标志物的应用 | |
CN107385033B (zh) | piRNA-5938及其反义核酸在诊断、治疗缺血性心脏疾病中的应用 | |
CN102895671B (zh) | 一种微小rna在预防和/或治疗心脏疾病中的用途 | |
CN106222174A (zh) | circRNA CHIF核苷酸,含有该核苷酸的药物组合物及其用途 | |
CN102888403A (zh) | miRNA-539及其反义核苷酸的用途和其药物组合物 | |
CN103243091B (zh) | miRNA-140抑制剂及其用途 | |
CN104491878A (zh) | 一种含有miRNA-324的药物组合物及其用途 | |
CN109234381A (zh) | miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用 | |
CN114432332A (zh) | circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物 | |
CN111705061B (zh) | 和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物 | |
CN112294835B (zh) | LncRNA-266在制备诱导棕色脂肪细胞分化药物中的应用 | |
CN102973953B (zh) | miRNA-874及其反义核苷酸的用途 | |
CN107296806A (zh) | 丹酚酸a作为脂蛋白相关磷脂酶a2抑制剂的新用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |