CN104436217A - 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用 - Google Patents

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许焕丽
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Abstract

本发明涉及一种微小RNA纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用，该纳米微球包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。本发明将miR-125-AS制备为纳米微球，其稳定性显著增强，在25℃条件下保存一周而不降解，经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迁移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、Western-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。

Description

一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，特别是涉及一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
非编码小RNA（microRNA，miRNA）通过调控癌基因或抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管生成、蛋白裂解等生物程序的调控。除了调控基因表达外，miRNA 本身也可以作为癌基因或抑癌基因而成为肿瘤治疗的靶标。通过导入抑癌miRNAs可控制肿瘤或诱导其向正常方向发展，甚至逆转至正常；同时，引入与具有癌基因特性的miRNA 互补的miRNA反义寡核苷酸，降低肿瘤中miRNA的表达，可以抑制致癌miRNA的表达，抑制癌细胞生长，从而达到控制肿瘤生长的目的。阐明内源性miRNA作用原理，对于疾病的基因诊断和治疗具有重要意义。miR-125b属于癌基因，在多种肿瘤组织中表达量显著升高，其反义寡核苷酸（miR-125b-AS）可以抑制miR-125b的抑制肿瘤生长的作用，具有成为抗癌药物的可能性。
目前对于miRNA的研究一般采用过表达或缺失表达技术研究miRNA的体内功能，通常将miRNA的模拟物（即合成双链的miRNA）借助转染试剂转染细胞，实现细胞内miRNA的瞬时转染、短暂的过表达，或以miRNA为靶点设计小分子物质拮抗miRNA的作用，如，miRNA反义寡聚(脱氧)核苷酸(anti—miRNA oligonucleotides，AMOs) 、核酸修饰的寡核苷酸[1ocked nucleic acid(LNA)一modified oligonucleotides]以及miRNA拮抗分子(antagomirs) 等。但miRNA模拟物和AMOs的应用都存在一些问题，包括1）稳定性差，miRNA模拟物或miRNA-AMOs不能长期保存，且外源的小分子RNA 在血清中很快被降解，经化学修饰后虽然稳定性可增加，但在机体中也很快被清除。2）不能直接进入细胞发挥生物学功能。小分子RNA属于极性大分子，需要借助转染试剂才能进入细胞发挥作用，上述问题极大地限制了小分子RNA的应用。
纳米颗粒作为基因治疗的载体具有一些显著地优点，例如能够保护核酸不被核酸酶降解、具有生物亲和性等，尤其适用于基因的体内转染。因此，纳米技术与miRNA结合将为miRNA的研究提供更好的技术平台。发展具有更长体内半衰期且生物安全性好的改良miRNA分子和miRNA反义分子，是目前研究miRNA的体内功能迫切需要解决的问题，也是将基础研究进展转化为临床的技术保障。miR-125b是具有致癌作用的微小RNA，前期研究证实miR-125b反义分子（miR-125b antisense）具有良好的抑制肿瘤生长的作用，但miRNA目前研究尚存在转染困难、稳定性差、在生物体内的作用难以证实等问题，难以在肿瘤病人中应用等难题。本发明将其制备为纳米微球，可以直接在生物体内发挥抗肿瘤作用。
发明内容
本发明提供了一种稳定性好，直接进入细胞发挥功能的微小RNA纳米微球，并提供了该纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种微小RNA纳米微球，其特征在于：包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。
优选的，所述miR-125b的寡核苷酸序列为：
5’UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA3’；
所述miR-125b反义链，即miR-125b-AS的核酸序列为：
5’UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA 3’。
优选的，所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
更进一步的，所述的微小RNA纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将miR-125b-AS溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20℃，超声强度为150 W/cm2，超声时间为3 Min，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
本发明还提供了上述的微小RNA纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1）微小RNA miR-125b具有显著的致癌作用，其反义链miR-125-AS具有良好的抗癌作用，但其稳定性差，同时不能直接进入细胞发挥抗肿瘤作用；本发明将微小RNA miR-125b的反义链（miR-125b-AS）分子制备成稳定的纳米微球 (miR-125b-AS-RNs)，其稳定性显著增强，在室温（25℃）条件下保存一周而不降解，这种颗粒可以不借助任何转染试剂进入到细胞内发挥生物学功能。不但解决了RNA的保存问题，并且为微小RNA的应用开辟了新的途径。
2）本发明将具有显著的抑癌作用的miRNA-125b的反义链miR-125b-AS制备为miRNA纳米颗粒（miR-25-AS-RNs），经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迁移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、Western-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
附图1为本发明的miR-125b-AS纳米微球用戊二醛固定后的电镜扫描图。
附图2为本发明的miR-125b-AS纳米微球的甲醛变性PAGE凝胶电泳图。
附图3为本发明的miR-125b-AS纳米微球对神经胶质瘤细胞U87增殖和凋亡作用图；图中，A：TUNEL分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡的影响；B：Annexin V-FITC 和Propidium Iodide 双染，然后在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况；C：Western-blot分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡相关基因PARP、Caspase-3、Caspase-9表达的影响。
附图4为本发明的miR-125b-AS纳米微球（125b-AS-RNs）对靶基因表达的Western-blot检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1. 微小纳米微球制备方案
将miR-125b-AS（为购买的上海吉玛医药生物公司的合成miR-125b-AS样品）溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入保护油层（大豆油），将超声探头置于水油液面分界处（≈150 W/cm2），反应温度设定为20℃，超声时间为3 Min。采用20kDa的超滤膜分离纳米微球，纳米微球分离出来后经DLS和SME方法分析其大小及粒径分布。125b-AS-RNs 纳米颗粒用戊二醛固定后用扫描电镜分析，实施结果见附图1所示，标尺：500nm。结果表明应用此方法可制备为500纳米直径大小的纳米RNA微球，且成均质分布在溶液中。
实施例2. 微小RNA纳米微球体外稳定性检测
为检测微小RNA纳米微球的体外稳定性，将购买的上海吉玛医药生物公司合成的miR-125b-AS样品和采用本发明制备的纳米微球mi125b-AS-RNs样品，分别在25℃条件下放置0-7天，期间用紫外分光广度计在260纳米处监测RNA的紫外吸收值变化，结果表明，miR-125b-AS放置7天后，吸收度显著降低，但其纳米微球，吸收度没有变化，说明微小RNA制备为纳米微球后稳定性显著升高。
进一步我们采用甲醛变性PAGE凝胶电泳检测RNA的完整性，以评价微小RNA纳米微球在室温条件下的保存时间。实施结果见附图2，结果表明：微小RNA应用实施例1的方法制备为微小RNA纳米颗粒后可以在室温25℃条件下存放7天而保持RNA的完整性，但未经处理的微小RNA在室温条件下存放7天完全降解。
实施例3.  miR-125b反义核苷酸纳米颗粒对恶性胶质瘤细胞生长和凋亡的影响
将细胞以103/个每孔接种于96孔板，培养24小时，将87细胞分别转染阴性对照miRNA (NC-AS)、miR-125b反义链 （miR-125b-AS、图中标记为125b-AS)，采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000；采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000；miR-125b-AS的纳米微球（125b-AS-RNs）采用直接转染，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/L。培养72h后收集细胞转染后24小时，收集细胞应用TUNEL实验及流式细胞术AV/FITC双染检测细胞凋亡情况，结果表明，miR-125b-AS和其纳米微球均可以诱导胶质瘤细胞凋亡，说明纳米微球不需要借助于转染试剂即可以进入细胞发挥功能。用Western-blot法检测凋亡相关蛋白PARP，Caspase9及Caspase3的表达情况，结果证明miR-125b-AS纳米颗粒125b-AS-RNs不需要转染试剂，即能够成功转染神经胶质瘤U87细胞，并能够有效促进U87细胞凋亡的发生，激活凋亡相关蛋白的表达。
实施例4. miR-125b-AS纳米颗粒对 miR-125b靶基因表达的影响
将细胞以103/个每孔接种于96孔板，培养24小时，以miRNA-125b-AS (图中标记为125b-AS)为阳性对照，miRNA 2’-修饰的反义核苷酸 (图中标记为NC-AS)为阴性对照，采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000转染U87细胞；miR-125b-AS的纳米微球（125b-AS-RNs）采用直接转染U87细胞，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/L。转染后24小时后，收集细胞提取细胞总蛋白，采用Western blot测定miR-125b靶基因p53、Bcl-2与E2F2的表达，图中β-actin作为上样量一致情况的对照。实施结果见附图4，结果表明，125b-AS-RNs不需要借助于转染试剂，即能够进人神经胶质瘤U87细胞，并能够发挥对靶基因的调节作用，与对照125b-AS并无显著差别，表明微小RNA纳米颗粒可以在细胞中发挥功能。

Claims (5)

1.一种微小RNA纳米微球，其特征在于：包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。
2.根据权利要求1所述的微小RNA纳米微球，其特征在于：所述miR-125b的寡核苷酸序列为：5’UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA3’；所述miR-125b反义链，即miR-125b-AS的核酸序列为：5’UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA 3’。
3.根据权利要求1所述的微小RNA纳米微球，其特征在于：所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
4.如权利要求3所述的微小RNA纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将miR-125b-AS溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20℃，超声强度为150 W/cm2，超声时间为3 Min，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
5.如权利要求1-4任一所述的微小RNA纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
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