CN104436217A - 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用 - Google Patents

一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104436217A
CN104436217A CN201410815926.6A CN201410815926A CN104436217A CN 104436217 A CN104436217 A CN 104436217A CN 201410815926 A CN201410815926 A CN 201410815926A CN 104436217 A CN104436217 A CN 104436217A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano microsphere
mir
nano
microrna
micro rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410815926.6A
Other languages
English (en)
Inventor
林秀坤
吴宁
许焕丽
刘晓卉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Capital Medical University
Original Assignee
Capital Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Capital Medical University filed Critical Capital Medical University
Priority to CN201410815926.6A priority Critical patent/CN104436217A/zh
Publication of CN104436217A publication Critical patent/CN104436217A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种微小RNA纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用，该纳米微球包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。本发明将miR-125-AS制备为纳米微球，其稳定性显著增强，在25℃条件下保存一周而不降解，经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迁移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、Western-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。

Description

一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，特别是涉及一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
非编码小RNA（microRNA，miRNA）通过调控癌基因或抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管生成、蛋白裂解等生物程序的调控。除了调控基因表达外，miRNA 本身也可以作为癌基因或抑癌基因而成为肿瘤治疗的靶标。通过导入抑癌miRNAs可控制肿瘤或诱导其向正常方向发展，甚至逆转至正常；同时，引入与具有癌基因特性的miRNA 互补的miRNA反义寡核苷酸，降低肿瘤中miRNA的表达，可以抑制致癌miRNA的表达，抑制癌细胞生长，从而达到控制肿瘤生长的目的。阐明内源性miRNA作用原理，对于疾病的基因诊断和治疗具有重要意义。miR-125b属于癌基因，在多种肿瘤组织中表达量显著升高，其反义寡核苷酸（miR-125b-AS）可以抑制miR-125b的抑制肿瘤生长的作用，具有成为抗癌药物的可能性。
目前对于miRNA的研究一般采用过表达或缺失表达技术研究miRNA的体内功能，通常将miRNA的模拟物（即合成双链的miRNA）借助转染试剂转染细胞，实现细胞内miRNA的瞬时转染、短暂的过表达，或以miRNA为靶点设计小分子物质拮抗miRNA的作用，如，miRNA反义寡聚(脱氧)核苷酸(anti—miRNA oligonucleotides，AMOs) 、核酸修饰的寡核苷酸[1ocked nucleic acid(LNA)一modified oligonucleotides]以及miRNA拮抗分子(antagomirs) 等。但miRNA模拟物和AMOs的应用都存在一些问题，包括1）稳定性差，miRNA模拟物或miRNA-AMOs不能长期保存，且外源的小分子RNA 在血清中很快被降解，经化学修饰后虽然稳定性可增加，但在机体中也很快被清除。2）不能直接进入细胞发挥生物学功能。小分子RNA属于极性大分子，需要借助转染试剂才能进入细胞发挥作用，上述问题极大地限制了小分子RNA的应用。
纳米颗粒作为基因治疗的载体具有一些显著地优点，例如能够保护核酸不被核酸酶降解、具有生物亲和性等，尤其适用于基因的体内转染。因此，纳米技术与miRNA结合将为miRNA的研究提供更好的技术平台。发展具有更长体内半衰期且生物安全性好的改良miRNA分子和miRNA反义分子，是目前研究miRNA的体内功能迫切需要解决的问题，也是将基础研究进展转化为临床的技术保障。miR-125b是具有致癌作用的微小RNA，前期研究证实miR-125b反义分子（miR-125b antisense）具有良好的抑制肿瘤生长的作用，但miRNA目前研究尚存在转染困难、稳定性差、在生物体内的作用难以证实等问题，难以在肿瘤病人中应用等难题。本发明将其制备为纳米微球，可以直接在生物体内发挥抗肿瘤作用。
发明内容
本发明提供了一种稳定性好，直接进入细胞发挥功能的微小RNA纳米微球，并提供了该纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种微小RNA纳米微球，其特征在于：包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。
优选的，所述miR-125b的寡核苷酸序列为：
5’UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA3’；
所述miR-125b反义链，即miR-125b-AS的核酸序列为：
5’UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA 3’。
优选的，所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
更进一步的，所述的微小RNA纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将miR-125b-AS溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20℃，超声强度为150 W/cm2，超声时间为3 Min，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
本发明还提供了上述的微小RNA纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1）微小RNA miR-125b具有显著的致癌作用，其反义链miR-125-AS具有良好的抗癌作用，但其稳定性差，同时不能直接进入细胞发挥抗肿瘤作用；本发明将微小RNA miR-125b的反义链（miR-125b-AS）分子制备成稳定的纳米微球 (miR-125b-AS-RNs)，其稳定性显著增强，在室温（25℃）条件下保存一周而不降解，这种颗粒可以不借助任何转染试剂进入到细胞内发挥生物学功能。不但解决了RNA的保存问题，并且为微小RNA的应用开辟了新的途径。
2）本发明将具有显著的抑癌作用的miRNA-125b的反义链miR-125b-AS制备为miRNA纳米颗粒（miR-25-AS-RNs），经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迁移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、Western-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
附图1为本发明的miR-125b-AS纳米微球用戊二醛固定后的电镜扫描图。
附图2为本发明的miR-125b-AS纳米微球的甲醛变性PAGE凝胶电泳图。
附图3为本发明的miR-125b-AS纳米微球对神经胶质瘤细胞U87增殖和凋亡作用图；图中，A：TUNEL分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡的影响；B：Annexin V-FITC 和Propidium Iodide 双染，然后在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况；C：Western-blot分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡相关基因PARP、Caspase-3、Caspase-9表达的影响。
附图4为本发明的miR-125b-AS纳米微球（125b-AS-RNs）对靶基因表达的Western-blot检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1. 微小纳米微球制备方案
将miR-125b-AS（为购买的上海吉玛医药生物公司的合成miR-125b-AS样品）溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入保护油层（大豆油），将超声探头置于水油液面分界处（≈150 W/cm2），反应温度设定为20℃，超声时间为3 Min。采用20kDa的超滤膜分离纳米微球，纳米微球分离出来后经DLS和SME方法分析其大小及粒径分布。125b-AS-RNs 纳米颗粒用戊二醛固定后用扫描电镜分析，实施结果见附图1所示，标尺：500nm。结果表明应用此方法可制备为500纳米直径大小的纳米RNA微球，且成均质分布在溶液中。
实施例2. 微小RNA纳米微球体外稳定性检测
为检测微小RNA纳米微球的体外稳定性，将购买的上海吉玛医药生物公司合成的miR-125b-AS样品和采用本发明制备的纳米微球mi125b-AS-RNs样品，分别在25℃条件下放置0-7天，期间用紫外分光广度计在260纳米处监测RNA的紫外吸收值变化，结果表明，miR-125b-AS放置7天后，吸收度显著降低，但其纳米微球，吸收度没有变化，说明微小RNA制备为纳米微球后稳定性显著升高。
进一步我们采用甲醛变性PAGE凝胶电泳检测RNA的完整性，以评价微小RNA纳米微球在室温条件下的保存时间。实施结果见附图2，结果表明：微小RNA应用实施例1的方法制备为微小RNA纳米颗粒后可以在室温25℃条件下存放7天而保持RNA的完整性，但未经处理的微小RNA在室温条件下存放7天完全降解。
实施例3.  miR-125b反义核苷酸纳米颗粒对恶性胶质瘤细胞生长和凋亡的影响
将细胞以103/个每孔接种于96孔板，培养24小时，将87细胞分别转染阴性对照miRNA (NC-AS)、miR-125b反义链 （miR-125b-AS、图中标记为125b-AS)，采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000；采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000；miR-125b-AS的纳米微球（125b-AS-RNs）采用直接转染，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/L。培养72h后收集细胞转染后24小时，收集细胞应用TUNEL实验及流式细胞术AV/FITC双染检测细胞凋亡情况，结果表明，miR-125b-AS和其纳米微球均可以诱导胶质瘤细胞凋亡，说明纳米微球不需要借助于转染试剂即可以进入细胞发挥功能。用Western-blot法检测凋亡相关蛋白PARP，Caspase9及Caspase3的表达情况，结果证明miR-125b-AS纳米颗粒125b-AS-RNs不需要转染试剂，即能够成功转染神经胶质瘤U87细胞，并能够有效促进U87细胞凋亡的发生，激活凋亡相关蛋白的表达。
实施例4. miR-125b-AS纳米颗粒对 miR-125b靶基因表达的影响
将细胞以103/个每孔接种于96孔板，培养24小时，以miRNA-125b-AS (图中标记为125b-AS)为阳性对照，miRNA 2’-修饰的反义核苷酸 (图中标记为NC-AS)为阴性对照，采用Invitrogen公司的转染试剂lipofectamine 2000转染U87细胞；miR-125b-AS的纳米微球（125b-AS-RNs）采用直接转染U87细胞，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/L。转染后24小时后，收集细胞提取细胞总蛋白，采用Western blot测定miR-125b靶基因p53、Bcl-2与E2F2的表达，图中β-actin作为上样量一致情况的对照。实施结果见附图4，结果表明，125b-AS-RNs不需要借助于转染试剂，即能够进人神经胶质瘤U87细胞，并能够发挥对靶基因的调节作用，与对照125b-AS并无显著差别，表明微小RNA纳米颗粒可以在细胞中发挥功能。

Claims (5)

1.一种微小RNA纳米微球，其特征在于：包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。
2.根据权利要求1所述的微小RNA纳米微球，其特征在于：所述miR-125b的寡核苷酸序列为：5’UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA3’；所述miR-125b反义链，即miR-125b-AS的核酸序列为：5’UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA 3’。
3.根据权利要求1所述的微小RNA纳米微球，其特征在于：所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
4.如权利要求3所述的微小RNA纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将miR-125b-AS溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20℃，超声强度为150 W/cm2，超声时间为3 Min，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
5.如权利要求1-4任一所述的微小RNA纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
CN201410815926.6A 2014-12-25 2014-12-25 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用 Pending CN104436217A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410815926.6A CN104436217A (zh) 2014-12-25 2014-12-25 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410815926.6A CN104436217A (zh) 2014-12-25 2014-12-25 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104436217A true CN104436217A (zh) 2015-03-25

Family

ID=52883469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410815926.6A Pending CN104436217A (zh) 2014-12-25 2014-12-25 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104436217A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106729621A (zh) * 2016-12-15 2017-05-31 首都医科大学 一种多肽纳米微球、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用
CN110448567A (zh) * 2019-08-26 2019-11-15 佳木斯大学 miRNA125b纳米粒子的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102772806A (zh) * 2012-07-11 2012-11-14 中国科学技术大学 小分子核酸miR-302用于治疗或预防睾丸癌的用途
CN102886050A (zh) * 2012-07-16 2013-01-23 中国科学院动物研究所 miRNA-489的用途及药物组合物
CN102921021A (zh) * 2012-11-26 2013-02-13 中国科学院动物研究所 miRNA-361及其反义核苷酸的用途
CN103074354A (zh) * 2012-11-22 2013-05-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 miR-125b在红细胞成熟化中的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102772806A (zh) * 2012-07-11 2012-11-14 中国科学技术大学 小分子核酸miR-302用于治疗或预防睾丸癌的用途
CN102886050A (zh) * 2012-07-16 2013-01-23 中国科学院动物研究所 miRNA-489的用途及药物组合物
CN103074354A (zh) * 2012-11-22 2013-05-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 miR-125b在红细胞成熟化中的用途
CN102921021A (zh) * 2012-11-26 2013-02-13 中国科学院动物研究所 miRNA-361及其反义核苷酸的用途

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IRENA RYTBLAT 等: "In vitro studies of polyethyleneimine coated miRNA microspheres as anticancer agents", 《NANO RESEARCH》 *
刘捷: "以脂质体纳米颗粒为载体的miR--100及miR--145在4T1细胞中表达的研究", 《WWW.DOC88.COM》 *
吴宁: "miR-26b和miR-125b调控神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的分子机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
姚燕丹 等: "RNA干扰体内导入技术研究进展", 《生命科学》 *
张振宇 等: "纳米载体系统治疗恶性胶质瘤研究进展", 《国际神经病学神经外科学杂志》 *
梅建国 等: "纳米微球在生物医药领域的应用", 《材料导报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106729621A (zh) * 2016-12-15 2017-05-31 首都医科大学 一种多肽纳米微球、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用
CN110448567A (zh) * 2019-08-26 2019-11-15 佳木斯大学 miRNA125b纳米粒子的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. Effects of tetrahedral DNA nanostructures on autophagy in chondrocytes
Chen et al. Doxorubicin-conjugated pH-responsive gold nanorods for combined photothermal therapy and chemotherapy of cancer
McEwan et al. Combined sonodynamic and antimetabolite therapy for the improved treatment of pancreatic cancer using oxygen loaded microbubbles as a delivery vehicle
Roy et al. Green synthesis of silver nanoparticles: an approach to overcome toxicity
Jin et al. Biodegradable, multifunctional DNAzyme nanoflowers for enhanced cancer therapy
Xu et al. Gelatin–mesoporous silica nanoparticles as matrix metalloproteinases-degradable drug delivery systems in vivo
Chen et al. “Sense-and-treat” DNA nanodevice for synergetic destruction of circulating tumor cells
CN107980004A (zh) 用于医治疾病的外泌体的用途
Ghaemi et al. CRISPR-cas9 genome editing delivery systems for targeted cancer therapy
Wu et al. Light-responsive charge-reversal nanovector for high-efficiency in vivo CRISPR/Cas9 gene editing with controllable location and time
Xu et al. DNA Origami Frameworks Enabled Self‐Protective siRNA Delivery for Dual Enhancement of Chemo‐Photothermal Combination Therapy
Shen et al. Polyphosphoester-based cationic nanoparticles serendipitously release integral biologically-active components to serve as novel degradable inducible nitric oxide synthase inhibitors
Lellouche et al. MagRET nanoparticles: an iron oxide nanocomposite platform for gene silencing from microRNAs to long noncoding RNAs
CN104288784A (zh) 纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用
Liu et al. A One–Two–Three Multifunctional System for Enhanced Imaging and Detection of Intracellular MicroRNA and Chemogene Therapy
Yan et al. An autocatalytic multicomponent DNAzyme nanomachine for tumor-specific photothermal therapy sensitization in pancreatic cancer
Chen et al. Polyvalent spherical aptamer engineered macrophages: X-ray-actuated phenotypic transformation for tumor immunotherapy
Wang et al. Preparation optimization of bovine serum albumin nanoparticles and its application for siRNA delivery
Yan et al. Gene therapy and photothermal therapy of layer-by-layer assembled AuNCs/PEI/miRNA/HA nanocomplexes
Wang et al. MiRNA delivery system based on stimuli-responsive gold nanoparticle aggregates for multimodal tumor therapy
Wang et al. Biomineralization of DNA nanoframeworks for intracellular delivery, on-demand diagnosis, and synergistic cancer treatments
Zhang et al. Engineered cancer-derived small extracellular vesicle-liposome hybrid delivery system for targeted treatment of breast cancer
CN104436217A (zh) 一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用
Yu et al. Glutathione-sensitive nanoglue platform with effective nucleic acids gluing onto liposomes for photo-gene therapy
Lin et al. Bioorthogonal chemistry based on-demand drug delivery system in cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150325

RJ01 Rejection of invention patent application after publication