CN102772806A

CN102772806A - 小分子核酸miR-302用于治疗或预防睾丸癌的用途

Info

Publication number: CN102772806A
Application number: CN2012102395711A
Authority: CN
Inventors: 孙斐; 刘琳
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: CN102772806B

Abstract

本发明涉及一种内源性的非编码小RNA、包含其的药物组合物，以及其用于治疗或预防睾丸癌的新用途。本发明通过将microRNA-302家族成员(miR-302)小RNA与铂类抗肿瘤药联合使用，可以明显提高铂类抗肿瘤药对睾丸癌的治疗效果，同时减少铂类抗肿瘤药的给药剂量、用药时程并降低其副作用。本发明还完善了铂类抗肿瘤药治疗睾丸癌的分子机制，并为治疗睾丸癌开辟了新的治疗靶点，具有重大的价值。

Description

小分子核酸miR-302用于治疗或预防睾丸癌的用途

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小RNA、包含其的药物组合物，以及其用于治疗或预防睾丸癌的新用途。具体地，本发明涉及microRNA-302家族成员(miR-302)用于治疗或预防睾丸癌的新用途。

背景技术

睾丸癌在一般人群中是一种相对罕发的癌症类型，但却是15-35岁青年男性最常见的恶性肿瘤之一(1)。近几十年来，睾丸癌全球发病率有逐渐增加的趋势，尤其在一些西方国家，发病率以每年1％～2％的速度增长(2-3)。睾丸肿瘤发病率在世界各地有所不同，黑人很少发生本病，东欧和亚洲地区发病率约为1/10万男性，欧美地区为2/10到6.3/10万男性。在我国发病率及死亡率均在1/10万左右，该病与其他肿瘤相比虽然发病率低，但恶性比例较高，且95％以上为恶性，最重要的是该病多发生于性功能最活跃的时期。

睾丸肿瘤预后较好，经过治疗后患者可能可以生存几十年，可以认为是治愈。95％的早期患者可长期存活，晚期肿瘤经过放疗、化疗以及造血干细胞支持的大剂量化疗等综合治疗，5年存活率为80％，但治疗所需花费较大。复发或转移病例均容易出现耐药，长期存活率仅为15％。因此，目前治疗的重点在于减少近期和远期的副反应、提高患者的可接受性并改善生活质量。由于大部分患者是青年男性，所以睾丸癌的治疗效果不仅仅是考察治疗反应率和生存率，而更为重要的是考察患者在治疗之后其生活质量、生育能力以及长期毒性。因此，急需研发新的睾丸癌治疗药物，以确保在不降低治疗效果的同时减少治疗带来的副作用，改善目前的治疗现状。

microRNAs(miRNAs)是一类长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA，通过与靶mRNAs 3′端非翻译区结合发挥其调节功能。研究表明，miRNAs广泛参与了不同生理及病理过程的调节，如发育、凋亡、分化、增殖、代谢、应激等(4-6)。近几年，miRNAs在睾丸癌中的调控作用不断得到阐明(7-12)，已成为睾丸癌疾病的研究热点。同时，基于miRNA靶点的药物在各种疾病中的应用不断获得试验成功(7，13-14)。

然而，目前尚未有关于miRNA与化疗药物联合治疗睾丸癌的研究。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明人通过研究发现了睾丸癌对铂类抗肿瘤药治疗极其敏感的分子机制，并利用在该分子机制中起关键作用的miRNA的变化，提供了用于治疗或预防睾丸癌的新型药物组合物。

在本发明中所利用的miRNA是一组与铂类抗肿瘤药刺激睾丸癌细胞系相关的miRNAs，即miR-302家族成员，其包括miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d。它们的序列如下：

miR-302a 5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA- 3’(SEQ IDNO：1)

miR-302b 5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG- 3’(SEQ IDNO：2)

miR-302c 5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG- 3’(SEQ IDNO：3)

miR-302d 5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU- 3’(SEQ IDNO：4)

因此，在第一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与递送载体结合的小分子核酸miR-302、铂类抗肿瘤药和药用辅料或赋形剂以及任选地一种或多种其他对睾丸癌有效的抗肿瘤药(即以铂类抗肿瘤药为基础的联合化疗方案中的其他抗肿瘤药，这些其他抗肿瘤药是本领域技术人员所熟悉的)。所述小分子核酸miR-302可以选自miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d中的一种或两种以上的组合。

在第二个方面，本发明提供了小分子核酸miR-302与铂类抗肿瘤药在制备治疗或预防睾丸癌的药物中的用途。所述小分子核酸miR-302可以选自miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d中的一种或两种以上的组合。在优选的实施方案中，小分子核酸miR-302被制成为药物组合物的形式或者小分子核酸miR-302和铂类抗肿瘤药被制成为药物组合物的形式，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对睾丸癌有效的抗肿瘤药(即以铂类抗肿瘤药为基础的联合化疗方案中的其他抗肿瘤药，这些其他抗肿瘤药是本领域技术人员所熟悉的)。也就是说，小分子核酸miR-302可以与铂类抗肿瘤药配制成一种药物组合物给药，也可以作为两种药物单独给药。当作为两种药物单独给药时，两者可以同时(在本发明中是指两者用药间隔不超过2小时)、序贯(在本发明中是指两者用药间隔不超过12小时)或间隔给药。

在本发明的一个优选实施方案中，小分子核酸miR-302与铂类抗肿瘤药分别配制成药物组合物单独地间隔给药。在此情况下，两者给药的次序不限，可以先给予miR-302后给予铂类抗肿瘤药，且反之亦然，优选先给予miR-302以提高肿瘤细胞对铂类抗肿瘤药的敏感性。两者的给药间隔可以为12-48小时，或间隔1至21天(即一个化疗周期内)，甚至可以根据治疗方案间隔1-3个以铂类抗肿瘤药为基础的化疗周期(例如常规21天一个化疗周期的化疗方案)。

在本发明的一个实施方案中，所述递送载体可以选自病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。例如，可以将miR-302与胆固醇连接制备相应的药物，其制备方法可采用首先化学合成miR-302序列，在其尾端连接胆固醇的常规核酸制剂的方法。还可以将miR-302a与纳米颗粒连接制备相应的药物，其制备方法可采用：化学合成miR-302a序列，将其与适宜的纳米颗粒混合，制成连有miR-302a的纳米颗粒，用于治疗睾丸癌药物的制备。为了增加核酸试剂的使用效果，还可辅以专用的稳定剂和特异性免疫增强剂精制而成。

铂类抗肿瘤药是一类铂的金属络合物，其作用类似烷化剂，主要作用靶点为DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成复合物，干扰DNA复制，或与核蛋白及胞浆蛋白结合，属于周期非特异性药物。该类药物为治疗多种实体瘤的一线用药，为广谱抗肿瘤药。在本发明中，铂类抗肿瘤药可以选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂(nedaplatin)、乐铂(1obaplatin)、沙铂(satraplatin)、环铂(cycloplatin)、L-NDDP、3SK12053、TRK-710、络铂、庚铂(heptaplatin)、乙酸铂(JM-216)或其他铂类抗肿瘤药。顺铂为第一代铂类抗肿瘤药，卡铂和奈达铂为第二代铂类抗肿瘤药，奥沙利铂等为第三代药物。此类抗肿瘤药的常见毒副作用包括肾毒性、耳毒性、消化道毒性、骨髓抑制、过敏反应和神经毒性等。另外，铂类抗肿瘤药之间具有一定的交叉耐药性，例如，卡铂尽管化学稳定性和毒副作用均优于顺铂，但与顺铂的交叉耐药度达到90％。

在本发明的一个实施方案中，miR-302以治疗有效量提供。例如：化疗剂铂类抗肿瘤药可通过标准化疗方案如EP方案或BEP方案等递送，miR-302则以包含1～500mg(例如，1、10、50、100、250或500mg)单位剂量的miR-302的药物组合物形式以每天1～3次的方案用药。miR-302和化疗剂的剂量可考虑以下因素：患者年龄、一般健康状况、疾病的严重程度(例如，肿瘤分期)、对治疗的反应以及治疗中发生的不良事件(例如，药物不良反应、并发症等)的频次和严重程度等等。

在本发明的一个优选实施方案中，当miR-302与铂类抗肿瘤药联合使用时，铂类抗肿瘤药的用量可以减少至常规化疗方案中用量的20～80％（例如，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％以上)，优选30～80％，甚至更优选60％以上(例如60％～80％)。

在本发明中，miR-302和铂类抗肿瘤药的给药途径优选为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域熟知的靶向给药技术进行睾丸或肿瘤靶向给药。在先给予铂类抗肿瘤药后给予miR-302的情况下，miR-302可以采取局部注射给药或睾丸动脉或髂动脉内灌注给药以便快速提高肿瘤细胞对铂类抗肿瘤药的敏感性。在先给予miR-302后给予铂类抗肿瘤药的情况下，miR-302可以采取静脉内输注的方式给药(例如，一天1-3次，持续1～3天)以维持肿瘤细胞的敏感性。

在本发明的优选实施方案中，根据本发明的治疗或预防睾丸癌的药物尤其可以用于治疗以下病例：睾丸癌复发，T3期以上，对铂类抗肿瘤药耐药，应用铂类抗肿瘤药后产生毒副作用，既往采用铂类抗肿瘤药单药治疗方案无效，或既往采用用于睾丸癌的一线联合化疗方案无效。

本发明的有益效果：

1.发现了miR-302家族四个成熟体(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)的表达水平均依铂类抗肿瘤药浓度的增加而增加，表明其在铂类抗肿瘤药杀伤肿瘤细胞的过程中起介导作用。

2.miR-302与铂类抗肿瘤药联合使用可以促使肿瘤细胞的细胞周期停滞在G2/M期从而增强肿瘤细胞对铂类抗肿瘤药的敏感性，并参与铂类抗肿瘤药诱导的NT2细胞凋亡。

3.miR-302与铂类抗肿瘤药联合使用可以明显提高铂类抗肿瘤药对睾丸癌的治疗效果，同时减少铂类抗肿瘤药的给药剂量(在原有剂量基础上减少至少60％以上，见实施例2，过表达miR-302的细胞在20μM浓度的顺铂作用下就发生凋亡，而对照在50μM浓度的顺铂作用下才发生凋亡)和用药时程。

4.外源沉默p53基因的表达可以通过上调miR-302转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)的表达从而促进顺铂诱导的NT2细胞凋亡。

附图说明

图1图示了顺铂刺激睾丸癌细胞系NT2诱导miR-302家族成员以浓度依赖和时间依赖方式增加。

A.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302各家族成员(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)在不同浓度顺铂刺激24小时条件下，均上调；

B.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302各家族成员(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)在50νM顺铂浓度刺激不同时间条件下均上调；

C.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302前体(pri-miR-302)在不同浓度顺铂刺激24小时条件下上调；

D.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302前体(pri-miR-302)在50νM顺铂浓度刺激不同时间条件下上调；

E.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)在不同浓度顺铂刺激24小时条件下上调；

F.通过实时定量PCR方法检测发现miR-302的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)在50μM顺铂浓度刺激不同时间条件下上调。

图2图示了在睾丸癌细胞系NT2中，外源过表达miR-302a促进顺铂诱导的NT2细胞的凋亡。

A.通过敏感性方法检测发现外源过表达miR-302各家族成员模拟物(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)可以提高NT2细胞对顺铂的敏感性；

B.通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物促进顺铂诱导的NT2细胞的凋亡；

C和D.通过流式细胞计数方法发现外源过表达miR-302a模拟物分别促进顺铂诱导的NT2细胞的早期凋亡和晚期凋亡；

E.通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物促进顺铂诱导的NT2细胞的凋亡途径包括线粒体途径和死亡受体途径；

F.通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a抑制剂抑制顺铂诱导的NT2细胞的凋亡；

G通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a抑制剂可以部分恢复miR-302a模拟物促进的顺铂诱导的NT2细胞的凋亡。

图3图示了外源过表达miR-302a模拟物提高顺铂对睾丸癌细胞系NT2的治疗效应。

A.通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物可以在相同顺铂处理时间内，在较小浓度促进NT2细胞系的凋亡；

B.通过Western blotting方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物可以在相同顺铂处理浓度内，在较短时间促进NT2细胞系的凋亡；

C.通过敏感性方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物可以促进前列腺癌细胞系DU145(图C1)，乳腺癌细胞系MDA-MB-231(图C2)对顺铂的敏感性效应，对肝癌细胞系HepG2(图C3)，宫颈癌细胞系HeLa(图C4)没有明显效应。

图4图示了外源过表达miR-302a模拟物通过使细胞周期停滞在G2/M期促进顺铂诱导的凋亡效应。

A.通过细胞增殖实验发现外源过表达miR-302a模拟物抑制NT2细胞的增殖；

B.通过流式细胞计数方法发现外源过表达miR-302a模拟物促使细胞周期停滞在G2/M期；

C.通过流式细胞计数方法发现外源过表达miR-302a抑制剂可以部分恢复miR-302a模拟物促使的G2/M期停滞；

D和E.通过流式细胞计数方法发现顺铂刺激NT2细胞系提高外源过表达miR-302a模拟物导致的G2/M期停滞。

图5图示了外源过表达miR-302a模拟物通过抑制p21的表达提高NT2细胞对顺铂的敏感性。

A.通过流式细胞计数方法发现顺铂刺激NT2细胞系促进p21siRNA促使的G2/M期停滞；

B.通过Western blotting方法检测发现p21siRNA促进顺铂诱导的NT2细胞的凋亡；

C.通过敏感性方法检测发现p21siRNA提高NT2细胞对顺铂的敏感性；

D.通过敏感性方法检测发现外源过表达miR-302a模拟物而不是miR-93模拟物提高提高NT2细胞对顺铂的敏感性；

E.通过Western blotting方法检测发现miR-302a在其家族成员中诱导的凋亡效应最明显；

F.通过Western blotting方法检测发现p21siRNA可以提高miR-302a促进的顺铂诱导的NT2细胞的凋亡效应；

G.通过敏感性方法检测发现p21siRNA可以提高miR-302a促进的顺铂诱导的对NT2细胞的敏感性效应。

图6图示了提高的p53水平保护NT2细胞免于顺铂诱导的凋亡。

A.通过实时定量PCR方法检测发现顺铂诱导的miR-302a的上调不参与MEK/ERK途径；

B.通过实时定量PCR方法检测发现沉默p53可以提高miR-302a成熟体的表达水平在顺铂刺激或不刺激时；

C.通过实时定量PCR方法检测发现沉默p53可以提高miR-302a前体(pri-miR-302)的表达水平在顺铂刺激或不刺激时；

D.通过Western blotting方法检测发现，沉默p53可以增加miR-302a促进的顺铂诱导的凋亡效应；

E.通过实时定量PCR方法检测发现沉默p53可以提高miR-302a的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)的mRNA的表达水平在顺铂刺激或不刺激时；

F.通过Western blotting方法检测发现沉默p53可以提高miR-302a的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)的protein的表达水平在顺铂刺激或不刺激时。

具体实施方式

下面结合附图和下面的实施例说明本发明，要理解的是下面的实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围，即本发明的范围不限于这些实施例。

概述

在下面的具体实施例中，首先利用实施例1中的材料及结合实施例2中实时荧光定量PCR方法检测特定刺激时间不同顺铂刺激浓度以及特定顺铂浓度不同刺激时间条件下miR-302家族成员的表达，结果如图1。图1A、C和E显示在不同浓度顺铂刺激24小时条件下，miR-302的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)，前体(pri-miR-302)以及miR-302家族四个成熟体(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)的表达水平均依顺铂浓度的增加而增加；图1B、D和F显示在顺铂浓度为50μM条件下刺激不同时间，miR-302的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)，前体(pri-miR-302)以及miR-302家族四个成熟体(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)的表达水平均依顺铂刺激时间的延长而增加。

其次，实施例2中采用敏感性试验以及Western blotting方法和流式细胞术方法证实了miR-302a促进顺铂诱导的睾丸癌细胞系NT2的凋亡效应，结果如图2。可以看出无论采用蛋白印迹技术还是流式细胞术分析均可以得到miR-302a促进顺铂诱导的NT2细胞的凋亡(图2B、C、D和E)，反之，miR-302a抑制剂可以抑制这种凋亡效应(图2F)，而在共转miR-302a模拟物和miR-302a抑制剂的情况下，则miR-302a抑制剂可以部分恢复miR-302a诱导的凋亡效应(图2G)。采用实施例2中细胞敏感性试验及Western blotting方法发现，外源过表达miR-302a模拟物可以显著提高顺铂的治疗效应。如图3A，对分别转染了模拟物对照以及miR-302a模拟物的细胞用不同浓度顺铂刺激(0，10，20和50μM)24小时，结果表明miR-302a模拟物转染后的细胞在20μM就可以发生凋亡，而模拟物对照组仅在50μM时发生凋亡。同时，特定浓度如50μM顺铂刺激下，miR-302a模拟物转染组发生的凋亡远远大于模拟物对照组发生的凋亡。同样的，如图3B所示，在用50μM顺铂浓度分别刺激模拟物对照组及miR-302a模拟物组不同时间(0，1，3，6，12和24小时)时，miR-302a模拟物转染组更早的响应顺铂诱导的凋亡效应，且在相同刺激时间情况下，miR-302a模拟物转染组凋亡效应更明显。因此，miR-302a可以作为制备治疗睾丸癌的治疗药物。具体的，可以合成miR-302a并与适当递送载体(纳米颗粒，壳聚糖，脂质体，胆固醇等)连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射等方式，对化疗药物抗性(尤其是顺铂联合治疗)以及一些接受化疗之后复发耐药病人进行治疗。另外，从图3C中看可以看出，miR-302a模拟物对顺铂治疗其他癌症细胞系选择性的也具有一定的协同效应，因此还可通过荧光定量PCR等方法检测患者(包括睾丸癌患者或者其他癌症患者)肿瘤组织中miR-302a的表达水平，从而判断是否联合miR-302或其模拟物用于对癌症的治疗中。

第三，阐明miR-302a参与顺铂诱导的NT2细胞凋亡的信号途径。采用实施例2中的细胞增殖实验及流式细胞术等方法分析miR-302a对细胞增殖及周期的影响，结果如图4。图4A显示外源过表达miR-302a模拟物抑制睾丸癌细胞系NT2细胞的增殖。图4B-E说明外源过表达miR-302a模拟物不仅可以单纯导致细胞周期停滞在G2/M期。更为重要的是，当在外源过表达miR-302a模拟物的同时，加入顺铂刺激该转染组细胞，则会使G2/M期细胞变得更多。据文献可知(15)，睾丸癌细胞系对顺铂敏感的一个很大原因是细胞周期的停滞，停滞在G2/M期的细胞更容易受到顺铂的刺激而发生凋亡，说明细胞周期停滞在G2/M期是造成miR-302a可以协同促进顺铂凋亡效应的一个十分重要的原因。

采用实施例2中的敏感性试验，流式细胞术以及Western blotting方法，如图5所示，发现miR-302a通过沉默p21的表达促进这种凋亡效应。从图5A可以看出沉默p21可以使细胞周期停滞在G2/M期，且该期细胞的数量随着顺铂的刺激变得更多，停滞效应更明显。进一步的，通过Western blotting实验发现单独沉默p21(图B)可以促进顺铂诱导的凋亡效应。当共转染miR-302a模拟物和p21siRNA，如图F所示，p21siRNA可以提高miR-302a模拟物促进的顺铂诱导的凋亡效应。值得提出的是，在miR-302家族四个成员中(miR-302a，miR-302b，miR-302c和miR-302d)，miR-302a表现出了最强的凋亡效应(图5E)，提示，miR-302a在治疗睾丸癌中的积极意义。

而且，利用实施例2中的荧光定量PCR技术，如图6A和B所示，顺铂促进的miR-302a的产生并不依赖此前有文章报道的MEK/ERK途径(16)。当沉默p53后，miR-302a表达量上调，并在受到顺铂刺激时进一步升高(图6B)。通过荧光定量PCR技术进一步发现，miR-302前体(pri-miR-302)的表达水平在沉默p53后上调，在沉默p53且顺铂刺激的情况下，上调更大(图6C)。为了深入了解p53在该过程中扮演的角色，我们共转染p53siRNA和miR-302a模拟物于NT2细胞中，并以顺铂刺激。Western blotting检测发现，沉默p53可以促进miR-302a增强的的顺铂诱导的凋亡(图6D)。我们推测，该效应可能源于miR-302转录因子的改变。通过实时定量PCR技术和Western blotting技术发现，miR-302的转录因子(Oct4，Sox2和Nanog)无论从mRNA水平还是protein水平，在沉默p53时上调，在受到顺铂刺激时进一步上调(图6E和F)。Mueller等在2006年时曾指出(17)，缺失Oct4可造成睾丸癌细胞系对顺铂的耐药性，此结果更证实了我们的推论，即沉默p53可以上调miR-302a的转录因子的表达，而上调的这些因子可以促进顺铂的这种凋亡效应。因此，可以通过上述机理利用miR-302a制备用于治疗或预防睾丸癌的药物。在临床实际应用中，可以利用单克隆抗体技术、各种药物靶向技术、寡核苷酸合成技术等适宜的技术合成miR-302a并与病毒、纳米颗粒、壳聚糖，脂质体，胆固醇等适当递送载体连接形成药物或剂型以适于局部、全身、靶向递送，用于协同顺铂治疗睾丸癌。

实施例1：实验材料准备

一、细胞系、细胞培养及转染

人恶性多发性畸胎瘤细胞NTera-2(NT2)，人前列腺癌细胞DU145，乳腺癌细胞MDA-MB-231，肝癌细胞HepG2，宫颈癌细胞HeLa均购于ATCC。上述各细胞均培养于Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基，其中含10％胎牛血清(FBS，Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY，USA)、1％抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；LifeTechnologies)；培养在37℃含5％CO₂的培养箱中。传代时NT2细胞采用细胞刮刮除，余细胞均用胰酶(Trypsin-EDTA溶液)消化。

上述细胞转染小RNA均采用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)转染试剂。除非特定说明，小干扰RNA为50nMsiRNAs，microRNA模拟物及其对照为100nM，模拟物抑制剂及其对照为150nM.(寡核苷酸序列见表1)

表1.寡核苷酸序列。

二、主要商品化试剂盒

总RNA和小RNA抽提试剂盒：mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion)SYBR Green法实时荧光定量PCR检测：SYBR Premix EX Taq kit(TaKaRa)，引物见表2。

TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测：TaqMan microRNA assays(AppliedBiosystems)

流式细胞术凋亡检测试剂盒：Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(Beij ing Biosea Biotechnology)

细胞活性检测试剂盒：Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo Laboratories)

上述实验操作按试剂盒说明书描述过程进行具体实施。

表2.实时荧光定量PCR所采用的引物序列。

实施例2：细胞生物学实验手段分析miR-302a及其相关基因的功能

一、Western blotting

试剂配制：

1)RIPA裂解缓冲液：50mMTris-HCl(pH 7.4)，150mMNaCl，1％TritonX-100，1％十二烷基硫酸钠，1％脱氧胆酸钠，1mM EDTA，

并根据需要添加：

蛋白酶抑制剂：EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche)及1mM苯

甲磺酰基氟化物(PMSF)

磷酸酶抑制剂：5mM原钒酸钠

2)蛋白电泳分离胶和浓缩胶

3)还原型5×SDS上样缓冲液(loading buffer)：Tris·HCl(pH 6.8)250mM，β一疏基乙醇5％，SDS 10％，溴酚蓝0.5％，甘油50％

4)Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mMTris，250mM甘氨酸(pH 8.3)，0.1％SDS；

5)转移缓冲液：Tris3.03g/L，Glycine 18.8g/L，SDS 1g；

6)10×丽春红染液：丽春红S 2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，蒸馏水至100ml，使用时稀释10倍；

7)TBST缓冲液：20mMTris-HCl(pH 7.5)，150mMNaCl，0.5％

Tween-20；

8)封闭液：5％脱脂奶粉(用TBST配置)。

实验步骤：

1.蛋白样品准备

1)裂解细胞或组织获取蛋白：细胞离心后在沉淀中加入RIPA裂解缓冲液；裂解组织采用凯基全蛋白提取试剂盒中裂解缓冲液，并用组织匀浆器手动匀浆(注意低温操作)；

2)冰上裂解15-20min；

3)加入5×上样缓冲液于100℃金属浴上煮10min；

4)15,000g离心1min，取上清分装于1.5ml离心管中并置于-80℃保存。

2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

1)配制12％分离胶(8％-15％)，灌入固定好的玻璃板后，用水封盖15-20min直至分离胶聚合凝固；

2)倒掉水后，并用滤纸吸干玻璃板中的残留的水，按上述配方配制5％的浓缩胶，加到分离胶上(避免气泡)，立即插入梳子；

3)待胶凝好后，小心拔掉梳子，将玻璃板固定在电泳槽中，加满Tris-甘氨酸电泳缓冲液；

4)上蛋白样，电泳，120V稳压电泳至上样缓冲液蓝线离开胶板结束。

3.免疫印迹分析(免疫印迹所用一抗及二抗分别见表6及表7)

1)将SDS-PAGE电泳好的胶剥离胶板放入转移缓冲液中，并裁剪和分离胶大小一致的硝酸纤维素膜置于胶上，两侧放上滤纸，夹上转膜夹，形成“三明治”结构；

2)将夹子放入转移槽中，添加转移缓冲液进行电转移：350mA稳流电转移，约1.5小时；

3)转完后将膜用1×丽春红染液染色，水冲洗掉没染上的染液即可看到膜上蛋白，裁剪并标记蛋白Marker；

4)5％脱脂奶粉封闭1h(于脱色摇床上，下面洗涤/孵育也是)；

5)TBST缓冲液洗膜3次，每次5-10分钟，弃上清；

6)添加一抗室温孵育2小时或4℃孵育过夜；

7)TBST缓冲液洗膜3次，每次5-10分钟，弃上清；

8)添加相应二抗室温孵育1小时；

9)TBST缓冲液洗膜3次，每次10-15分钟，弃上清；

10)将硝酸纤维素膜转移到X-光片夹；

11)在暗室中于酸纤维素膜上添加适量反应底物，并在红灯下取出X-光片剪裁适当大小置于膜上，关上X-光片夹；

12)取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻将其放到定影液中终止显影；

13)胶片可洗涤、晾干后保存于室温。

二、细胞增殖分析

1.按3-5×10³密度将细胞传代于96孔板，每一条件重复5孔；

2.第二天，按转染试剂说明书转染细胞；

3.转染后48h，换新鲜培养基，每孔100μL；

4.每孔添加10μL CCK-8，37℃培养箱反应2h；

5.将96孔板置于酶标仪光度计(ELx800Universal Microplate Reader；Biotek Instrument Inc.，Highland Park，VT，USA)样品池，设定参数，吸光度为450nm下检测。

三、流式细胞术分析

仪器：流式细胞仪，FACScalibur flow cytometer(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)

数据分析：WinMDI 2.9software(The Scripps Research Institute，La.Jolla，CA，USA)

试剂盒：Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(Beijing BioseaBiotechnology Co.，LTD，China)

1.细胞周期检测

1)按60-70％密度将细胞接种到6孔板；

2)第二天按转染试剂说明书转染细胞；

3)转染后24h收集细胞，4℃2500r/min离心5min；

4)弃上清，加入PBS洗涤，4℃2500r/min离心5min；

5)弃上清，添加70％乙醇4℃固定过夜；

6)4℃2500r/min离心5min；

7)弃上清，加入PBS洗涤，4℃2500r/min离心5min；

8)弃上清，加入PBS及100μg/ml RNase A和25μg/ml碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich)，37℃孵育10min；

9)流式细胞仪检测后软件分析。

2.细胞凋亡检测

1)按30-50％密度将细胞接种到6孔板；

2)第二天按转染试剂说明书转染细胞；

3)转染后72h收集细胞，4℃2500r/min离心5min；

4)弃上清，加入PBS洗涤，4℃2500r/min离心5min；

5)加入200μL结合缓冲液及10μL Annexin V和5μL PI，室温反应15min或4℃，30min；

6)流式细胞仪检测后软件分析。

四、细胞敏感性试验

收集处于对数生长期的NT2细胞并传至12孔板，细胞密度大约在40％-60％之间。转染小RNA24小时后，细胞重新收集起来并以每孔3-5×10³细胞重新传至96孔板。贴壁培养24小时后，加入不同浓度顺铂(0至20μM)刺激72小时，之后以CCK-8试剂盒检测细胞存活率。

五、统计分析

采用Student’s t-test检验变量间显著差异性，数值以均数±SEM显示。

P值小于0.05作为统计显著性阈值。

参考文献

1.Schottenfeld D，etal.(1980)The epidemiology of testicular cancer inyoung adults.(Translated from eng)AmJ Epidemiol112(2)：232-246(ineng).

2.Einhorn LH(1990)Treatment of testicular cancer：a new and improvedmodel.(Translated from eng)J Clin Oncol8(11)：1777-1781(in eng).

3.Masters JR&Koberle B(2003)Curing metastatic cancer：lessons fromtesticular germ-cell tumours.(Translated from eng)NatRev Cancer3(7)：517-525(in eng).

4.Kloosterman WP&Plasterk RH(2006)The diverse functions ofmicroRNAs in animal development and disease.(Translated from eng)Dev Ce11(4)：441-450(in eng).

5.Ambros V(2004)The functions of animal microRNAs.(Translated fromeng)Nature 431(7006)：350-355(in eng).

6.Croce CM(2009)Causes and consequences of microRNA dysregulationin cancer.(Translated from eng)NatRev Genet 10(10)：704-714(in eng).

7.Murray MJ，etal.(2011)Identifcation of microRNAs From themiR-371～373and miR-302clusters as potential serum biomarkers ofmalignant germ cell tumors.(Translated from eng)AmJ Clin Pathol135(1)：119-125(in eng).

8.Palmer RD，etal.(2010)Malignant germ cell tumors display commonmicroRNA profiles resulting in global changes in expression ofmessenger RNA targets.(Translated from eng)Cancer Res70(7)：2911-2923(in eng).

9.Bartkova J，Thullberg M，Rajpert-De Meyts E，Skakkebaek NE，&Bartek J (2000)Cell cycle regulators in testicular cancer：loss ofp18INK4C marks progression from carcinoma in situ to invasive germcell tumours.(Translated from eng)Int J Cancer 85(3)：370-375(in eng).

10.Masters JR，Osborne EJ，Walker MC，&Parris CN (1993)HyPersensitivity of human testis-tumour cell lines to chemotherapeutic

drugs.(Translated from eng)Int J Cancer 53(2)：340-346(in eng).

11.Huddart RA，etal.(1995)Programmed cell death in response tochemotherapeutic agents in human germ cell tumour lines.(Translatedfrom eng)Eur J Cancer 31A(5)：739-746(in eng).

12.Andrews PW (1998)Teratocarcinomas and human embryology：pluripotent human EC cell lines.Review article.(Translated from eng)APMIS 106(1)：158-167；discussion 167-158(in eng).

13.Zhao JJ，etal.(2008)MicroRNA-221/222negatively regulates estrogenreceptor alpha and is associated with tamoxifen resistance in breastcancer.(Translated from eng)JBiolChem283(45)：31079-31086(ineng).

14.Liang Z，etal.(2010)Involvement of miR-326in chemotherapyresistance of breast cancer through modulating expression of multidrugresistance-associated protein 1.(Translated from eng)BiochemPharmacol79(6)：817-824(in eng).

15.Mueller S，etal.(2006)Cell-cycle progression and response of germ celltumors to cisplatin in vitro.(Translated from eng)Int J Oncol29(2)：471-479(in eng).

16.Schweyer S，et al.(2004)Cisplatin-induced apoptosis in humanmalignant testicular germ cell lines depends on MEK/ERK activation.(Translated from eng)BrJ Cancer 91(3)：589-598(in eng).

17.Mueller T，etal.(2006)Loss of Oct-3/4expression in embryonalcarcinoma cells is associated with induction of cisplatin resistance.(Translated from eng)TumourBiol27(2)：71-83(in eng).

Claims

1.一种药物组合物，其包含与递送载体结合的小分子核酸miR-302、铂类抗肿瘤药，和药用辅料或赋形剂以及任选地一种或多种其他对睾丸癌有效的抗肿瘤药。

2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述递送载体为病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。

3.小分子核酸miR-302与铂类抗肿瘤药在制备治疗或预防睾丸癌的药物中的用途。

4.权利要求1-3中任一项所述的药物组合物或用途，其特征在于所述小分子核酸miR-302为选自miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d中的一种或两种以上的组合。

5.权利要求1-4中任一项所述的药物组合物或用途，其特征在于所述铂类抗肿瘤药选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、乐铂、沙铂、环铂、L-NDDP、3SK12053、TRK-710、络铂、庚铂、乙酸铂或其他铂类抗肿瘤药。

6.权利要求3-5中任一项所述的用途，其特征在于所述小分子核酸miR-302被制成为药物组合物的形式，所述药物组合物任选地包含一种或多种其他对睾丸癌有效的抗肿瘤药。

7.权利要求3-6中任一项所述的用途，其特征在于所述小分子核酸miR-302和铂类抗肿瘤药被制成为药物组合物的形式，所述药物组合物任选地包含一种或多种其他对睾丸癌有效的抗肿瘤药。

8.权利要求3-7中任一项所述的用途，其特征在于所述小分子核酸miR-302与递送载体结合，所述递送载体选自病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。

9.权利要求3-8中任一项所述的用途，其特征在于所述药物用于治疗以下病例：睾丸癌复发，肿瘤分期T3期以上，对铂类抗肿瘤药耐药，应用铂类抗肿瘤药后产生毒副作用，既往采用铂类抗肿瘤药单药治疗方案无效，或既往采用用于睾丸癌的一线联合化疗方案无效。

10.权利要求6-9中任一项所述的用途，其特征在于铂类抗肿瘤药的用量比常规化疗方案中的用量减少20～80％。