CN104288784A - 纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用，属于生物医学领域。本发明复合物由纳米羟基磷灰石、抗肿瘤基因、抗肿瘤药物组成，纳米羟基磷灰石尺寸为20-300nm，基因为抗肿瘤基因，药物为抗肿瘤药物。制备方法为：以钙盐和磷酸盐溶液混合制备纳米羟基磷灰石，吸附抗肿瘤基因形成纳米羟基磷灰石-基因前体复合物，该前体复合物进一步吸附抗肿瘤药物形成复合物；该复合物可高效穿过癌细胞膜，促进癌细胞凋亡。使用生物相容性良好的羟基磷灰石作为共传递载体，安全性高，对基因和药物的负载率高，转染效率高，对癌细胞的杀伤作用大。以纳米羟基磷灰石作为基因和药物的共传递载体在癌症治疗领域具有重大应用前景。

Description

纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用。

背景技术

近些年，治疗癌症的通用方法是手术，放射治疗和化疗，其中包括诸如阿霉素、紫杉醇、顺铂等在内的化疗药物正在被广泛使用。以阿霉素为例，作为一种光谱的非特异性细胞周期抗癌药物，阿霉素可镶嵌到RNA和DNA上，抑制细胞周期，进而促进肿瘤细胞凋亡。但是，抗肿瘤药物本身存在缺陷：巨大的细胞毒性和严重的副作用，在临床上会对病人带来巨大伤害。

作为一种可治疗基因缺陷疾病的治愈方法，基因治疗已得到快速发展。在多数癌细胞中已发现有肿瘤抑制基因的突变，肿瘤抑制基因的再次引入对癌症的治疗提供了一种可能。例如，野生型p53肿瘤抑制基因在细胞周期调控过程中发挥重要作用。当细胞中的DNA受到损伤时，P53蛋白将结合到受损DNA上，阻止细胞周期运行，进而促使细胞凋亡。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。将野生型p53基因再次引入到肿瘤细胞中，有可能重启p53凋亡途径，并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，例如抗肿瘤药物引起的DNA损伤。

为提升肿瘤治疗效果，联合基因治疗和化疗在最近几年受到广泛关注。Wiradharma等使用两亲物寡肽载体来传递p53基因和阿霉素，发现在人肝癌细胞系水平具有联合凋亡效果；Lu等以阳离子β-环糊精-聚乙烯亚胺作为p53基因和阿霉素的共传递载体，发现可增强乳腺癌移植瘤小鼠模型的肿瘤生长抑制作用，并增长小鼠的存活时间。相较于单一的p53基因治疗和单一的阿霉素治疗，以共传输载体介导的联合治疗作用可显著增强癌细胞凋亡。

联合治疗的最大障碍是寻找一种具有高负载率、安全无毒、可穿透细胞膜，并可保护基因和药物完整到达指定细胞部位的共传递载体系统。在现有报道中，多以阳离子β-环糊精-聚乙烯亚胺、mPEG-PLGA-b-PLL、PLGA-PLLA双壁微球、两亲物寡肽等有机复合物作为基因和药物共传递载体，但是这些有机复合物或多或少都可能会对细胞或组织造成毒性，即使在低浓度下。以无极纳米材料作为药物载体在近些年得到迅猛发展。羟基磷灰石作为一种牙齿骨骼重要组成之一，具有包括良好的生物相容性和生物降解性、安全低毒、稳定的化学结构和载药性广等优点，是一种有潜力的基因和药物载体。但是现有的羟基磷灰石基因转染效率不高，制备一种具有高效转染效率的纳米羟基磷灰石尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种以聚乙烯亚胺包裹，能实现抗肿瘤基因和药物的有效转染及其基因和药物在胞内的缓慢释放，且酸敏响应性的纳米羟基磷灰石，并以其作为基因和药物共传递载体，形成纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用。本发明制备的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物可直接用于瘤内注射或静脉注射。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述复合物由纳米羟基磷灰石、抗肿瘤基因、抗肿瘤药物组成，所述纳米羟基磷灰石尺寸为20-300nm，纳米羟基磷灰石表层由聚乙烯亚胺覆盖，所述基因为抗肿瘤基因，所述药物为抗肿瘤药物。

2、根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述纳米羟基磷灰石表层的聚乙烯亚胺为分枝状，其分子量为8900-120000Da。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤基因为野生型p53基因、Rb基因、p16基因、APC基因、MCC基因、DCC基因、MTS基因、PTEN基因中的任一种或几种。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、盖诺、表阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、多帕菲或它们的衍生物中的任何一种或几种。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将钙盐溶液于0-4℃冷却，逐滴加入等体积磷酸盐溶液，并维持100-300rpm/min搅拌，待滴加完成后，持续搅拌0.5-5h；

2）在步骤1）反应体系中缓慢滴加碳酸氢钠溶液，持续搅拌0.5-5h，其中，碳酸氢钠溶液的滴加量为步骤1）中钙盐溶液体积的0.004-0.01倍；

3）用氨水缓慢调节反应体系的pH值至10-13，调节完成后持续搅拌0.5-5h；

4）缓慢滴加与步骤2）中碳酸氢钠溶液等体积的聚乙二醇-400溶液，持续搅拌0.5-5h；

5）将步骤4）反应体系升温至90℃，持续搅拌0.5-5h；

6）停止加热，待反应体系降温至室温后，分别用去离子水和无水乙醇以离心方式各洗涤沉淀2-3次；

7）用去离子水重悬步骤6）得到的沉淀，加入聚乙烯亚胺溶液涡旋震荡混匀，得到HAp-PEI混合液，室温静置0.5-5h，其中，聚乙烯亚胺溶液的加入量为步骤1）中钙盐溶液体积的0.1-0.5倍；

8）以离心方式离心步骤7）得到的混合液，再以去离子水重悬，得到被PEI包被的纳米羟基磷灰石悬液；

9）将步骤8）得到的纳米羟基磷灰石悬液与抗肿瘤基因按质量分数比20:1-16的比例混合形成纳米羟基磷灰石-基因前体复合物，然后将该前体复合物于室温静置3-30min；

10）将步骤9）得到的纳米羟基磷灰石-基因前体复合物与抗肿瘤药物按质量分数比26:1-10进行混合，并轻轻混合均匀，室温静置3-30min；

11）将步骤10）得到的混合物以离心方式除去游离的抗肿瘤基因和药物，再以去离子水重悬，即得到纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤1）中钙盐溶液终浓度为1-10mmol/L，磷酸盐溶液终浓度为0.5-7mmol/L。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤2）中碳酸氢钠溶液终浓度为0.2-1.2mmol/L。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤7）中加入的聚乙烯亚胺溶液浓度为0.1-5mg/ml。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物在抗肿瘤方面的应用。

所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物在制备抗肿瘤药物方面的应用，其特征在于应用方法如下：

1）首先检测纳米羟基磷灰石作为载体对正常细胞和癌细胞的毒性；

2）然后检测纳米羟基磷灰石对抗肿瘤基因和药物的装载能力以及纳米羟基磷灰石-基因/药物复合物对所负载基因和药物的释放能力；

3）接下来检测在不使用抗肿瘤药物的前提下，纳米羟基磷灰石-基因前体复合物对肿瘤细胞的装染能力；

4）最后检测纳米羟基磷灰石-基因/药物复合物对肿瘤细胞的杀伤作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1）本发明复合物中的纳米羟基磷灰石为骨骼和牙齿的成分类似物，具有良好的生物相容性、具有酸性PH敏感性及良好的降解性；

2）采用本发明方法制备的复合物，其纳米羟基磷灰石外层由聚乙烯亚胺包裹，可大量负载抗肿瘤基因，进而加大对抗肿瘤药物的装载；复合物的酸敏感特性，可实现负载基因和药物的缓慢释放；复合物表面电位为弱的正电型，有利于细胞内吞；复合物的尺寸为20-300nm，在复杂的血液环境中具有良好的分散性和稳定性；复合物可实现抗肿瘤基因和抗肿瘤药物的联合装载，实现基因治疗和化疗对肿瘤的联合作用，增强治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中纳米羟基磷灰石的电子扫描电镜图；

图2为本发明实施例1中纳米羟基磷灰石的原子力显微镜图；

图3为本发明实施例1中纳米羟基磷灰石的X-射线衍射图；

图4为本发明实施例1中纳米羟基磷灰石傅立叶红外光谱图；

图5为本发明实施例1中纳米羟基磷灰石对肝正常细胞L-02和肝癌细胞HuH-7的毒性作用；

图6为本发明实施例3中复合物对抗肿瘤基因p53的负载作用；

图7为本发明实施例4复合物负载基因在pH为7.4和6.5两种体系下的缓释作用；

图8为本发明实施例4复合物负载药物在pH为7.4和6.5两种体系下的缓释作用；

图9为发明实施例5中以去离子水作为对照荧光转染图，荧光图像中标尺为200μm；

图10为本发明实施例5中以去离子水作为对照荧光流式细胞图；

图11为本发明实施例5中TurboFect转染试剂负载p53基因的荧光转染图，荧光图像中标尺为200μm；

图12为本发明实施例5中TurboFect转染试剂负载p53基因的荧光流式细胞图；

图13为本发明实施例5中纳米羟基磷灰石负载p53基因的荧光转染图，荧光图像中标尺为200μm；

图14为本发明实施例5中纳米羟基磷灰石负载p53基因的荧光流式细胞图；

图15为本发明实施例6中复合物对癌细胞的杀伤作用。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，实施例中除特殊说明外均为本领域常规步骤。

本发明基于包被有阳离子聚合物PEI的纳米羟基磷灰石（HAp）被用于抗肿瘤基因和抗肿瘤药物的共传递，所得纳米羟基磷灰石的基本特征分别采用场发射电子扫描显微镜、X-射线衍射仪、傅立叶红外光谱仪等来测定，其对抗肿瘤基因的包负能力采用琼脂糖凝胶电泳进行测定，其对抗肿瘤药物的包负能力采用超微量分光光度计来测定，并通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪测定纳米羟基磷灰石-基因前体复合物在肿瘤细胞HuH-7中的转染性能，通过离心-测定吸光值的方法测定复合物中抗肿瘤基因在pH为6.4和7.5两种体系下的释放速率，通过透析-测定吸光值的方法测定复合物中抗肿瘤药物在pH为6.4和7.5两种体系下的释放速率，最后纳米羟基磷灰石对正常细胞和肿瘤细胞的毒性作用以及复合物对肿瘤细胞的杀伤作用均采用准确度更高的Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法检测。

以下实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和操作步骤。实施例中6.25mmol/L 硝酸钙溶液和3.74mmol/L磷酸氢二铵溶液配置方法为：称取四水硝酸钙1.475g和磷酸氢二铵0.494g分别全溶于1L去离子水中，即得。碳酸氢钠溶液配置方法为：称取碳酸氢钠0.05g，全溶于1mL去离子水中，即得。PEI溶液配制方法如下：称取质量分数为50%的聚乙烯亚胺20mg，溶于10mL去离子水中，即得。以下实施例中，抗肿瘤基因选用野生型p53基因，是将p53基因重组在质粒pEGFP-C1上的重组质粒--pEGFP-C1-p53。抗肿瘤药物选用阿霉素（Dox），为去离子水溶液。

实施例1：纳米羟基磷灰石的制备及毒性分析

以硝酸钙溶液作为钙盐，以磷酸氢二铵溶液作为磷酸盐。取50mL 的6.25mmol/L硝酸钙溶液于0℃冷却；将50mL 3.74mmol/L磷酸氢二铵溶液逐滴加入到碳酸钙溶液中，并维持200rpm/min；待滴加完成后，持续搅拌60min；缓慢滴加碳酸氢钠溶液200μL，持续搅拌60min；用浓氨水缓慢调节反应体系的pH为10-13，调节完成后持续搅拌60min；缓慢滴加200μL聚乙二醇-400，持续搅拌60min；对反应装置升温至90℃，持续搅拌60min；停止加热，待反应体系降温至室温后，依次去离子水和无水乙醇以离心方式分别洗涤沉淀2-3次；用30mL去离子水重悬沉淀，加入10mL聚乙烯亚胺涡旋震荡混匀，室温静置60min；以离心重悬混合液，再以30mL去离子水重悬，得到被聚乙烯亚胺包被的纳米羟基磷灰石悬液。

所得纳米羟基磷灰石的形态、大小通过场发射电子扫描显微镜、原子力显微镜来观察，物相及其官能团分析则采用X-射线衍射仪和傅立叶红外光谱仪进行测量，测试的结果分别见图1，图2，图3和图4。从扫描电镜和原子力显微镜图片可以看出制得的纳米羟基磷灰石为纳米棒结构，长径为20-50nm，短径约为20nm。从X-射线衍射仪和傅立叶红外光谱仪图片可以确定该纳米颗粒为羟基磷灰石。

纳米羟基磷灰石的毒性分析，是通过制备不同浓度的纳米羟基磷灰石对正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HuH-7的存活率影响来实现，结果见图5。从图中可发现，纳米羟基磷灰石对正常细胞和癌细胞不存在毒性，即使羟基磷灰石的终浓度达到10μg/mL。

实施例2：纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物制备

将60μg抗肿瘤基因p53加入1mL纳米羟基磷灰石悬液中，涡旋震荡，混合均匀，静置30min后，再加入10μg阿霉素，涡旋震荡，混合均匀，静置30min，以10000rpm/min离心5min，去除上清，再以1mL去离子水悬浮混匀，得到纳米羟基磷灰石吸附基因和药物的复合物。

实施例3：纳米羟基磷灰石的载药量测定

通过琼脂糖凝胶电泳的方法测定纳米羟基磷灰石对抗肿瘤基因p53的负载量。分别将2, 4, 6, 8, 10μg p53加入到100μL纳米羟基磷灰石中，涡旋震荡，混合均匀，静置30min，分别取20μL滴加到各琼脂糖凝胶孔中，电压为100V。使用基因凝胶成像系统获得图片。从图6中可看出，8μL凝胶孔有微弱条带，6μL凝胶孔无条带，说明纳米羟基磷灰石对抗肿瘤基因p53的载药量不低于60μg/mL。

通过离心-测定吸光值的方法测定纳米羟基磷灰石对抗肿瘤药物阿霉素的负载量。分别取5, 10, 20, 30 ,40μg Dox加入到100μL 纳米羟基磷灰石-基因中，涡旋震荡，混合均匀，静置30min，以10000 pm/min离心5min，吸取上清，测定其在477nm处的吸光值。比对标准曲线，可测定未被负载的阿霉素量。以公式：负载量=初始Dox总量–未负载量。发现初始阿霉素总量为5, 10, 20, 30 ,40μg的负载量分别为0.11±0.03, 2.92±0.53, 5.47±0.89, 12.25±1.21, 16.85±2.36μg。

实施例4：纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物对基因和药物的释放作用

基因和药物的体外释放于两种生理盐水系统中进行（pH=7.4和6.5）。

A.基因的体外释放

在37℃下，将200μL纳米羟基磷灰石吸附基因和药物的复合物加入到800μL生理盐水中，120rpm/min搅拌。间隔一定时间，以12000 rpm/min离心30min，收集上清，加入相同体积的新鲜生理盐水，涡旋震荡混匀，继续于37℃下搅拌，于260nm处测吸光值，p53基因的体外释放曲线如图7所示，可看出基因/药物纳米羟基磷灰石可持续缓释p53基因，具有良好的缓释效果。

B.药物的体外释放

通过透析的方法测定阿霉素的体外释放。配置10mL纳米羟基磷灰石吸附基因和药物的复合物生理盐水悬液，置于透析袋中（3500Da）。将上述透析袋浸没到90mL生理盐水中，并以120rpm/min速率搅拌，温度控制在37℃。经过一定的时间间隔，取出5mL的透析液，并重新加入5mL新鲜的生理盐水。在477nm处测试阿霉素吸光值，以此获得阿霉素释放率。阿霉素的体外释放曲线如图8所示，可看出基因/药物纳米羟基磷灰石可持续缓释阿霉素，具有良好的缓释效果。

实施例5：纳米羟基磷灰石在癌细胞中的基因转染作用

以肝癌细胞系HuH-7作为转染细胞。将HuH-7(2×10⁴/孔)细胞栽种到6孔板中，24小时后换上新鲜细胞培养液。分别以去离子水（ddH₂O）、HAp-p53和TurboFect转染试剂（已作为商业转染试剂）加入到相应孔中，以GFP的表达量来反映转染效率。通过荧光显微镜和流式细胞仪测试转染效率。将图9，图10，图11，图12，图13，图14综合对比可看出，纳米羟基磷灰石对基因的转染效率在流式细胞中测的数据为10.0%，已非常接近商业转染试剂 TurboFect的转染效率（10.7%），说明实施例1中制备的纳米羟基磷灰石具有优异的基因转染能力。

实施例6纳米羟基磷灰石负载基因和药物对癌细胞的杀伤作用

CCK-8试验被用来测定ddH₂O（Control）, 单一p53，HAp-p53， 单一阿霉素（Dox）和复合物对肝癌细胞系HuH-7的细胞活力影响。HuH-7 (8000/孔)细胞栽种到96孔板中，24小时后换上新鲜细胞培养液，然后分别加入上述5组处理组样品。培养48小时后，每孔加入10μL CCK-8试剂，继续培养2小时。在450nm处测试各孔的吸光值。以下述公式求得各组的细胞毒性：

[1 - ([Abs450]_sample - [Abs450]_Blank) / ([Abs450]_control - [Abs450]_Blank)] × 100%。

从图15可看出，当以各组样品处理24h后，复合物处理组对癌细胞的杀伤率高达50±1.6%，并且随着时间的延长，至48h时，HAp-p53/Dox处理组对癌细胞的杀伤率高达70±2.5%。相较于单一的p53或Dox的杀伤效果，纳米羟基磷灰石吸附基因和药物的复合物联合处理组具有更为显著的肿瘤细胞杀伤作用。

Claims (10)

1.纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述复合物由纳米羟基磷灰石、抗肿瘤基因、抗肿瘤药物组成，所述纳米羟基磷灰石尺寸为20-300nm，纳米羟基磷灰石表层由聚乙烯亚胺覆盖，所述基因为抗肿瘤基因，所述药物为抗肿瘤药物。

2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述纳米羟基磷灰石表层的聚乙烯亚胺为分枝状，其分子量为8900-120000Da。

3.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤基因为野生型p53基因、Rb基因、p16基因、APC基因、MCC基因、DCC基因、MTS基因、PTEN基因中的任一种或几种。

4.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、盖诺、表阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、多帕菲或它们的衍生物中的任何一种或几种。

5.纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将钙盐溶液于0-4℃冷却，逐滴加入等体积磷酸盐溶液，并维持100-300rpm/min搅拌，待滴加完成后，持续搅拌0.5-5h；

2）在步骤1）反应体系中缓慢滴加碳酸氢钠溶液，持续搅拌0.5-5h，其中，碳酸氢钠溶液的滴加量为步骤1）中钙盐溶液体积的0.004-0.01倍；

3）用氨水缓慢调节反应体系的pH值至10-13，调节完成后持续搅拌0.5-5h；

4）缓慢滴加与步骤2）中碳酸氢钠溶液等体积的聚乙二醇-400溶液，持续搅拌0.5-5h；

5）将步骤4）反应体系升温至90℃，持续搅拌0.5-5h；

6）停止加热，待反应体系降温至室温后，分别用去离子水和无水乙醇以离心方式各洗涤沉淀2-3次；

7）用去离子水重悬步骤6）得到的沉淀，加入聚乙烯亚胺溶液涡旋震荡混匀，得到HAp-PEI混合液，室温静置0.5-5h，其中，聚乙烯亚胺溶液的加入量为步骤1）中钙盐溶液体积的0.1-0.5倍；

8）以离心方式离心步骤7）得到的混合液，再以去离子水重悬，得到被PEI包被的纳米羟基磷灰石悬液；

9）将步骤8）得到的纳米羟基磷灰石悬液与抗肿瘤基因按质量分数比20:1-16的比例混合形成纳米羟基磷灰石-基因前体复合物，然后将该前体复合物于室温静置3-30min；

10）将步骤9）得到的纳米羟基磷灰石-基因前体复合物与抗肿瘤药物按质量分数比26:1-10进行混合，并轻轻混合均匀，室温静置3-30min；

11）将步骤10）得到的混合物以离心方式除去游离的抗肿瘤基因和药物，再以去离子水重悬，即得到纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物。

6.根据权利要求5所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤1）中钙盐溶液终浓度为1-10mmol/L，磷酸盐溶液终浓度为0.5-7mmol/L。

7.根据权利要求5所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤2）中碳酸氢钠溶液终浓度为0.2-1.2mmol/L。

8.根据权利要求5所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物的制备方法，其特征在于步骤7）中加入的聚乙烯亚胺溶液浓度为0.1-5mg/ml。

9.纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物在抗肿瘤方面的应用。

10.根据权利要求9所述的纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物在制备抗肿瘤药物方面的应用，其特征在于应用方法如下：

1）首先检测纳米羟基磷灰石作为载体对正常细胞和癌细胞的毒性；

2）然后检测纳米羟基磷灰石对抗肿瘤基因和药物的装载能力以及纳米羟基磷灰石-基因/药物复合物对所负载基因和药物的释放能力；

3）接下来检测在不使用抗肿瘤药物的前提下，纳米羟基磷灰石-基因前体复合物对肿瘤细胞的装染能力；

4）最后检测纳米羟基磷灰石-基因/药物复合物对肿瘤细胞的杀伤作用。