CN105327364A

CN105327364A - 一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法

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Publication number: CN105327364A
Application number: CN201510931270.9A
Authority: CN
Inventors: 孔祥东; 徐晓春; 赖文; 陈岑; 姚菊明; 陈侃
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: CN105327364B

Abstract

本发明公开了一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法，属于生物材料技术制备领域。本发明复合物由纳米羟基磷灰石和siRNA组成。纳米羟基磷灰石为球形，直径约20～50nm，粒径分布均匀。该复合物制备工艺简单，可重复性高，生物相容性好，转染效率可达15.4％，能显著促进细胞凋亡，可应用于药物、基因载体及组织工程等相关领域的研究。

Description

一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

基因治疗癌症是一种新型的根源性癌症治疗方式，其通过抑制或促进某些肿瘤关键基因的方式以抑制肿瘤细胞的生长与增殖，从而达到根源性抑癌的效果。RNA干扰技术可通过siRNA特异性识别并破坏靶基因的mRNA，使特定基因特异性剔除或关闭，达到相应的抑癌效果，目前该技术已被广泛应用于探索基因功能及恶性肿瘤治疗的相关领域。siRNA表面带负电荷，不易穿透同样呈电负性的细胞膜，且其极易被核酸酶所降解而失效。因此，找到一种低毒高效的载体把siRNA准确无误的运送到细胞内去，这是siRNA靶向基因沉默研究当中的最大挑战。

纳米羟基磷灰石(HAp)是一种低毒性的天然无机材料，与牙齿、骨骼同源。它所具备的高生物相容性、低细胞毒性、良好的生物降解性等优良特性促使其成为药物运载方面的热门工具。对纳米羟基磷灰石表面进行一定的物理化学修饰，可改变其表面电荷，有效提高其负载siRNA的能力，保护其成功穿越细胞膜，避免酶促降解，促进内体逃逸，最终达到抑癌或其他疗效。Nie等人(JournalofControlledRelease,2007,1:111-121)制备了一种聚乳酸-羟基磷灰石复合物支架，它可成功转运BMP-2质粒DNA用于骨再生研究。Saffarzadeh等人(NanomedicineJournal,2014,1:292-297)制备了一种由DOPE修饰的HAp，由其携载的mRNA可成功转染宫颈癌细胞系，但仍缺乏足够的转染效率。Gu等人(AdvancedMaterialsResearch,2012,343:926-932)所制备的HAp在运载NR2B-siRNA进入小鼠后发现其明显减少了小鼠NR2B蛋白的表达。

本发明将利用PEI的阳离子聚合物性质，对纳米羟基磷灰石进行改性，在羟基磷灰石表面包裹带正电荷的PEI，形成的HAp-PEI复合物将具有高效的转染效率，同时又几乎不存在细胞毒性。本发明正是基于采用PEI对纳米羟基磷灰石进行包裹形成的纳米颗粒，用于基因药物的运载研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚乙烯亚胺包裹，可应用于抗肿瘤基因和药物的高效转染且易生物降解的纳米羟基磷灰石。本发明所制备的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物转染效率高，制备方法简单、生物安全性高，适用于RNA干扰方法根源性治疗癌症的相关研究。

所述复合物由纳米羟基磷灰石和siRNA组成，所述纳米羟基磷灰石为球形，分散性良好，直径为20～50nm。纳米羟基磷灰石表层由聚乙烯亚胺覆盖，Zeta电位为+13.22±0.5mV。

所述纳米羟基磷灰石表层聚乙烯亚胺分子量为8～120kDa。

所述的siRNA的靶向基因为ras癌基因家族、sis癌基因家族、myc癌基因家族中的一种。

所述的siRNA可用FAM、Cy3、Cy5荧光染料中的一种标记。

所述的纳米羟基磷灰石的快速制备方法包括以下步骤：

1)在15～35℃的反应温度下，将等体积磷酸盐溶液逐滴滴加到钙盐溶液中，以200～400rpm的速度均匀搅拌，以浓氨水调节pH＝10～13，滴加完成后持续搅拌0.5～2h；

2)在步骤1)反应体系中缓慢滴加聚乙二醇溶液，其滴加量为步骤1)钙盐体积的0.005～0.01倍，维持反应体系的pH＝10～13，滴加完成后持续搅拌3-6h，搅拌速度为200～400rpm；

3)在步骤1)反应体系中缓慢滴加聚乙烯亚胺溶液，其滴加量为钙盐体积的0.005～0.01倍，维持反应体系的pH＝10～13，滴加完成后持续均匀搅拌2～12h，搅拌速度为200～400rpm；

4)反应完成后，8000～15000rpm离心3～5min，分离沉淀，将沉淀分别用去离子水、无水乙醇超声清洗3次后将样品置于37℃～70℃烘箱干燥，得到球形羟基磷灰石纳米颗粒；

5)将步骤4)得到的羟基磷灰石紫外灭菌0～24h后以DEPC水重悬、超声，得到羟基磷灰石悬液；

6)将步骤5)得到的纳米羟基磷灰石悬液与siRNA按质量比1:1～20:1进行混合并吹打，20℃静置5～30min，即得到纳米羟基磷灰石-siRNA复合物。

所述纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤1)中的钙盐溶液为Ca(NO₃)₂、CaCl₂水溶液，优选Ca(NO₃)₂溶液，终浓度为1～10mmol/L，优选3.0mmol/L；磷酸盐溶液为Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、(NH₄)₂HPO₄水溶液，优选为(NH₄)₂HPO₄水溶液，终浓度为1～5mmol/L，优选1.8mol/L。

所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤2)中的聚乙二醇为PEG-400。

所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的聚乙烯亚胺溶液浓度为1～100mg/mL，优选为10mg/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明复合物中的纳米羟基磷灰石成分具有良好的生物相容性与降解性。球形纳米羟基磷灰石的直径在20～50nm之间，在复杂的血液环境中具良好的分散性和稳定性。

2)采用本发明法制备的纳米羟基磷灰石作为载体其外由聚乙烯亚胺包裹，Zata电位呈电正性，这极大的提高了其对siRNA的装载率，有利于细胞内吞作用，提高其转染效率，增强治疗效果。

3)此制备条件简单可控，颗粒均匀、形貌稳定。制备的复合物转染效率可达15.4％，能显著促进细胞凋亡，细胞凋亡效率可达40％以上，可用于基因、药物载体与靶向诊断等相关生物医学领域的研究。

附图说明

图1为本发明实例1中纳米羟基磷灰石的场发射电子扫描显微镜图；

图2为本发明实例1中纳米羟基磷灰石的透射电镜图

图3为本发明实例1中纳米羟基磷灰石的X-射线衍射图；

图4为本发明实例1中纳米羟基磷灰石的傅里叶红外光谱图；

图5为本发明实例1中纳米羟基磷灰石在pH为5.6、6.5和7.4三种体系下的降解情况；

图6为本发明实例1中纳米羟基磷灰石对胰腺正常细胞系H6C7和胰腺癌细胞系PANC-1的毒性作用；

图7为本发明实施例2中纳米羟基磷灰石对RNA的负载作用；

图8(a)为本发明实施例3中纳米羟基磷灰石-siRNA-FAM的荧光转染图；对照(b)为DEPC水和siRNA-FAM的荧光转染图；对照(c)为转染试剂siRNA-Mate负载siRNA-FAM的荧光转染图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：纳米羟基磷灰石的制备与分析

室温20℃下，分别配置6.25mmol/L硝酸钙溶液，3.74mmol/L磷酸氢二铵溶液和10mg/L的聚乙烯亚胺溶液。首先，取10mL硝酸钙溶液，用浓氨水将其pH值调至10～13之间，保持200rpm的均匀搅拌速度；然后将磷酸氢二铵溶液以1mL/min的速度滴加到硝酸钙溶液中去，滴加完成后继续搅拌30min，期间保持pH值不变；将100μLPEG-400缓慢滴加到上述反应溶液中，滴加完成后继续搅拌3h，期间保持pH值不变；将100μLPEI溶液缓慢滴加到上述反应溶液中，滴加完成后继续搅拌3h，期间保持pH值不变；反应结束，10,000rpm离心三分钟分离沉淀，将沉淀分别用去离子水、无水乙醇超声清洗3次后将样品置于60℃烘箱干燥，得到磷酸钙粉末。

所得磷酸钙的形态、大小、晶型通过场发射电子扫描显微镜、透射电镜、X-射线衍射、傅里叶红外光谱进行观察，测试结果分别见图1，图2，图3和图4。从扫描电子显微镜和透射电镜结果可得知所制备的磷酸钙颗粒为纳米级球形磷酸钙，直径为20-50nm。结合X射线衍射和傅里叶红外光谱图可知该纳米颗粒主要晶型为羟基磷灰石。

纳米羟基磷灰石的体外降解实验，是通过将同等质量的纳米羟基磷灰石分别置于pH为5.6、6.5和7.4的PBS体系中，观察其累积降解效果，结果见图5。由图可知，该纳米羟基磷灰石在偏酸性的类溶酶体环境下极易发生降解。

纳米羟基磷灰石的毒性分析，是通过制备不同浓度的纳米羟基磷灰石对胰腺正常细胞系H6C7和胰腺癌细胞系PANC-1的存活率影响来实现，结果见图6。从图中可发现，纳米羟基磷灰石对正常细胞和癌细胞都不存在明显毒性。

实施例2：纳米羟基磷灰石-siRNA复合物载药量分析

分别将2μgRNA加入到2,4,8,12,16,20,24μg纳米羟基磷灰石中，吹打10次混匀后静置20min。将样品全部加入到琼脂糖凝胶孔中，以单纯RNA为对照，设置电压为125V。使用基因凝胶成像系统获得图片7。从图7中可看出，12μg凝胶孔中有微弱条带，16μg凝胶孔已无明显条带，说明纳米羟基磷灰石的RNA的负载率不低于8:1。

实施例3：纳米羟基磷灰石对癌细胞的转染作用。

以胰腺癌细胞系PANC-1作为转染细胞，将PANC-1(2×10⁴/孔)载种到6孔板中，24小时后更换新鲜培养基，分别将HAp/siRNA-FAM、DEPC水/siRNA-FAM、和商业siRNA转染试剂siRNA-Mate/siRNA-FAM加入到相应孔中，通过荧光显微镜观察转染效率。将图8(a)、图8(b)、图8(c)对比可知，纳米羟基磷灰石对siRNA的转染效率已非常接近商业转染试剂，说明实施例1中制备的纳米纳米羟基磷灰石具有优异的siRNA转染能力。

Claims

1.纳米羟基磷灰石-siRNA复合物，其特征在于所述复合物是由纳米羟基磷灰石和siRNA组成，所述纳米羟基磷灰石为球形，分散性良好，直径为20～50nm。纳米羟基磷灰石表层由聚乙烯亚胺覆盖，Zeta电位为+13.22±0.5mV。

2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物，其特征在于所述羟基磷灰石表层聚乙烯亚胺分子量为8～120kDa。

3.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物，其特征在于所述的siRNA的靶向基因为ras癌基因家族、sis癌基因家族、myc癌基因家族中的一种。

4.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物，其特征在于所述的siRNA可用FAM、Cy3、Cy5荧光染料中的一种标记。

5.一种如权利要求1所述的纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在15～35℃的反应温度下，将等体积磷酸盐溶液滴加到钙盐溶液中，以200～400rpm的速度均匀搅拌，利用浓氨水调节pH至10～13，滴加完成后持续搅拌0.5～2h；

2)在上述反应体系中缓慢滴加聚乙二醇溶液，其滴加量为钙盐体积的0.005～0.01倍，滴加完成后持续搅拌3～6h，搅拌速度为200～400rpm，维持反应体系的pH＝10～13；

3)在上述反应体系中缓慢滴加聚乙烯亚胺溶液，其滴加量为钙盐体积的0.005～0.01倍，滴加完成后持续搅拌2～12h，搅拌速度为200～400rpm，维持反应体系的pH＝10～13；

4)反应完成后，8000～15000rpm离心3～5min，分离沉淀，将沉淀分别用去离子水、无水乙醇超声清洗3次，然后将清洗后样品置于37℃～70℃烘箱干燥，得到羟基磷灰石纳米颗粒；

5)将步骤4)得到的羟基磷灰石纳米颗粒紫外灭菌0～24h后以DEPC水重悬、超声，得到羟基磷灰石悬液；

6)将步骤5)得到的羟基磷灰石悬液与siRNA按质量比1:1～20:1进行混合并吹打，20℃静置5～30min，即得到纳米羟基磷灰石-siRNA复合物。

6.根据权利要求5所述的一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤1)中的钙盐溶液为Ca(NO₃)₂、CaCl₂水溶液，优选Ca(NO₃)₂溶液，终浓度为1～10mmol/L，优选3.0mmol/L；磷酸盐溶液为Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、(NH₄)₂HPO₄水溶液，优选为(NH₄)₂HPO₄水溶液，终浓度为1～5mmol/L，优选1.8mol/L。

7.根据权利要求5所述的一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤2)中的聚乙二醇为PEG-400。

8.根据权利要求5所述的一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的聚乙烯亚胺溶液浓度为1～100mg/mL，优选为10mg/mL。